雷 麗麻春杰楊喜平

（1內(nèi)蒙古自治區(qū)包頭市腫瘤醫(yī)院放療科，包頭，014030；2內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)教研室，呼和浩特，010020）

胃和沖劑II號對慢性萎縮性胃炎大鼠EGF和EGFR表達的影響

雷 麗1麻春杰2楊喜平2

（1內(nèi)蒙古自治區(qū)包頭市腫瘤醫(yī)院放療科，包頭，014030；2內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)教研室，呼和浩特，010020）

目的：觀察胃和沖劑Ⅱ號對CAG（Chronic Atrophic Gastritis，CAG）大鼠胃黏膜EGF和EGFR表達的影響，探討胃和沖劑Ⅱ號治療CAG的作用機制。方法：將72只雄性W istar大鼠隨機分為正常對照組12只和造模組60只。除正常對照組外，其余各組大鼠均使用綜合造模法成功復(fù)制CAG動物模型。然后將造模組分為5組，分別為模型組，維酶素對照組，胃和沖劑Ⅱ號低、中、高劑量組。對各組大鼠施加相應(yīng)治療因素60 d后，取各大鼠相同部位全層胃壁組織，采用免疫組化法分別檢測胃黏膜組織的EGF和EGFR的表達水平。結(jié)果：EGF在胃和沖劑Ⅱ號高劑量組中的表達值為（1.25±0.16），低于CAG大鼠模型組的表達值（2.98±0.15），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；胃和沖劑Ⅱ號高劑量組EGFR的表達值為（1.636±0.809），低于模型組的表達值（3.300±1.337），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論：胃和沖劑Ⅱ號可能通過降低胃黏膜組織的EGF和EGFR的表達，加快胃黏膜細胞的修復(fù)和抑制過度增殖，從而對CAG起到治療作用。

胃和沖劑Ⅱ號；慢性萎縮性胃炎；EGF；EGFR

表皮生長因子（Epidermal Growth Factor，EGF）是分子量為6 045道爾頓的多肽，主要由頜下腺、胰腺和小腸分泌，是參與胃黏膜損傷修復(fù)過程中最重要的肽類物質(zhì)。表皮生長因子受體（Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR）是正常上皮、間質(zhì)、神經(jīng)源性組織中表達的一類蛋白受體。當EGFR與其配體表皮生長因子結(jié)合后，一方面可以抑制胃酸分泌，促進胃黏膜細胞分泌前列腺素，保護胃黏膜[1-2]；另一方面對于細胞增殖、存活、黏附、轉(zhuǎn)移及血管發(fā)生都發(fā)揮著重要作用[3-4]。90%的惡性腫瘤特別是在上皮源性的腫瘤，其表皮生長因子受體與細胞的凋亡、增殖、分化、遷移及細胞周期循環(huán)關(guān)系密不可分，在良、惡性病變轉(zhuǎn)化過程中起著非常重要的作用。我們對表皮生長因子及其受體在慢性萎縮性胃炎中的表達及胃和沖劑II號的干預(yù)作用進行了研究。

1 材料與方法

1.1 設(shè)計 隨機對照動物實驗。

1.2 材料 雄性Wistar大鼠72只，體重（180± 20）g，內(nèi)蒙古大學(xué)實驗動物研究中心提供。合格證號：SCXK（蒙）2002-0001。

1.3 試劑和儀器 大鼠表皮生長因子（EGF）酶聯(lián)免疫分析（ELISA）試劑盒，由美國ADLITTERAM DIAG-NOSTICLABORATORIES公司提供，標號：RT110371。鼠抗人上皮生長因子受體免疫組化單克隆抗體，福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，批號：100803196A。DAB顯色試劑盒，福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，批號：100907414E。S-P超敏試劑盒，福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，批號：10083197201。電熱恒溫箱XMT-152A；冰箱伊萊克斯BCD-263；壓力鍋AS18-35-80；電熱恒溫水槽cataNo.0415-21466c；組織切片機德國萊卡RM2235；光學(xué)顯微鏡OLYMPUSBX41；酶聯(lián)免疫檢測儀DG3022A型國營華東電子管廠制造；醫(yī)用圖像分析系統(tǒng)LOGENE-1（朗珈）。25%氨水，天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.4 方法

1.4.1 實驗藥物 胃和沖劑II號：半夏、黨參、干姜、黃連、黃芩、丹參等組成，制成袋裝，每袋12g，由內(nèi)蒙古中蒙醫(yī)院國家蒙藥制劑中心提供，批號：20061001。維酶素片，河北環(huán)海藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號：20070609。

