劉志棟，韓德權(quán)，楊衛(wèi)衛(wèi)，李雪茹，邵淑雙，孫慶申

熒光光譜法研究牛血清白蛋白與檸檬黃和日落黃的相互作用

劉志棟，韓德權(quán)，楊衛(wèi)衛(wèi)，李雪茹，邵淑雙，孫慶申*

（黑龍江大學生命科學學院，黑龍江省微生物高校重點實驗室，教育部農(nóng)業(yè)微生物工程中心，黑龍江 哈爾濱 150080）

用紫外-可見光吸收光譜、熒光發(fā)射光譜法研究牛血清白蛋白與檸檬黃和日落黃之間的相互作用；用Stern-Volmer方程處理實驗數(shù)據(jù)，得到310 K時的動態(tài)猝滅速率常數(shù)（KQ）分別為2.51×105L/mol和1.42×105L/mol；用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)函數(shù)方程處理實驗數(shù)據(jù)，得到310 K時靜態(tài)猝滅常數(shù)（KLB）依次為5.79×105L/mol和5.56×105L/mol；用lg（（F0－F）/F）=lgK0+nlgρ處理實驗數(shù)據(jù)，得到結(jié)合位點數(shù)（n）分別為0.556 95、0.640 56。并且兩種色素在質(zhì)量濃度為0～3 μg/mL范圍內(nèi)其含量與熒光猝滅強度具有良好的線性關(guān)系。

牛血清白蛋白；檸檬黃；日落黃；熒光猝滅

牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）是用于研究熒光猝滅過程最常用的模型蛋白之一[1-4]，研究小分子物質(zhì)與BSA的色氨酸或者酪氨酸相互作用導致這些氨基酸周圍環(huán)境發(fā)生改變，從而引發(fā)蛋白質(zhì)的熒光強度發(fā)生改變，借此來探討小分子物質(zhì)對蛋白質(zhì)的熒光猝滅機制，并對小分子物質(zhì)進行定量分析具有重要的理論及應用價值[4-8]。食用人工合成類色素物質(zhì)與人類的生活息息相關(guān)[9-10]，其中檸檬黃、日落黃等色素經(jīng)常被添加到飲料中，這些物質(zhì)添加過量會對身體造成傷害，因此研究這些色素與BSA之間相互作用的機理，并進一步建立色素與BSA的定量關(guān)系，有望為國家有關(guān)職能部門完成對飲料市場中色素含量的監(jiān)測提供一種參考方法，并且為國家相關(guān)職能部門制定食品中色素類物質(zhì)的添加標準提供理論參考，以便完成飲料中色素含量的快速檢測。

熒光光譜分析法具有高靈敏度、高準確度和高選擇性的特點[9]，應用熒光光譜分析進行食品色素檢測，可提高檢測水平，為食品工業(yè)生產(chǎn)和食品安全監(jiān)管提供幫助。本實驗用紫外-可見光吸收光譜、熒光發(fā)射光譜研究了BSA與檸檬黃、日落黃的相互作用，初步建立了兩種色素與牛血清白蛋白作用的線性方程關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

牛血清白蛋白（儲備液質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL，使用時稀釋成0.01 mg/mL）、檸檬黃與日落黃（儲備液質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL，使用時稀釋成0.01 mg/mL） 上?？笊锛夹g(shù)有限公司；實驗用水為二次蒸餾水。

RF-5301型熒光分光光度計、UV-2550型可見-紫外分光光度計 日本島津公司。

1.2 方法

用移液器移取1.0 mL質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的BSA、檸檬黃、日落黃溶液分別于3 支10 mL的具塞比色管中，用二次蒸餾水定容至10 mL。37 ℃水浴20 min，取出后迅速進行紫外-可見光譜檢測。掃描范圍250～600 nm，采樣間隔1 nm，掃描速度：Super，靈敏度：High，響應時間：Auto，記錄紫外-可見吸收光譜。

用移液器移取1.0 mL質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的BSA溶液于10 mL的具塞比色管中，加入一定量的檸檬黃、日落黃色素溶液，用二次蒸餾水定容至10 mL。37 ℃水浴20 min，取出后迅速進行熒光光譜檢測。固定激發(fā)波長283 nm，掃描發(fā)射波長300～400 nm，熒光發(fā)射與激發(fā)狹縫寬度均為5 nm[1,5,7-8]，記錄其熒光發(fā)射光譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳激發(fā)波長的選取

