陳 江 牟為民 邵曉東 王 迪 許文達(dá) 郭曉鐘

胰腺癌細(xì)胞總RNA轉(zhuǎn)染樹(shù)突細(xì)胞誘導(dǎo)特異性CTL能力的體外研究

陳 江1牟為民2邵曉東1王 迪1許文達(dá)1郭曉鐘1

目的觀察人胰腺癌M iaPaCa-2細(xì)胞總RNA電轉(zhuǎn)染樹(shù)突細(xì)胞(Dendritic Cell袁DC)體外激發(fā)抗—特異性細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(Cytotoxic T Lymphocyte,CTL)的能力遙方法自6例胰腺癌患者外周血單核細(xì)胞中分離、培養(yǎng)DC遙使用電穿孔法將M iaPaCa-2細(xì)胞總RNA體外轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增的MUC1 mRNA轉(zhuǎn)染DC袁以未負(fù)載抗—的DC為對(duì)照遙采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)各組DC中MUC1表達(dá)遙四甲基偶氮唑鹽(MTT)檢測(cè)轉(zhuǎn)染各組DC存活率變化曰混合細(xì)胞培養(yǎng)法評(píng)價(jià)各組DC體外刺激自體T淋巴細(xì)胞增殖能力曰ELISA法檢測(cè)各組DC體外激發(fā)抗—特異性CTL細(xì)胞因子釋放量遙結(jié)果M iaPaCa-2總RNA與MUC1mRNA分別轉(zhuǎn)染后48 h DC中目標(biāo)抗—的相對(duì)表達(dá)量分別為37.24依3.17和34.53依2.02袁兩者比較無(wú)顯著差異(P>0.05)遙電轉(zhuǎn)染后96 h MiaPaCa-2總RNA轉(zhuǎn)染組DC存活率降至60.81%袁低于MUC1mRNA單轉(zhuǎn)染時(shí)DC的存活率(80%左右)(P<0.05)遙轉(zhuǎn)染M iaPaCa-2總RNA DC刺激自體T細(xì)胞增殖指數(shù)為8 432依611.25袁顯著高于MUC1單獨(dú)轉(zhuǎn)染組3 664依305.17(P<0.05)曰且轉(zhuǎn)染M iaPaCa-2總RNA DC激發(fā)特異性CTL分泌IL-2、IL-10、Granzyme B、IFN-酌水平亦顯著高于MUC1mRNA單獨(dú)轉(zhuǎn)染組(P<0.05)遙結(jié)論胰腺癌腫瘤細(xì)胞總RNA轉(zhuǎn)染的DC較單一胰腺癌相關(guān)抗—負(fù)載DC有更強(qiáng)的體外抗—特異性CTL激發(fā)能力。

樹(shù)突細(xì)胞曰RNA轉(zhuǎn)染曰胰腺腫瘤曰細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞

胰腺癌是一種常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤袁多數(shù)病例在發(fā)現(xiàn)時(shí)已屬晚期袁手術(shù)治療及放、化療作用有限袁患者預(yù)后極差袁臨床迫切需要探索新的有效治療手段[1-2]遙近年來(lái)新興的腫瘤生物免疫治療技術(shù)對(duì)多種類(lèi)型腫瘤均有顯著的治療作用[3-5]袁樹(shù)突狀細(xì)胞(Dendritic cell,DC)是體內(nèi)功能最為強(qiáng)大的抗—遞呈細(xì)胞(antigen presenting cell,APS)袁能夠刺激并致敏栽淋巴細(xì)胞袁產(chǎn)生細(xì)胞毒性栽淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lynphocytes,CTLs)袁啟動(dòng)機(jī)體免疫應(yīng)答遙以DC為基礎(chǔ)構(gòu)建的腫瘤疫苗技術(shù)作為腫瘤生物治療的核心策略袁為胰腺癌的臨床治療開(kāi)辟了新的思路遙本研究將人胰腺癌M iaPaCa-2細(xì)胞總RNA電轉(zhuǎn)染DCs袁觀察其在體外誘導(dǎo)并激發(fā)抗—特異性CTL的能力袁為今后胰腺癌腫瘤細(xì)胞全抗—DC疫苗的開(kāi)發(fā)和臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)資料。

