曾凡逵，劉 剛

馬鈴薯蛋白的分離及氨基酸組成分析

曾凡逵，劉 剛*

（中國(guó)科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所，環(huán)境材料與生態(tài)化學(xué)研究發(fā)展中心，甘肅 蘭州 730000）

為了從馬鈴薯淀粉加工分離汁水中回收具有天然活性的蛋白，以Amberlite XAD7HP樹脂作為吸附劑對(duì)擴(kuò)張床吸附進(jìn)行研究，并分析回收蛋白的氨基酸組成。結(jié)果表明：XAD7HP可以實(shí)現(xiàn)Patatin蛋白和蛋白酶抑制劑的分離，分離到的馬 鈴薯蛋白酶抑制劑的胰蛋白酶抑制活力為410 mg/g?；厥盏鸟R鈴薯蛋白酶抑制劑Ser、Leu、Glu的含量分別為13.2、9.14、8.14 g/100 g，且必需氨基酸占總氨基酸的40.80%，疏水氨基酸Ile、Leu、Val、Phe和Tyr的含量也比較高。

馬鈴薯；天然蛋白；蛋白酶抑制劑；氨基酸組成

馬鈴薯塊莖中可溶性蛋白分成三大類：Patatin蛋白、蛋白酶抑制劑和其他蛋白[1]。馬鈴薯蛋白酶抑制劑（potato protein inhibitor，PPI）可分為五大類[2-7]，這些蛋白分子質(zhì)量較?。?～25 kD）。在Elkana品種馬鈴薯中，PPI約占總可溶性蛋白的一半[8]。

PPI有很多潛在的應(yīng)用價(jià)值：Hu等[9]報(bào)道了PPI可提高血漿中膽囊收縮素的含量，膽囊收縮素能延緩胃的排空，控制人體血糖濃度，通過飽腹感來減少食物的攝入以達(dá)到減肥效果。Wang等[10]通過老鼠實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了PPI具有抗血栓活性，Blanco-Aparicio等[11]報(bào)道了PPI可干擾腫瘤細(xì)胞增殖而具有抗腫瘤作用。Huang等[12]報(bào)道了PPI還可預(yù)防太陽光紫外線對(duì)人體皮膚的傷害，因此可用于研制新型護(hù)膚品。

馬鈴薯淀粉加工分離汁水（potato fruit water，PFW）是從馬鈴薯淀粉加工生產(chǎn)線上的水力旋流器（或者叫旋流站）分離出來的汁水，PFW約含有1.5%蛋白，傳統(tǒng)酸熱絮凝法回收的馬鈴薯蛋白存在的主要問題是蛋白已發(fā)生不可逆變性，回收的蛋白不可溶，起泡性、乳化性和酶活性全部喪失[8]，導(dǎo)致其在食品和制藥行業(yè)的應(yīng)用受到限制。近年來，回收具有天然活性的食品級(jí)（藥品級(jí)）可溶性馬鈴薯蛋白是馬鈴薯加工研究的熱點(diǎn)[8,13-14]。齊斌等[15]采用鹽溶堿提酸沉法制備了馬鈴薯分離蛋白，并通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）對(duì)蛋白亞基的分子質(zhì)量進(jìn)行了分析，驗(yàn)證了馬鈴薯蛋白含有多個(gè)不同蛋白組分；崔竹梅等[16]采用透析與等電點(diǎn)沉淀相結(jié)合的工藝方法提取分離馬鈴薯塊莖蛋白，并對(duì)其理化性質(zhì)和功能性質(zhì)進(jìn)行了檢測(cè)。