圖1 2 mg/mL BSA紫外-可見光吸收掃描光譜圖Fig.1 UV-visible absorption spectrum of 2 mg/mL BSA

圖2 0.01 mg/mL檸檬黃紫外-可見光吸收掃描光譜圖Fig.2 UV-visible absorption spectrum of 0.01 mg/mL lemon yellow

由圖1～3可知，牛血清白蛋白、檸檬黃、日落黃的最佳吸收波長依次為283、482、428 nm。上述物質(zhì)雖然最佳吸收波長不同，但是就整個光譜而言還是存在著很大程度的光譜疊加，因而不同波長條件下檢測這兩種色素含量的方法使用就會受到限制。通過本部分實驗，可以初步了解被測試物的質(zhì)量濃度與其吸光度A之間的關(guān)系；由于熒光光譜法的靈敏度是紫外吸收光譜法的100 倍左右，也為后期熒光猝滅光譜實驗條件的選擇提供了指導。此外，為了更好的研究色素質(zhì)量濃度與BSA內(nèi)源性熒光的猝滅關(guān)系，選取BSA的最佳激發(fā)波長283 nm作為后續(xù)實驗的測試條件。

圖3 0.01 mg/mL日落黃紫外-可見光吸收掃描光譜Fig.3 UV-visible absorption spectrum of 0.01 mg/mL sunset yellow

2.2 動態(tài)猝滅速率常數(shù)（KQ）的計算

動態(tài)猝滅遵循Stern-Volmer方程F0/F=1＋KSVρ= 1＋KQτ0ρ[11-12]，式中：F0與F分別表示猝滅劑存在前后熒光分子的熒光強度；KSV表示動態(tài)猝滅常數(shù)；KQ表示動態(tài)猝滅速率常數(shù)；τ0為生物大分子的熒光壽命，約為10-8s[13]；ρ為猝滅劑即檸檬黃、日落黃的質(zhì)量濃度/（μg/mL）。假設(shè)圖4、5所示的熒光猝滅現(xiàn)象是分子碰撞引起的動態(tài)猝滅，按Stern-Volmer方程，以（F0/F）-ρ作出該體系的Stern-Volmer曲線，見圖6，動態(tài)猝滅相關(guān)參數(shù)見表1。

圖4 檸檬黃對BSA的熒光猝滅光譜圖Fig.4 Fluorescence quenching spectra of lemon yellow against BSA

圖5 日落黃對BSA的熒光猝滅光譜圖Fig.5 Fluorescence quenching spectra of sunset yellow against BSA

圖6 不同色素對BSA的動態(tài)猝滅曲線Fig.6 Dynamic quenching curves of BSA in the presence of different pigments

表1 動態(tài)猝滅相關(guān)參數(shù)Table 1 Dynamic quenching equation parameters

由表1可知，在310 K條件下KQ依次為 2.51×1013、1.42×1013L/（mol·s）。由于各類猝滅劑對生物大分子的最大擴散碰撞猝滅速率常數(shù)為2.0×1010L/（mol·s）[14]，顯然，檸檬黃、日落黃對BSA熒光猝滅速率常數(shù)KQ遠大于這一值，可見動態(tài)碰撞猝滅不是該體系的主要猝滅原因，即各類色素對BSA內(nèi)源性熒光猝滅的主要原因不是分子間的碰撞引起的[15]。

2.3 靜態(tài)猝滅常數(shù)（KLB）的計算

若體系為靜態(tài)猝滅，靜態(tài)猝滅可用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)函數(shù)1/（F0－F）=1/F0＋1/KLBF0ρ[16-17]，式中：F0為BSA本身的熒光強度；F為添加不同質(zhì)量濃度檸檬黃、日落黃后BSA的熒光強度；KLB為靜態(tài)猝滅常數(shù)；ρ為猝滅劑即檸檬黃、日落黃的質(zhì)量濃度/（μg/mL）。由實驗數(shù)據(jù)以（F0/（F0－F））－1-1/ρ作圖得到310 K的條件下Lineweaver-Burk雙倒數(shù)函數(shù)曲線（圖7），其線性方程及相關(guān)參數(shù)見表2。