材料與方法

一、一般材料及試劑

篩選2012年6月至2014年3月期間沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院消化科收治的6例HLA-A2+晚期胰腺癌患者袁男性4例袁女性2例袁年齡35~65歲袁平均年齡50歲遙全部患者均經(jīng)組織病理學(xué)檢查(剖腹探查活檢4例袁細(xì)針穿刺活檢2例)證實(shí)為胰腺癌遙入選前未經(jīng)放、化療及免疫治療遙所有患者均簽署知情同意書(shū)袁并經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

人胰腺癌細(xì)胞株M iaPaCa-2(沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院消化科實(shí)驗(yàn)室)曰RPM I1640、小牛血清(Hyclone公司袁美國(guó))袁rhGM-CSF、rhIL4、TNF琢(PeproTec公司袁美國(guó))袁鼠抗人CD40、HLA-DR、CD83和CD86單抗(Santa-Cruz公司袁美國(guó))袁TRIzol、MTT、DM—SO、Ficoll淋巴細(xì)胞分離液(Sigma公司袁美國(guó))袁3H標(biāo)記甲基胸腺嘧啶(中科院—子能所)袁IL-2、IL-10、Granzyme B、IFN-酌細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒(BD公司袁美國(guó))袁Sensiscript RT Kit、QuantiTect SYBR Green PCR Kit(Qiagen公司袁德國(guó))曰熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀(GE公司袁澳大利亞)。

二、DC的分離、培養(yǎng)和鑒定

參照文獻(xiàn)[6]方法袁通過(guò)Ficoll密度梯度離心法袁分離來(lái)自胰腺癌患者100m L外周血中的PBMCs袁貼壁1h后袁取出未貼壁的細(xì)胞另作培養(yǎng)備用遙貼壁細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)20 h后更換新鮮培養(yǎng)液袁加入rhGMCSF(800 IU/mL)和rhIL-4(500 IU/m L)遙37益袁5% CO2袁培養(yǎng)5 d后加入TNF-琢(10 ng/m L)袁培養(yǎng)至7 d袁收集成熟DCs遙使用倒置顯微鏡和電鏡連續(xù)觀察體外培養(yǎng)5~10 d DCs形態(tài)學(xué)變化遙用流式細(xì)胞儀分析DCs的特征性標(biāo)志CD40、DC特征性成熟標(biāo)志CD83、共刺激分子CD86以及MHC類(lèi)分子HLA-DR等的表達(dá)水平。

三、M iaPaCa-2細(xì)胞總RNA提取和鑒定

收獲胰腺癌M iaPaCa-2細(xì)胞袁加入Trizol試劑1m L充分裂解袁5 m in后加入氯仿200L袁4益12 000 r/m in離心15m in袁加入異丙醇500L袁室溫放置20m in袁4益12000 r/m in離心15m in袁棄上清袁加入75%乙醇1 m L漩渦器震蕩混均袁4益12 000 r/ m in離心15min遙棄上清袁超凈臺(tái)晾干后溶于25L DEPC水遙分光光度計(jì)測(cè)定A260/A280值袁計(jì)算RNA純度和含量袁1%變性凝膠電泳測(cè)RNA完整性后-80益保存。

四、體外擴(kuò)增MUC1mRNA及DCs的轉(zhuǎn)染

采用Primer prem ier 5.0軟件設(shè)計(jì)MUC1及次黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(Hypoxanthine phosphor ribose transferase,HPRT)引物袁并經(jīng)GenBank驗(yàn)證遙以HPRT基因作為校正目標(biāo)基因表達(dá)的看家基因遙MUC1引物上游院5憶-TGA GTG ATG TGC-3憶、下游院5憶-CTG CCCGTAGTTCTT TCG-3憶曰擴(kuò)增產(chǎn)物大小158 bp遙HPRT引物上游院5憶-GGT TCT CGG GGC ACC TCT-3憶、下游院5憶-TCG GCT TGA AAT GACCTA ATG-3憶袁擴(kuò)增產(chǎn)物大小221 bp遙按Sen—siscriptRTKit說(shuō)明袁將步驟三獲得的M iaPaCa-2細(xì)胞總RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增得到MUC1 cDNA袁而后以1g樣本為模板袁按照T7mMessagemMachine試劑盒說(shuō)明于37益2~4 h體外轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增為MUC1mRNA袁計(jì)算RNA純度、含量并測(cè)完整性后保存。