擴(kuò)張床吸附（expanded bed adsorption，EBA）是1992年由劍橋大學(xué)Chase等[17]教授發(fā)展起來的，是一種經(jīng)過精心設(shè)計(jì)的、穩(wěn)定的、返混很少的離子交換層析技術(shù)，把澄清、濃縮和純化集成于一個(gè)單元操作中，減少了操作步驟，提高了產(chǎn)品收率，減少了純化費(fèi)用和資本投入，被譽(yù)為近幾十年來出現(xiàn)的第一個(gè)新的單元操作[18]。Giuseppin等[19]對(duì)EBA回收具有天然活性的馬鈴薯蛋白進(jìn)行了研究，回收的產(chǎn)品主要是Patatin蛋白。自1999年以來，Str?tkvern[20-22]、L?kra[23-24]等發(fā)表了一系列擴(kuò)張床吸附回收天然馬鈴薯蛋白的報(bào)道，他們的研究目的主要是回收Patatin蛋白用于食品加工領(lǐng)域。

填料對(duì)EBA回收馬鈴薯蛋白具有非常重要的影響，Amberlite XAD7HP既可以從水溶液體系中吸附非極性物質(zhì)，也可以從非極性溶劑體系中吸附極性物質(zhì)。未見Amberlite XAD7HP樹脂從馬鈴薯淀粉加工分離汁水中回收蛋白的相關(guān)報(bào)道。本研究擬采用Amberlite XAD7HP樹脂作為吸附劑通過EBA技術(shù)從馬鈴薯淀粉加工分離汁水中回收具有天然活性的蛋白，并對(duì)回收蛋白的氨基酸組成進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬鈴薯淀粉加工分離汁水由甘肅薯界集團(tuán)提供，使用前用稀鹽酸調(diào)pH 5.0；Amberlite XAD7HP樹脂、豬胰蛋白酶、Nα-苯甲酰-DL-精氨酸-4-硝基苯胺鹽酸鹽 美國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

層析柱（16 mm×400 mm） 上海錦華層析設(shè)備廠；Vivaflow 200超濾膜包（膜面積為200 cm2，蛋白分子截留量為10 kD） 德國(guó)賽多利斯公司；YZ-2512型蠕動(dòng)泵 天利（中國(guó)）流體技術(shù)有限公司；DYCZ-24DN型迷你雙垂直電泳儀（配置DYY-6C型電泳儀電源） 北京六一儀器廠；SKD-100型凱氏定氮儀 上海沛歐分析儀器有限公司；FD-1A-50冷凍干燥機(jī) 上海比朗公司；V30型Karl Fischer水分滴定儀 Mettler-Toledo公司；A3000-IC高精密度多功能自動(dòng)氨基酸分析儀 德國(guó)安米諾希思公司。

1.3 方法

1.3.1 EBA色譜

擴(kuò)張床吸附色譜的操作參考Str?tkvern等[20]報(bào)道的方法，但以Amberlite XAD7HP樹脂為吸附劑。裝置簡(jiǎn)圖如圖1所示，樹脂用量為40 mL，使用前先用乙醇和去離子水清洗。將樹脂裝入層析柱，用5 倍柱體積20 mmol/L的檸檬酸緩沖液（pH 5.0）平衡層析柱（自下而上），將1 L調(diào)好pH值的馬鈴薯淀粉加工分離汁水泵入到層析柱（自下而上），再用500 mL平衡液清洗柱子（自下而上），用500 mL 50 mmol/L的NaOH溶液將吸附在XAD7HP樹脂上的蛋白洗脫下來（自上而下），洗脫液用稀鹽酸調(diào)成pH 7.0。

圖1 EBA實(shí)驗(yàn)裝置示意圖Fig.1 Schematic diagram of the EBA

1.3.2 超濾濃縮

將超濾膜包和蠕動(dòng)泵用L/STM16#硅膠管連接起來進(jìn)行超濾濃縮，濃縮比為5（從500 mL濃縮到100 mL）。濃縮到終體積以后再用20 倍體積的蒸餾水進(jìn)行等體積透析，最后將100 mL殘留液凍干。