1.4.2 動物模型的復(fù)制 將72只Wistar大鼠隨機分為正常對照組12只和造模組60只，按照《中藥藥理實驗方法學(xué)》給大鼠1%氨水為飲料自由飲用[5]，同時熱鹽水（55℃，150g/L氯化鈉）灌胃[6]，1次/d，每次2.5 mL，并結(jié)合饑飽失常（2d足食，1d禁食）。造模90d，經(jīng)病理形態(tài)學(xué)確定成功后，將CAG大鼠再隨機分為模型組、胃和沖劑II號低劑量組、胃和沖劑II號中劑量組、胃和沖劑II號高劑量組和維酶素陽性對照組。對照組大鼠每日灌服蒸餾水2.5mL。

1.4.3 給藥方法 對照組：每日按10mL/kg大鼠體重灌服蒸餾水；模型組：每日按10mL/kg大鼠體重灌服蒸餾水；胃和沖劑II號低、中、高劑量組：給藥劑量分別為2g/kg、4g/kg、8g/kg大鼠體重；維酶素組：按0.5g/kg大鼠體重給藥。連續(xù)灌胃給藥60d。

1.4.4 指標檢測 實驗結(jié)束，處死大鼠，取胃，用電子天平在腺胃部稱取0.5g胃組織，眼科小剪刀盡快剪碎，置于勻漿器中，加入9倍量的冰生理鹽水，用勻漿器制成10%的組織勻漿（勻漿器的末端置于放冰塊的冷水中），3500r/min離心15min，取上清液置4℃冰箱保存，按大鼠表皮生長因子（EGF）ELISA試劑盒說明書要求在酶聯(lián)免疫檢測儀上檢測EGF的含量；取各大鼠相同部位（沿胃小彎自前胃至幽門取全層胃壁1塊（3mm×20mm）的胃組織條塊固定在10%中性甲醛液中作常規(guī)的石蠟切片、HE染色等以觀察病理組織變化及進行免疫組化，檢測EGFR表達情況。

1.5 主要觀察指標 各組大鼠胃黏膜組織表皮生長因子含量、表皮生長因子受體的表達量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)分析采用統(tǒng)計軟件SPSS 16.0。數(shù)據(jù)以（±s）表示，組間差異采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實驗動物數(shù)量分析納入大鼠72只，于造模過程中死亡1只，造模結(jié)束后抽樣處死7只，64只進入結(jié)果分析。

2.2 免疫組化染色、圖像分析采用雙盲法進行觀察，EGFR結(jié)果判斷標準：陽性信號主要定位于細胞膜。根據(jù)染色反映的深度及陽性細胞的數(shù)量判斷，按經(jīng)典免疫組化評分標準進行評分，高倍鏡下選擇5個有代表性視野，出現(xiàn)黃色顆粒為陽性染色，將染色強度分為4級：無黃色顆粒為0級，計0分；淡黃色顆粒為1級，計1分；黃色顆粒為2級，計2分；棕色顆粒為3級，計3分。將細胞染色陽性百分比分為4級：陽性細胞數(shù)＜25%為（-），26%～49%為（+），50%～75%為（+ +），＞75%為（+++），分別計為0～3分。兩者評分相加為最終評分。

2.3 通過檢測各組大鼠胃組織EGF的含量，結(jié)果顯示：與正常組相比，各造模組CAG大鼠胃組織EGF的含量顯著升高（P＜0.01）；而給藥干預(yù)各組大鼠胃組織的EGF的含量較模型組降低（P＞0.05），特別是胃和沖劑高劑量組大鼠胃黏膜組織中的EGF含量降低明顯（P＜0.01）。具體數(shù)據(jù)見表1。

表1 胃和沖劑II號對大鼠胃黏膜EGF含量的影響

表2 胃和沖劑II號對大鼠胃黏膜EGFR蛋白表達的影響

2.4 通過測定不同組的CAG大鼠胃黏膜組織EGFR表達情況，發(fā)現(xiàn)與對照組大鼠相比，模型組大鼠胃黏膜組織中的EGFR蛋白表達明顯升高（P＜0.01）；與模型組大鼠相比，胃和沖劑高劑量組大鼠胃黏膜組織中的EGFR蛋白表達明顯降低（P＜0.01），中劑量組大鼠胃黏膜組織中的EGFR蛋白表達降低（P＜0.05）；與維酶素組相比胃和沖劑高劑量組的大鼠胃黏膜組織中EGFR蛋白表達降低（P＜0.05），中、低劑量組大鼠胃黏膜組織中的EGFR蛋白表達沒有差異（P＞0.05），具體數(shù)據(jù)見表2和圖1。