[7]的方法院取200L培養(yǎng)5 d的未成熟DCs細(xì)胞懸液加入2mm的電極杯袁分別加入20gM iaPaCa-2總RNA和MUC1mRNA遙調(diào)整電壓300 V袁間隔125 ms袁4個(gè)脈沖袁持續(xù)250ms進(jìn)行電轉(zhuǎn)染遙電穿孔后立刻置入4益冰箱靜置10m in袁移入加有完全培養(yǎng)基的12孔培養(yǎng)板中袁37益、5%CO2培養(yǎng)0~96 h遙同時(shí)袁以未轉(zhuǎn)染RNA的mock-DC作為對(duì)照組。

五、RNA轉(zhuǎn)染后DC中MUC1表達(dá)檢測(cè)

收集1伊106個(gè)不同轉(zhuǎn)染組DCs袁用TRIzol法提取總RNA袁按照QuantiTect SYBRGreen PCR試劑盒說(shuō)明袁行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)院95益起始變性15 m in袁94益變性20 s袁60益退火20 s袁72益延伸20 s袁共40個(gè)循環(huán)袁最后68益60 s中止反應(yīng)曰根據(jù)參考文獻(xiàn)[8]的方法袁用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法[(待測(cè)樣品目的基因濃度/待測(cè)樣品看家基因濃度)/(對(duì)照組目的基因濃度/對(duì)照組看家基因濃度)]袁對(duì)兩組DC內(nèi)的MUC1基因進(jìn)行相對(duì)定量測(cè)定袁每個(gè)樣品重復(fù)2次袁取均值遙同時(shí)袁使用MTT法檢測(cè)DC存活率變化。

六、不同RNA轉(zhuǎn)染組DC體外刺激自體T淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

分別收集不同轉(zhuǎn)染組DCs袁調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1伊105/mL作為刺激細(xì)胞袁分選并調(diào)節(jié)患者自體PBMCs中的懸浮T淋巴細(xì)胞袁濃度為1伊106/mL作為反應(yīng)細(xì)胞袁按照刺激與效應(yīng)細(xì)胞l:10袁l:20袁l:40和l:80比例加入到96孔板中袁終體積200L袁在37益袁5%CO2培養(yǎng)5 d袁收獲細(xì)胞前18 h加入3HTdR袁每孔1Ci遙以RPM I-1640培養(yǎng)基替代效應(yīng)細(xì)胞的4個(gè)孔做為對(duì)照組袁使用液閃爍儀檢測(cè)每分鐘脈沖數(shù)(CPM)。

七、不同RNA轉(zhuǎn)染組DC體外激發(fā)抗—特異性CTL釋放細(xì)胞因子

以不同轉(zhuǎn)染組DCs為刺激細(xì)胞袁以患者自體T淋巴細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞袁刺激與效應(yīng)細(xì)胞按l:10比例混合反應(yīng)14 d后袁應(yīng)用ELISA法袁按試劑盒操作說(shuō)明書(shū)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-2、IL-10、Granzyme B和IFN-酌水平遙細(xì)胞培養(yǎng)上清用試劑盒中樣本稀釋液稀釋50倍后檢測(cè)遙每樣本設(shè)2個(gè)復(fù)孔袁取平均值。

八、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析袁計(jì)數(shù)資料以%表示袁采用字2檢驗(yàn)曰計(jì)量資料以x依s表示袁采用student-t檢驗(yàn)袁P約0.05時(shí)判定具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、DC的分離、培養(yǎng)和鑒定

DC經(jīng)體外分離、培養(yǎng)袁數(shù)量可達(dá)初始數(shù)量的10~15倍遙鏡下可見(jiàn)胞體向四周伸出大量樹(shù)枝狀或裙褶狀不規(guī)則突起袁部分突起末端呈球狀膨大(見(jiàn)圖1)遙同時(shí)可見(jiàn)轉(zhuǎn)染目標(biāo)RNA后成熟DC表面標(biāo)志物CD40、HLA-DR、CD83和CD86的表達(dá)均顯著升高袁見(jiàn)表1。

圖1 體外培養(yǎng)的胰腺癌患者外周血DC細(xì)胞形態(tài)學(xué)表現(xiàn)(A院培養(yǎng)第5天光鏡伊200曰B院培養(yǎng)第7天成熟DC光鏡伊400)

表1 流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)未成熟和成熟DC表型特征(n=6)