圖7 不同色素對BSA的靜態(tài)猝滅曲線Fig.7 Static quenching curves of BSA in the presence of different pigments

表2 靜態(tài)猝滅相關(guān)參數(shù)Table 2 Static quenching equation parameters

綜合考慮動態(tài)、靜態(tài)擬合方程的相關(guān)系數(shù)及由其計算得到的反應速率常數(shù)，可知實驗數(shù)據(jù)的擬合更適合于靜態(tài)方程，即該體系更符合熒光靜態(tài)猝滅規(guī)律，各類色素對BSA的熒光猝滅的原因是二者之間形成了絡(luò)合物或復配物[18]。

2.4 結(jié)合位點數(shù)n值的計算

有機小分子與蛋白質(zhì)等生物大分子相互作用的結(jié)合位點數(shù)可由lg（（F0－F）/F）=lgK0＋nlgρ計算。式中：F0、F分別為未加入和加入猝滅劑后熒光物質(zhì)的熒光強度；K0為猝滅反應的表觀結(jié)合常數(shù)；n為結(jié)合位點數(shù)；ρ為檸檬黃、日落黃的質(zhì)量濃度/（μg/mL）。由實驗數(shù)據(jù)，繪制的BSA與檸檬黃、日落黃的lg（（F0－F）/F）-lgρ的曲線見圖8、9。

圖8 檸檬黃與BSA作用的lg（（F0－F）//F）--llggρ圖Fig.8 lg((F0－F)/F) vs. lgρ graph describing the interaction between lemon yellow and BSA

圖9 日落黃與BSA作用的lg（（F0－F）//F）--llggρ圖Fig.9 lg((F0－F)/F) vs. lgρ graph describing the interaction between sunset yellow and BSA

由實驗數(shù)據(jù)計算出圖8、9中直線的斜率，依次為0.556 95、0.640 56，即1個BSA分子可以與1個檸檬黃分子結(jié)合或者1個日落黃分子結(jié)合。

3 結(jié) 論

通過在310 K條件下，考察檸檬黃、日落黃對BSA有的熒光猝滅作用機制可知，兩種色素分子與BSA之間存在靜態(tài)猝滅過程，并且當色素質(zhì)量濃度分別在0～3 μg/mL時擬和強度較好。

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Interactions of Bovine Serum Albumin with Lemon Yellow and Sunset Yellow Studied by Fluorescence Spectroscopy

LIU Zhi-dong, HAN De-quan, YANG Wei-wei, LI Xue-ru, SHAO Shu-shuang, SUN Qing-shen*
(Key Laboratory of Microbiology of Heilongjiang Province, Engineering Research Center of Agricultural Microbiology Technology, Ministry of Education, College of Life Science, Heilongjiang University, Harbin 150080, China)

Interactions between bovine serum albumin (BSA) and lemon yellow or sunset yellow were studied by UV-visible absorption spectroscopy and fluorescence emission spectroscopy. The dynamic quenching rate constants at 310 K were calculated according to Stern-Volmer equation to be 2.51 × 105and 1.42 × 105L/mol for lemon yellow and sunset yellow, respectively. The static quenching constants at 310 K were calculated according to Lineweaver-Burk double-reciprocal equation to be 5.79 × 105and 5.56 × 105L/mol, respectively. The number of binding sites at 310 K was calculated according to lg((F0－F)/F)=lgK0+nlgρ to be 0.556 95 and 0.640 56, respectively. A good linear relationship was observed between lemon yellow or sunset yellow concentration in the range of 0 – 3 μg/mL and fluorescence quenching intensity.

bovine serum albumin; lemon yellow; sunset yellow; fluorescence quenching

TS201.6

A

1002-6630（2014）09-0128-04

10.7506/spkx1002-6630-201409026

2013-07-03

黑龍江省教育廳面上項目（11551360）；國家自然科學基金青年科學基金項目（31000773）

劉志棟（1989—），男，碩士研究生，研究方向為食品加工與安全。E-mail：744063752@qq.com

*通信作者：孫慶申（1977—），男，副教授，博士，研究方向為功能保健食品，食品加工與安全。E-mail：kejiansqs@163.com