圖1 大鼠胃黏膜EGF免疫組化圖片（200×）

3 討論

慢性萎縮性胃炎是胃黏膜表面反復(fù)受到損害后導(dǎo)致的病變，表現(xiàn)為腺體萎縮、數(shù)量減少，胃黏膜變薄，或伴炎性反應(yīng)、腸上皮化生及不典型增生，易反復(fù)發(fā)作，臨床較難治愈，為胃癌癌前狀態(tài)之一，癌變率為2.55%～7.46%[7]。

表皮生長因子與其受體結(jié)合后可進一步激活STAT3及MAPK信號傳導(dǎo)通路，促進細胞增殖并抑制凋亡，在細胞增殖、存活、粘附、轉(zhuǎn)移及血管發(fā)生中起重要作用[8-9]。作為一個廣泛表達的基因，EGFR的突變和高表達在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起著非常重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)EGFR在非萎縮性胃炎組織中表達最低[10]，隨著病變逐漸進展至萎縮性胃炎、腸化生和異型增生，EGFR的表達將會持續(xù)增高，持續(xù)過度表達則有促進慢性萎縮性胃炎發(fā)展和癌變的危險[11-12]。因此EGFR被認為與促進正常細胞惡性轉(zhuǎn)化、刺激細胞無限增殖[13]最終導(dǎo)致胃癌發(fā)生有密切關(guān)系。

胃和沖劑Ⅱ號方由半夏、黨參、干姜、黃連、黃芩、炙甘草、大棗、丹參等組成，臨床中該方治療慢性胃炎具有良好效果[14]。前期研究表明，胃和沖劑Ⅱ號能夠明顯改善大鼠CAG病損程度，增加CAG大鼠胃竇黏膜腺體層厚度，降低胃竇黏膜肌層厚度，恢復(fù)萎縮的腺體，減輕炎癥反應(yīng)[15]，充分證實了胃和沖劑Ⅱ號對CAG大鼠的治療作用，并能提高CAG大鼠血清抗氧化酶活性等。

本實驗結(jié)果顯示：高、中劑量胃和沖劑Ⅱ號的療效顯著優(yōu)于維酶素；低劑量胃和沖劑Ⅱ號的療效與維酶素?zé)o顯著差異。中藥復(fù)方從多系統(tǒng)、多靶位的整體水平治療本病具有一定的優(yōu)越性。因此，可以推論：高、中劑量胃和沖劑II號通過降低EGF及其受體EGFR在胃黏膜的表達，抑制胃酸分泌，促進胃黏膜細胞分泌前列腺素，促進未成熟壁細胞向成熟壁細胞方向分化，從而保護胃黏膜，同時抑制細胞增殖、存活、粘附、轉(zhuǎn)移及血管發(fā)生，起到逆轉(zhuǎn)腸化或癌變的作用。

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（2013-05-16收稿 責(zé)任編輯：徐穎）

The Effect of W eihe G ranule II on the Expression Level of EGF and EGFR in CAG Rats

Lei Li1，Ma Chunjie2，Yang Xiping2
（1 Department of Radiation Oncology，Baotou Tumor Hospital，Baotou 014030，China；2 College of Traditional Chinesesmedicine，Inner Mongolia Medical University，Hohhot 010020，China）

Objective：To explore the treatment effect ofWeihe granule IIon CAG by analyzing the expression level of EGF and EGFR in gastricmucosal ofmodel rats of CAG treated with Weihe granule II.Methods：Seventy-twomale Wistar ratswere random ly divided into two groups，control group（n＝12）and model group（n＝60）.The ratmodel of CAG inmodel group was created using comprehensive modelingmethod.Then，all rats inmodel group were assigned into five sub-groups，namelymodel sub-group，Vitacoenzyme control subgroup，low-dose sub-group，mediate-dose sub-group and high-doseWeihe granule IIsub-groups.After all rats in each group were subjected to the corresponding treatments for 60 days，the expression level of EGF and EGFR in the same gastric tissue of each ratwere be examined and compared with other groups.Results：The expression of EGF in the high-doseWeihe granule IIsub-group（1.25±0.16）was lower than that in model sub-group（2.98±0.15），（P＜0.01）；the expression of EGFR，in the high-dose Weihe granule IIsubgroup（1.636±0.809）was lower than that inmodel sub-group（3.300±1.337）（P＜0.01）.Conclusion：Weihe granule IIcan treat CAG by decreasing the expression levels of EGF and EGFR in gastricmucosal to repair the gastricmucosal cells and inhibit the excessive proliferation for cancer prevention.

Weihe granule；Chronic atrophic gastritis；EGF；EGFR

R243；R573.3+2

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2014.01.029

內(nèi)蒙古衛(wèi)生廳醫(yī)療衛(wèi)生科研計劃項目（編號：2010022）

楊喜平，E-mail：529224683＠qq.com