二、RNA轉(zhuǎn)染組DC內(nèi)MUC1抗—的表達(dá)

實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示袁分別來(lái)自6名患者的DCs經(jīng)RNA電轉(zhuǎn)染48 h袁M iaPaCa-2總RNA轉(zhuǎn)染組DCs、體外擴(kuò)增MUC1mRNA轉(zhuǎn)染組DCs及mock DCs在RNA水平均可檢測(cè)到MUC1的陽(yáng)性表達(dá)遙其中袁M iaPaCa-2總RNA轉(zhuǎn)染組DCs內(nèi)MUC1相對(duì)表達(dá)量(37.24依3.17)與體外擴(kuò)增MUC1mRNA轉(zhuǎn)染組DCs內(nèi)目標(biāo)抗—相對(duì)表達(dá)量(34.53依2.02)比較袁無(wú)明顯差異(P>0.05)曰但mock DCs內(nèi)MUC1mRNA的相對(duì)表達(dá)量?jī)H為4.19依0.52袁遠(yuǎn)低于各RNA轉(zhuǎn)染組(P<0.05)袁見(jiàn)圖2。

圖2 電轉(zhuǎn)染48h后MUC1抗—在不同RNA轉(zhuǎn)染組DCs及mock DCs內(nèi)的相對(duì)表達(dá)情況(n=6)

三、RNA轉(zhuǎn)染組DCs細(xì)胞存活率變化情況

MUC1單抗—mRNA轉(zhuǎn)染后0~96 h袁DCs存活率變化較小袁穩(wěn)定在80%左右袁而M iaPaCa-2細(xì)胞總RNA轉(zhuǎn)染后DCs存活率呈現(xiàn)時(shí)間依賴(lài)性降低袁96 h時(shí)DC存活率低至60.81%(P<0.05)袁見(jiàn)圖3。

圖3 RNA電轉(zhuǎn)染不同時(shí)間點(diǎn)DCs細(xì)胞存活率變化情況轉(zhuǎn)染后96 h袁M iaPaCa-2總RNA轉(zhuǎn)染組DCs細(xì)胞存活率顯著低于MUC1mRNA轉(zhuǎn)染組DCs(*P<0.05)

四、不同RNA轉(zhuǎn)染組DC體外刺激自體T淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

以M iaPaCa-2總RNA轉(zhuǎn)染組DCs、體外擴(kuò)增MUC1mRNA轉(zhuǎn)染組DCs及mock DCs作為刺激細(xì)胞袁各組細(xì)胞與自體T淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)袁結(jié)果顯示在DC:T=1:10時(shí)袁DC-M iaPaCa-2 totalRNA組DCs刺激自體T細(xì)胞增殖指數(shù)為8 432依611.25袁顯著高于DC-MUC1組3 664依305.17(P< 0.05)及Mock DC組257依32.16(P<0.05)曰且在DC:T=1:20時(shí)袁DC-M iaPaCa-2 total RNA組DCs刺激自體T細(xì)胞增殖指數(shù)為6152依153.03袁亦顯著高于DC-MUC1組2 376依130.01(P<0.05)及M ock DC組108依17.18(P<0.05)曰而當(dāng)DC:T=1: 40及1:80時(shí)袁DC-M iaPaCa-2 total RNA轉(zhuǎn)染組與DC-MUC1組刺激自體T細(xì)胞的增殖指數(shù)無(wú)顯著差異(P躍0.05)(圖4)。

圖4 不同RNA轉(zhuǎn)染組DC刺激自體T細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

五、不同RNA轉(zhuǎn)染組DC體外激發(fā)抗—特異性CTL釋放細(xì)胞因子

M iaPaCa-2總RNA轉(zhuǎn)染組DCs、體外擴(kuò)增MUC1mRNA轉(zhuǎn)染組DCs及mock DCs均具有刺激抗—特異性CTL分泌Th1型細(xì)胞因子的能力袁但Mock DCs對(duì)CTLs的刺激作用較弱袁幾可忽略不計(jì)遙ELISA法檢測(cè)示袁在DC:T=1:10時(shí)袁M iaPaCa-2總RNA轉(zhuǎn)染組DCs能激活自體特異性T細(xì)胞袁其誘導(dǎo)特異性CTL分泌的IL-2、IL-10、Granzyme B、IFN-酌水平袁顯著高于MUC1mRNA轉(zhuǎn)染的DCs組(P<0.05)(圖5)。

