劉 穎，韓春然，張 帥，張瑋瑋，竇博鑫

（哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150076）

綠色木霉β-葡萄糖苷酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)

劉 穎，韓春然，張 帥，張瑋瑋，竇博鑫

（哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150076）

針對(duì)綠色木霉AS3.3711產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶組分，先后運(yùn)用包括乙酸銨沉淀、透析、Sephadex G-150葡聚糖凝膠柱層析在內(nèi)的一系列分離純化技術(shù)對(duì)該纖維素酶進(jìn)行純化，得到β-葡萄糖苷酶純化組分，并對(duì)該酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究。純化后酶液的蛋白質(zhì)量濃度為8.12 mg/mL、酶活力為4.08 U/mL，純化倍數(shù)達(dá)到18.48，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）測(cè)定分子質(zhì)量為66.0 kD。綠色木霉β-葡萄糖苷酶在酸性條件下穩(wěn)定性良好，最適pH值為5.0；在溫度60～70℃能長(zhǎng)時(shí)間保持較高酶活力，最適反應(yīng)溫度為60 ℃。金屬離子中，Ca2+、Mg2+、K+對(duì)綠色木霉AS3.3711 β-葡萄糖苷酶活力起到促進(jìn)作用，Ca2+促進(jìn)作用最強(qiáng)；而Zn2+、Fe3+對(duì)該酶有抑制作用，Ag+、Cu2+、Hg2+重金屬離子使β-葡萄糖苷酶幾乎喪失了全部活性。

綠色木霉；β-葡萄糖苷酶；分離純化；酶學(xué)性質(zhì)

纖維素酶是降解纖維素生成葡萄糖的一類糖蛋白總稱。目前認(rèn)為，至少需要3種功能不同且又互補(bǔ)的纖維素酶協(xié)同作用才能完全降解纖維素，即內(nèi)切葡聚糖酶（EC3.2.1.4）、外切葡聚糖酶（EC3.2.1.94）和β-葡萄糖苷酶（纖維二糖酶，EC3.2.1.21）[1-3]。其中β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase）能催化水解芳基或烴基與糖基原子團(tuán)之間的糖苷鍵生成葡萄糖，防止纖維二糖的積聚，減輕其對(duì)纖維素酶的抑制作用，決定了纖維素糖化過程的最終效率，是促進(jìn)纖維素降解過程的關(guān)鍵酶[4-8]。同時(shí)，β-葡萄糖苷酶也能水解其他有重要生理作用的β-葡萄糖苷。有研究發(fā)現(xiàn)利用β-葡萄糖苷酶水解白藜蘆醇的糖苷鍵，釋放出游離白藜蘆醇，將葡萄籽中的白藜蘆醇由結(jié)合型糖苷轉(zhuǎn)化為具有生理活性的糖苷[9]。該酶廣泛存在于各種微生物中[10-17]，目前的研究多集中于由真菌、曲霉以及細(xì)菌等產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶的制備、純化及酶學(xué)性質(zhì)[17-20]，對(duì)綠色木霉（Tridchoderma viride）的研究并不多見[21]。不同來源（即使是同一菌種的不同菌株或同一植物的不同組織）的β-葡萄糖苷酶的分子質(zhì)量從幾十kD到幾百kD均有報(bào)道。已報(bào)道的β-葡萄糖苷酶的等電點(diǎn)大多數(shù)在酸性范圍，一般在pI 3.5～5.5，但最適pH值可以超過7.0，并且酸堿耐受性強(qiáng)。β-葡萄糖苷酶最適溫度在40～110 ℃均有分布；來自植物的β-葡萄糖苷酶最適溫度在40 ℃左右，而來自古細(xì)菌的β-葡萄糖苷酶的熱穩(wěn)定性和最適溫度要高于普通微生物來源的β-葡萄糖苷酶[1,8]。