1.3.3 SDS-PAGE分析

采用5%濃縮膠和12%分離膠，將蛋白溶液與2×上樣緩沖液混合后95 ℃加熱5 min后上樣，濃縮膠電壓為80 V，分離膠電壓為120 V，采用考馬斯亮藍(lán)進(jìn)行染色。

1.3.4 胰蛋白酶抑制活力

胰蛋白酶抑制劑活力根據(jù)Pouvreau等[23]報(bào)道的方法進(jìn)行測(cè)定，以Nα-苯甲酰-DL-精氨酸-4-硝基苯胺鹽酸鹽為底物，在添加或不添加蛋白酶抑制劑的情況下測(cè)定豬胰蛋白酶水解底物的活力，計(jì)算蛋白酶抑制劑的抑制活力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果取3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值。

1.3.5 蛋白質(zhì)含量測(cè)定

根據(jù)GB/T 5511－2008《谷物和豆類 氮含量測(cè)定和粗蛋白質(zhì)含量計(jì)算 凱氏法》對(duì)凍干馬鈴薯蛋白粉的蛋白含量進(jìn)行測(cè)定，氮換算成蛋白質(zhì)含量的換算系數(shù)為6.25。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.3.6 水分含量測(cè)定

采用Karl Fisher滴定法，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.3.7 氨基酸的測(cè)定

委托珠海出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心依據(jù)GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的測(cè)定》對(duì)凍干蛋白粉的氨基酸組成進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶抑制劑鑒定結(jié)果

由圖2可知，洗脫液和超濾濃縮液以蛋白酶抑制劑為主，用XAD7HP樹脂作為吸附劑通過EBA技術(shù)基本實(shí)現(xiàn)了Patatin蛋白和蛋白酶抑制劑的分離。馬鈴薯淀粉加工分離汁水中可溶性的蛋白主要由Patatin蛋白和蛋白酶抑制劑組成，Patatin蛋白的分子質(zhì)量大約為41 kD，蛋白酶抑制劑包含多個(gè)蛋白組分，亞基分子質(zhì)量從5 kD到25 kD不等。

圖2 馬鈴薯蛋白酶抑制劑SDS-PAGE圖譜Fig.2 SDS-PAGE of potato protein inhibitors

凱氏定氮法測(cè)定回收馬鈴薯蛋白的粗蛋白含量為（88.7±0.1）%，水分含量為（4.6±0.0）%。Patatin蛋白和蛋白酶抑制劑是兩類性質(zhì)和作用完全不同的蛋白，將Patatin蛋白和蛋白酶抑制劑進(jìn)行分離具有十分重要的意義[8]。

馬鈴薯蛋白酶抑制劑種類繁多，到目前為止，編碼馬鈴薯蛋白酶抑制劑的核苷酸序列已公布了100多種（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）。馬鈴薯蛋白酶抑制劑對(duì)絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶都具有抑制活力，含量最高的為絲氨酸蛋白酶抑制劑[25]。豬胰蛋白酶屬于絲氨酸蛋白酶，可以通過抑制豬胰蛋白酶水解合成底物的活力來分析回收蛋白酶抑制劑的活力。為了驗(yàn)證本研究回收的馬鈴薯蛋白為蛋白酶抑制劑，對(duì)回收蛋白抑制豬胰蛋白酶水解Nα-苯甲酰-DL-精氨酸-4-硝基苯胺鹽酸鹽的活力進(jìn)行了分析，結(jié)果為（410±12）mg/g，即每克蛋白酶抑制劑可抑制410 mg豬胰蛋白酶。

2.2 氨基酸分析結(jié)果

圖3 馬鈴薯蛋白酶抑制劑氨基酸分離圖譜Fig.3 Chromatogram of amino acids from potato protease inhibitors