圖5 不同RNA轉(zhuǎn)染組DC刺激特異性CTLs分泌細(xì)胞因子情況

討論

免疫逃避是胰腺癌患者的常見(jiàn)事件袁而提高機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)可能是臨床治療胰腺癌的有力手段遙DC在免疫反應(yīng)進(jìn)程中可捕獲、處理、提呈腫瘤細(xì)胞抗—袁引起初級(jí)和次級(jí)免疫反應(yīng)等特殊功能[9]遙使用不同的方法使之負(fù)載腫瘤抗—袁制備DC腫瘤疫苗誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗—特異性抗腫瘤免疫應(yīng)答已成為近年來(lái)腫瘤免疫治療的研究熱點(diǎn)之一遙DC腫瘤疫苗的實(shí)質(zhì)是以特異性T細(xì)胞為基礎(chǔ)的細(xì)胞免疫袁有關(guān)胰腺癌DC疫苗構(gòu)建的一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題在于選擇合適的腫瘤抗—遙胰腺癌缺乏特異性腫瘤抗—、異質(zhì)性大、免疫—性差袁使用單腫瘤抗—負(fù)載DC構(gòu)建胰腺癌腫瘤疫苗時(shí)袁其誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)通常較弱曰而使用腫瘤全抗—負(fù)載DC構(gòu)建胰腺癌疫苗則可激活針對(duì)不同腫瘤特異性抗—的多克隆細(xì)胞袁減少腫瘤細(xì)胞克隆變異引起的抗—缺失袁從而可以減少免疫逃逸的發(fā)生率袁理論上是一種較具優(yōu)勢(shì)的DC腫瘤疫苗的構(gòu)建方法[10]。

MUC1是高糖基化玉型糖蛋白的一種袁其蛋白分子較易被免疫細(xì)胞所呈遞和識(shí)別[11]遙同時(shí)袁MUC1的表達(dá)具有高度的腫瘤特異性袁在胰腺癌細(xì)胞中的陽(yáng)性表達(dá)率可達(dá)90%以上袁因此被認(rèn)為是胰腺癌免疫治療的一個(gè)重要靶點(diǎn)[12]遙本研究引入MUC1作為研究對(duì)象的目的在于院MUC1基因穩(wěn)定內(nèi)嵌在胰腺癌腫瘤細(xì)胞全抗—標(biāo)志物袁檢測(cè)胰腺癌全腫瘤抗—負(fù)載后其在DC中的相對(duì)表達(dá)數(shù)量及效率袁即可間接判定腫瘤全抗—負(fù)載的多少與效率[13]。