液態(tài)發(fā)酵制得的纖維素酶系是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的復(fù)合酶體系，不同來源、不同類型纖維素酶系中的β-葡萄糖苷酶糖基化程度、糖鏈聚合度以及糖鏈分支均有差異，表現(xiàn)為分子質(zhì)量的差別、酶學(xué)性質(zhì)多樣性[22-24]。綠色木霉作為生產(chǎn)纖維素酶的重要菌種，近年來多為內(nèi)切酶、外切酶的研究，而對(duì)纖維素降解同樣起協(xié)同作用的β-葡萄糖苷酶研究較少。本實(shí)驗(yàn)利用一株具有較高纖維素酶活性的綠色木霉AS3.3711為出發(fā)菌株，AS3.3711液體發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶，針對(duì)其中的β-葡萄糖苷酶進(jìn)行了包括硫酸銨沉淀、透析、Sephadex G-150葡聚糖凝膠柱層析在內(nèi)的一系列分離純化技術(shù)，以獲得綠色木霉β-葡萄糖苷酶純化組分，并研究該酶的分子質(zhì)量以及酶學(xué)性質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

綠色木霉（Trichoderma viride）AS3.3711 中國科學(xué)院微生物研究所。

水楊苷、過硫酸銨、N,N,N’,N’-四甲基乙二胺 美國Sigma公司；硫酸銨 天津大茂化工公司；考馬斯亮藍(lán) 北京鼎國生物技術(shù)發(fā)展中心；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺 上?；瘜W(xué)試劑公司；十二烷基硫酸鈉、甘氨酸濟(jì)南賽恩斯科技有限公司；Tris、甲硫氨酸 上海伯奧生物科技有限公司；低分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker 上海東風(fēng)化學(xué)試劑公司。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基：4.0 g/100 mL麩皮和3.0 g/100 mL玉米粉、0.1 g/100 mL (NH4)2SO4、0.2 g/100 mL KH2PO4、0.1 g/100 mL吐溫-80，pH值自然，121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

蛋白質(zhì)層析系統(tǒng) 上?？茖W(xué)儀器廠；JY5000電泳儀 北京市君意機(jī)電技術(shù)有限公司；HLQ-C空氣浴振蕩培養(yǎng)箱 天津?qū)嶒?yàn)儀器廠；YXQ-SG46-280手提式壓力消毒器 上海佳騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；PHS-25精密數(shù)顯酸度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；TDL-5低速離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；722紫外分光光度計(jì)上海分析儀器總廠。

1.3 方法

1.3.1 粗酶液的制備

在馬鈴薯斜面固體培養(yǎng)基上30 ℃活化綠色木霉菌種48 h，然后接入馬鈴薯固體培養(yǎng)基中（種子培養(yǎng)基）30 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。用無菌水洗下種子培養(yǎng)基中的孢子，接入發(fā)酵培養(yǎng)基，按體積分?jǐn)?shù)10%量接種，30 ℃恒溫、180 r/min搖床培養(yǎng)72 h，取發(fā)酵液4 000 r/min離心10 min，收集上清液。

1.3.2 綠色木霉β-葡萄糖苷酶的分離純化

1.3.2.1 硫酸銨沉淀法初級(jí)純化

取適量等體積的粗酶液5組，均緩慢加入硫酸銨至飽和度25.0%，于4 ℃靜置過夜，4 ℃、4 000 r/min離心10 min，收集上清液。然后分別向5組離心上清液中加入硫酸銨至飽和度50.0%、60.0%、70.0%、80.0%、90.0%，于4 ℃靜置過夜，4 ℃、4 000 r/min離心10 min，收集沉淀。將沉淀溶于適量pH 6.0、0.02 mol/L乙酸鈉緩沖液中，測(cè)定β-葡萄糖苷酶活力。

1.3.2.2 葡聚糖凝膠柱層析分離純化

對(duì)于初級(jí)純化后的β-葡萄糖苷酶活力高的組分，4 000 r/min離心10 min，收集沉淀，用pH 6.0、0.02 mol/L乙酸鈉緩沖液溶解，進(jìn)行透析法除鹽處理以降低離子強(qiáng)度，達(dá)到完全除鹽效果。收集透析袋中的溶液，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將透析后的酶液分別進(jìn)行葡聚糖凝膠Sephadex G-75、Sephadex G-100、Sephadex G-150柱層析洗脫，每15 min收集1管樣品，以洗脫峰的分離效果及洗脫峰組分的β-葡萄糖苷酶活性為指標(biāo)，確定最佳凝膠型號(hào)。洗脫參數(shù)：層析柱徑高比1.0 cm×100.0 cm；洗脫液為pH 6.0、0.02 mol/L乙酸鈉緩沖液，流速0.2 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm。