由圖3可知，各種氨基酸實(shí)現(xiàn)了較好的分離?；厥振R鈴薯蛋白酶抑制劑的氨基酸組成及含量見表1。Ser含量最高（13.2 g/100 g），其次為L(zhǎng)eu（9.14 g/100 g）、Glu（8.14 g/100 g），其中Leu為必需氨基酸；其他必需氨基酸含量較高的有Lys（6.14 g/100 g）、Phe（6.05 g/100 g）、Val（5.54 g/100 g）、Thr（4.96 g/100 g）和Ile（4.29 g/100 g），必需氨基酸占總氨基酸的40.80%。Try含量未檢測(cè)出來，加上Try，回收的蛋白必需氨基酸含量會(huì)更高。回收的馬鈴薯蛋白疏水氨基酸含量比較高，特別是帶有支鏈的Ile、Leu、Val和帶有芳香環(huán)的Phe、Tyr，與Singh 等[8]報(bào)道的結(jié)果一致。

表1 馬鈴薯蛋白酶抑制劑氨基酸含量

Table 1 Amino acid contents of potato protein inhibitors

氨基酸含量/（g/100 g）丙氨酸 （Ala）2.93苯丙氨酸（Phe）6.05蛋氨酸（Met） 0.73脯氨酸（Pro） 4.61甘氨酸（Gly）5.4谷氨酸（Glu）8.54精氨酸（Arg） 3.87賴氨酸（Lys） 6.14酪氨酸（Tyr） 5.44亮氨酸（Leu） 9.14蘇氨酸（Thr） 4.96絲氨酸（Ser） 13.2天冬氨酸（Asp）6.41異亮氨酸（Ile） 4.29纈氨酸（Val） 5.54組氨酸（His） 3.12總氨基酸含量 90.37必需氨基酸占總氨基酸比例40.80%非必需氨基酸占總氨基酸比例59.20%必需氨基酸/非必需氨基酸0.69

3 結(jié) 論

以XAD7HP樹脂作為吸附劑通過EBA技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)Patatin蛋白和蛋白酶抑制劑的分離，分離到的馬鈴薯蛋白酶抑制劑的胰蛋白酶抑制活力為410 mg/g?；厥振R鈴薯蛋白酶抑制劑氨基酸含量較高的包括Ser、Leu、Glu，必需氨基酸占總氨基酸的40.80%。馬鈴薯蛋白酶抑制劑的疏水氨基酸Ile、Leu、Val、Phe和Tyr的含量也比較高。這種具有生物活性的馬鈴薯蛋白有望用于食品和制藥行業(yè)。

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Isolation and Amino Acid Analysis of Potato Protein

ZENG Fan-kui, LIU Gang*
(Research and Development Center for Eco-material and Eco-chemistry, Lanzhou Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Sciences, Lanzhou 730000, China)

Bioactive proteins were recovered from a liquid byp roduct containing roughly 1.5% protein, with approximately 50% being protease inhibitors by expanded bed adsorption using macroporous resin Amberlite XAD7HP. The recovered proteins were analyzed for amino acid composition. The results indicated that XAD7HP allowed the separation between protease inhibitors and patatin. The protease inhibitors exhibited an activity of 410 mg/g against trypsin and contained Ser, Leu and Glu at 3.2, 9.14 and 8.14 g/100 g, respectively, with the ratio of essential to total amino acids being 40.80%. Similarly, hydrophobic amino acids, Ile, Leu, Val, Phe and Tyr, were present in relatively higher quantities in these protease inhibitors.

potato; native protein; protease inhibitor; amino acid composition

TS209

A

1002-6630（2014）09-0053-04

10.7506/spkx1002-6630-201409012

2013-03-19

國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（馬鈴薯）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（nycytx-15）；國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31301532）

曾凡逵（1980—），男，副研究員，博士，研究方向?yàn)轳R鈴薯加工。E-mail：zengfk@licp.cas.cn

*通信作者：劉剛（1962—），男，研究員，博士，研究方向?yàn)轳R鈴薯加工。E-mail：gangliu@licp.cas.cn