RNA電轉(zhuǎn)染法具有操作簡(jiǎn)單、安全、不受MHC遺傳背景影響等優(yōu)點(diǎn)[14]遙我們的研究發(fā)現(xiàn)袁利用RNA電轉(zhuǎn)染技術(shù)袁胰腺癌M iaPaCa-2細(xì)胞總RNA可成功負(fù)載DC袁且轉(zhuǎn)染過(guò)程中未出現(xiàn)抗—不良交互反應(yīng)遙MUC1標(biāo)志物抗—在轉(zhuǎn)染M iaPaCa-2總RNA組和MUC1mRNA組DCs中均有陽(yáng)性表達(dá)袁且此兩RNA轉(zhuǎn)染組DCs內(nèi)MUC1的相對(duì)表達(dá)水平無(wú)顯著差別遙這一現(xiàn)象說(shuō)明袁與經(jīng)過(guò)體外轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增的單腫瘤抗—RNA轉(zhuǎn)染相比較袁胰腺癌細(xì)胞總RNA轉(zhuǎn)染在抗—負(fù)載能力及效率方面袁并不落下風(fēng)遙MUC1單抗—RNA轉(zhuǎn)染0~96 h袁DC存活率穩(wěn)定在80%左右袁而胰腺癌M iaPaCa-2細(xì)胞總RNA轉(zhuǎn)染DC后袁細(xì)胞存活率在不同的時(shí)間點(diǎn)明顯降低遙此現(xiàn)象可能與DC轉(zhuǎn)染的RNA劑量過(guò)多引起的毒性增加有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)研究中袁我們將M iaPaCa-2細(xì)胞總RNA轉(zhuǎn)染組及MUC1mRNA單獨(dú)轉(zhuǎn)染組DCs與自體T細(xì)胞混合培養(yǎng)袁結(jié)果顯示在不同效靶比情況下袁不同RNA轉(zhuǎn)染組DCs均能刺激自體T細(xì)胞增殖曰但M iaPaCa-2總RNA轉(zhuǎn)染組DC對(duì)自體T細(xì)胞的增殖刺激能力顯著高于MUC1mRNA單獨(dú)轉(zhuǎn)染組DC袁提示隨著負(fù)載抗—表位的增加袁DC刺激自體T細(xì)胞增殖的能力亦可顯著增強(qiáng)遙DC腫瘤疫苗的最終目的在于其誘導(dǎo)體內(nèi)CTL反應(yīng)袁進(jìn)而對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生特異性的殺傷效應(yīng)遙隨著T細(xì)胞的增殖和特異性CTL的擴(kuò)增袁活化的CTL可分泌大量Th1型的細(xì)胞因子如IL-2、IL-10、Granzyme B和IFN-酌等袁故而DC對(duì)體外CTL的刺激活化能力可間接使用IFN-酌等細(xì)胞因子的釋放量表示[15]遙本研究發(fā)現(xiàn)袁M iaPaCa-2細(xì)胞總RNA轉(zhuǎn)染組及MUC1 mRNA單獨(dú)轉(zhuǎn)染組DCs均具有體外激發(fā)CTL的能力袁但M iaPaCa-2總RNA轉(zhuǎn)染可使DCs表現(xiàn)出較單抗負(fù)載時(shí)更強(qiáng)的CTL激發(fā)效應(yīng)遙此發(fā)現(xiàn)與Van Tendeloo等的研究結(jié)果[16]類(lèi)似遙提示DC體外激發(fā)特異性CTL的能力可能與其所負(fù)載抗—表位的數(shù)目有關(guān)袁而與轉(zhuǎn)染RNA的劑量無(wú)關(guān)遙即隨著DC負(fù)載的抗—表位數(shù)量的增加袁其體外活化、激發(fā)抗—特異性CTL的能力亦會(huì)顯著增強(qiáng)。

綜上所述袁本研究結(jié)果表明轉(zhuǎn)染了人胰腺癌M iaPaCa-2細(xì)胞總RNA的DCs可在體外顯著促進(jìn)抗—特異性CTL的增殖和活化袁此結(jié)果為胰腺癌腫瘤細(xì)胞全抗—DC疫苗的開(kāi)發(fā)和臨床應(yīng)用提供了部分理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

1 JemalA,SiegelR,Ward E,etal.Cancerstatistics,2009.CACancer JClin.2009;59(4):225-249.

2 Herreros-VillanuevaM,Hijona E,Cosme A,et al.Adjuvantand neoadjuvant treatment in pancreatic cancer.World JGastroenterol. 2012;18(14):1565-1572.

3 Mossoba ME,Medin JA.Cancer immunotherapy using virally transduced dendritic cells:animalstudiesand human clinical trails. ExpertRev Vaccines,2006,5(5):717-732.

4 CheeverMA,Higano CS.PROVENGE(Sipuleucel-T)in prostate cancer:the first FDA approved therapeutic cancer vaccine.Clin CancerRes,2011,17(11):3520-3526.

5 Shore ND,MantzCA,Dosoretz DE,etal.Building on sipuleucel-T for immunologic treatmentof castration-resistant prostate cancer. CancerControl,2013,20(1):7-16.

6 ZeisM,SiegelS,Wagner A,etal.Generation o f cytotoxic responses in m ice and human individuals against hematological malignancies using survivin-RNA-transfected dendritic cells.JImmunol,2003, 170(11):5391-5397.

7 Milazzo C,Reichardt VL,Muller MR.Induction ofmyeloma-spe—cific cytotoxic T cells using dendritic cells transfected w ith tumorderived RNA.B lood,2003,101(3):977-982.

8 Klein D.Quantification using real-time PCR technology:applica—tions and lim itations.TrendsM olMed,2002,8(6):257-260.

9 Toungouz M,LambermontM,Velu T,eta1.Anti-tumour im—munotherapy based on dendritic cells.JSoc Biol,2005,195(1):19-23.

10 Zitvogel L,Regmanlt A,Lcizer A,etal.Eradication of established murine tumors using a novel cell-free vaccine:dendritic cell-de—rived exosomes.NatMed,2005,4(5):594-600.