1.3.3 SDS-PAGE電泳測(cè)定分子質(zhì)量

12.5 %分離膠，5.0%濃縮膠，100 V恒壓電泳，染色劑遷移至距下端2 cm左右時(shí)停止電泳。電泳以經(jīng)一系列分離純化后的β-葡萄糖苷酶純化組分為上樣品，以低分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，采用考馬斯亮藍(lán)R-250染色處理。

1.3.4 綠色木霉β-葡萄糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)研究

1.3.4.1 最適反應(yīng)溫度

溫度分別為20、30、40、50、60、70 ℃反應(yīng)30 min，測(cè)定β-葡萄糖苷酶酶活力，將最高酶活力定義為100.0%，分別計(jì)算不同溫度條件下β-葡萄糖苷酶的相對(duì)酶活力（即在不同溫度條件下的剩余的酶活力占其中酶活力的最高值的百分比）。

1.3.4.2 最適反應(yīng)pH值

在濃度為0.2 mol/L、pH值分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉溶液中，60 ℃恒溫反應(yīng)60 min，測(cè)定β-葡萄糖苷酶酶活力，將最高酶活力定義為100.0%，分別計(jì)算不同pH值條件下β-葡萄糖苷酶的相對(duì)酶活力。

1.3.4.3 熱穩(wěn)定性

溫度分別為60、65、70、75、80℃時(shí)，酶液分別保溫0、10、20、30、40 min后，測(cè)定β-葡萄糖苷酶酶活力，將最高酶活力定義為100.0%，考察不同溫度對(duì)β-葡萄糖苷酶的相對(duì)酶活力的影響。

1.3.4.4 pH值穩(wěn)定性

酶液分別在pH3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的緩沖溶液中，60 ℃恒溫反應(yīng)2 h，測(cè)定β-葡萄糖苷酶酶活力，將最高酶活力定義為100.0%，考察不同pH值環(huán)境對(duì)β-葡萄糖苷酶酶活力的影響[25-27]。

1.3.4.5 金屬離子的影響

分別向反應(yīng)體系中加入終濃度為1.0 mmol/L的NaCl、KCl、AgNO3、MgSO4、CaCl2、CuSO4、BaCl2、MnSO4、ZnSO4、HgCl2、Fe2(SO4)3溶液，于60 ℃恒溫反應(yīng)30 min，同時(shí)以不添加金屬離子為對(duì)照組，考察不同金屬離子對(duì)于β-葡萄糖苷酶酶活力的影響[28-29]。

1.3.5 分析檢測(cè)方法

1.3.5.1 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量[30]。

1.3.5.2 β-葡萄糖苷酶的酶活力測(cè)定方法

取0.5 mL一定稀釋度的樣液，加入0.5 mL、0.5 g/100 mL的水楊苷（溶于0.1 mol/L、pH 4.8醋酸緩沖液中），55 ℃保溫20 min后，加入1 mL DNS試劑充分混合后，于沸水中滅酶處理5 min，待完全冷卻后用蒸餾水稀釋至10 mL。在520 nm波長(zhǎng)處，采用722型分光光度計(jì)測(cè)定樣品光密度值，以加熱滅活的酶液作為空白組。在上述條件下，定義每小時(shí)由底物產(chǎn)生1.0 μmol還原糖所需的酶量為一個(gè)酶活力單位（1 U）[29-32]。

2 結(jié)果與分析

2.1 綠色木霉AS3.3711 β-葡萄糖苷酶的分離純化

2.1.1 硫酸銨沉淀法初級(jí)純化

表1 硫酸銨沉淀法初級(jí)純化β-葡萄糖苷酶的結(jié)果Table 1 Preliminary separation of β-glucosidase frroomm Trichodeerrmmaa virriiddee by ammonium sulfate precipitation

經(jīng)硫酸銨沉淀法初級(jí)純化后的β-葡萄糖苷酶活力如表1所示，經(jīng)飽和度為25.0%的硫酸銨去除部分雜蛋白及菌絲體，4 ℃靜置過夜，離心上清液中的β-葡萄糖苷酶酶活力4 060.68 U/mL，除雜效果較好，同時(shí)保持了較強(qiáng)的纖維素酶活力，定義此時(shí)的相對(duì)酶活力為100.0%；然后向5組離心上清液中分別加入硫酸銨至不同飽和度，再次4 ℃靜置過夜，取各離心沉淀分別于25 mL乙酸鈉緩沖液中充分溶解。從表1可知，硫酸銨飽和度為80.0%及90.0%時(shí)，粗酶液的相對(duì)酶活力均可達(dá)到90.0%以上，分離純化效果顯著，但綜合考慮硫酸銨沉淀法的純化效果、實(shí)驗(yàn)操作性及經(jīng)濟(jì)實(shí)用性，選擇80.0%飽和度硫酸銨初步分離純化纖維素酶β-葡萄糖苷酶。