11 VonMensdorff-Pouilly S,Snijdew int FG,Verstraeten AA,etal. Human MUC1mucin:amultifaceted glycoprotein.Int JBiolMark—ers,2000,15(4):343-356.

12 Yonezawa S,HigashiM,Yamada N,etal.Significanceofmucin ex—pression in pancreatobiliary neoplasms.J Hepatobiliary Pancreat Sci,2010,17(2):108-124.

13陳江,郭曉鐘.胰腺癌M iaPaCa-2細(xì)胞總RNA體外轉(zhuǎn)染樹(shù)突細(xì)胞的方法探討.中華胰腺病雜志,2011,11(1):20-24.

14 M ichiels A,Tuyaerts S,Bonehill A,etal.Delivery of tumor-anti—gen-encodingmRNA into dendritic cells for vaccination.M ethods Mol Biol,2008,423:155-163.

15 Sato N,Hirohashi Y,Tsukahara T,etal.Molecularpathologicalap—proaches to human tumor immunology.Pathol Int,2009,59(4):205-217.

16 Van Tendeloo VF,Ponsaerts P,Lardon F,etal.Highly efficient gene delivery by mRNA electroporation in human hematopoietic cells: superiority to lipofection and passive pulsingofmRNA and to elec—troporation ofplasmid cDNA for tumor antigen loading of dendritic cells.Blood,2001,98(1):49-56.

The induction of specific cytotoxic T lymphocytes by the dendritic cells transfected with total RNA of pancreatic cancer M iaPaCa-2 cells in vitro

CHENJiang1,MUWei-min2,SHAO Xiao-dong1,WANGDi1, XUWen-da1,GUOXiao-zhong1.1)
DepartmentofGastroenterology,Shenyang General Hospital ofPeople憶s Liberation Army,Shenyang,110840,China;2)Departmentof Gastroenterology,No.222 HospitalofPeople憶s Liberation Army,Jilin,132011,China.Corresponding author:GUO Xiao-Zhong,E-mail:Guoxi—aozhong1962@aliyun.com

Objective To investigate the ability of induction of specific cytotoxic T lymphocytes(CTL) stimulated by dendritic cells(DC)transfectedw ith total RNA of human pancreatic cancerM iaPaCa-2 cell lines.M ethod DCswere isolated and cultured from peripheral bloodmononuclearcells(PBMCs).Total RNA derived from MiaPaCa-2 cell lines and MUC1mRNA were transfected into DCs by electroporation respec—tively.The expression of MUC1 in DCswas detected by quantitative real-time PCR.The survival rate of transfected DCswere determined by MTT method.The lymphocyte proliferation ability was evaluated by m ixed cell culturemethod.The cytokinesreleasing of antigen-specific CTLsweremeasured by ELISA assay. Results A fter totalRNA ofMiaPaCa-2 cell linesand MUC1 mRNA transfection for 48h,the expression of MUC1 were 37.24依3.17 and 34.53依2.02(P>0.05).After MUC1mRNA was individually transfected,the survival rate of DCsw as stabilized around 80%,and the survival rate of DCswas 60.81%96 hoursafter the totalRNA ofMiaPaCa-2 cell lines transfection(P<0.05).Theautologous T cell proliferation index of the to—talRNA ofMiaPaCa-2 cell lines transfectionwas 8,432依611.25 in DC group,whichwassignificantly higherthan the single MUC1 transfection group(3,664依305.17)(P<0.05).The levelsof IL-2,IL-10,Granzyme B,IFN-酌secretedby MUC1 and the total RNA ofM iaPaCa-2 cell line transfected DC-specific CTL were significantly higher than MUC1m RNA alone transfection group(P<0.05).Conclusion DCs transfectedw ith the total RNA of pancreatic cancer M iaPaCa-2 cell lineshave a stronger ability to stimulate specific CTL in vitro than the single antigen loaded DCs.

Dendriticcells;RNA transfection;Pancreatic cancer;Cytotoxic T lymphocytes

院2014-06-12)

(本文編輯院郭文)

DOI院10.3969/j.issn.1672-2159.2014.05.008

院1 110016沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院消化科曰2 132011解放軍222醫(yī)院消化科

院郭曉鐘袁E-mail:Guoxiaozhong1962@163.com

院國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81071982)