2.1.2 葡聚糖凝膠柱層析分離純化

收集先后經(jīng)飽和度為25.0%、80.0%的硫酸銨沉淀法初級(jí)分離純化后的粗酶液，對(duì)其進(jìn)行充分透析除鹽處理，以除去硫酸銨、大部分色素以及其他蛋白質(zhì)、多肽、糖類等雜質(zhì)。準(zhǔn)確量取1.0 mL經(jīng)透析后的酶液，分別加樣于具有不同交聯(lián)度的葡聚糖凝膠Sephadex G-75、Sephadex G-100、Sephadex G-150層析柱進(jìn)行洗脫實(shí)驗(yàn)，分離純化結(jié)果如圖1～3所示。

圖1 Sephadex G-75凝膠柱層析純化圖譜Fig.1 Purification of β-glucosidase by Sephadex G-75 gel column chromatography

圖2 Sephadex G-100凝膠柱層析純化圖譜Fig.2 Purification of β-glucosidase by Sephadex G-100 gel column gel column chromatography

圖3 Sephadex G-150凝膠柱層析純化圖譜Fig.3 Purification of β-glucosidase by Sephadex G-150 gel column chromatography

酶液經(jīng)Sephadex G-75柱層析純化后只得到一個(gè)洗脫峰A，分離效果不理想；經(jīng)過Sephadex G-100柱層析純化后，可以得到2個(gè)洗脫峰A’和B’，但洗脫峰B’的峰面積及分離度均較?。幻敢航?jīng)過Sephadex G-150分離純化后共得到2個(gè)洗脫峰Ⅰ和Ⅱ，峰面積及峰型均最好，故選擇葡聚糖凝膠Sephadex G-150柱層析分離純化β-葡萄糖苷酶。通過測(cè)定2個(gè)主峰的β-葡萄糖苷酶酶活力可知洗脫峰Ⅰ具有酶活力，達(dá)到4.08 U/mL，收集洗脫組分峰Ⅰ物質(zhì)。

2.1.3 綠色木霉β-葡萄糖苷酶的分離純化過程分析

表2 分離純化綠色木霉β-葡萄糖苷酶效果Table 2 Summary of purification of β-glucosidase from Trichoderma viride

綠色木霉發(fā)酵上清液先后經(jīng)過硫酸銨沉淀、葡聚糖凝膠柱層析色譜純化，獲得綠色木霉β-葡萄糖苷酶的純化物，該分離純化過程如表2所示，純化倍數(shù)達(dá)到18.48倍。

2.2 SDS-PAGE電泳測(cè)定蛋白質(zhì)分子質(zhì)量

圖4 綠色木霉β-葡萄糖苷酶SDS-PAGE電泳圖譜Fig.4 SDS-PAGE pattern of β-glucosidase from Trichoderma viride

采用SDS-PAGE凝膠電泳法測(cè)定分離純化得到的β-葡萄糖苷酶純化峰Ⅰ組分的分子質(zhì)量，結(jié)果如圖4所示。峰Ⅰ組分可得到兩條清晰的譜帶a和b。其中譜帶a代表分子質(zhì)量約為66.0 kD的蛋白組分，譜帶b代表分子質(zhì)量為40.0 kD。由于不同來源的酶在酶學(xué)性質(zhì)上有較大差異，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道的纖維素酶的種類和相對(duì)分子質(zhì)量，譜帶a中含有純化出的綠色木霉β-葡萄糖苷酶的可能性較大[10,21,27-28]，而譜帶b與和內(nèi)切葡聚糖酶的分子質(zhì)量較為相近[4-5,33]，需要進(jìn)一步確定其組分。

2.3 綠色木霉β-葡萄糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.3.1 最適反應(yīng)溫度

如圖5所示，綠色木霉產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶在溫度20～60 ℃時(shí)，其相對(duì)酶活力顯著上升（P＜0.05）；而溫度60～70 ℃時(shí)，相對(duì)酶活力顯著下降（P＜0.05），確定綠色木霉β-葡萄糖苷酶最適反應(yīng)溫度為60 ℃。

圖5 溫度對(duì)綠色木霉產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶的影響Fig.5 Effect of temperature on the activity of β-glucosidase from Trichoderma viride

2.3.2 最適反應(yīng)pH值

圖6 pH值對(duì)綠色木霉產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶的影響Fig.6 Effect of pH on the activity of β-glucosidase from Trichoderma viride

在pH 3.0～8.0的緩沖液中保溫，β-葡萄糖苷酶的活力測(cè)定結(jié)果如圖6所示。在pH 3.0～4.0時(shí)，相對(duì)酶活力顯著上升（P＜0.05）；pH 4.0～5.0時(shí)，相對(duì)酶活力呈平緩上升趨勢(shì)（P＞0.05）；而pH 5.0～8.0時(shí)，相對(duì)酶活力顯著下降（P＜0.05），下降幅度達(dá)到64.34%，確定綠色木霉β-葡萄糖苷酶最適反應(yīng)pH值為5.0。

2.3.3 熱穩(wěn)定性

圖7 綠色木霉β-葡萄糖苷酶的熱穩(wěn)定性Fig.7 Thermal stability of β-glucosidase from Trichoderma viride

由圖7可知，β-葡萄糖苷酶在60 ℃時(shí)，其酶活力在30 min內(nèi)幾乎保持不變；在65 ℃時(shí)，其相對(duì)酶活力也比較穩(wěn)定；而當(dāng)溫度升至70 ℃時(shí)，β-葡萄糖苷酶半衰期為30 min；溫度繼續(xù)上升為80 ℃時(shí)，其半衰期為20 min，仍具有18.23%相對(duì)酶活力。綠色木霉β-葡萄糖苷酶具有較好的耐熱穩(wěn)定性。

2.3.4 pH值穩(wěn)定性

圖8 綠色木霉β-葡萄糖苷酶的pH值穩(wěn)定性Fig.8 pH stability of β-glucosidase from Trichoderma viride

于不同pH值環(huán)境中保溫處理2 h后測(cè)定β-葡萄糖苷酶的活性，結(jié)果如圖8所示。綠色木霉β-葡萄糖苷酶在pH 3.0～6.0酸性條件下，相對(duì)酶活力均可保持60.0%以上；而在中性pH 7.0及堿性環(huán)境中，酶活力降低，但仍保持21.03%相對(duì)酶活力。綠色木霉β-葡萄糖苷酶耐酸堿穩(wěn)定性良好。

2.3.5 金屬離子對(duì)酶活性的影響

圖9 金屬離子對(duì)綠色木霉β-葡萄糖苷酶活性的影響Fig.9 Effects of different metal ions on the activity of β-glucosidase from Trichoderma viride

由圖9可知，不同金屬離子對(duì)該β-葡萄糖苷酶的活力影響差異十分顯著，Ca2+對(duì)該酶的激活促進(jìn)作用最強(qiáng)[28-29]，同時(shí)Mg2+、K+對(duì)β-葡萄糖苷酶活力也起促進(jìn)作用；Zn2+、Fe3+對(duì)該β-葡萄糖苷酶有一定程度的抑制作用，但酶仍具有活性；而重金屬離子如Ag+、Cu2+、Hg2+對(duì)β-葡萄糖苷酶抑制作用明顯，使其酶活性幾乎全部喪失。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)先后運(yùn)用包括硫酸銨沉淀、透析、Sephadex G-150葡聚糖凝膠柱層析在內(nèi)的一系列純化技術(shù)，對(duì)綠色木霉AS3.3711產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶組分進(jìn)行了分離與純化，采用SDS-PAGE電泳測(cè)定了酶蛋白組分的分子質(zhì)量范圍，并研究其酶學(xué)性質(zhì)。相關(guān)結(jié)論如下：

先后采用飽和度分別為25.0%和80.0%的硫酸銨初級(jí)純化含有β-葡萄糖苷酶的粗酶液，經(jīng)飽和度25.0%的硫酸銨純化后的酶活力為11.35 U/mL；經(jīng)飽和度80.0%的硫酸銨純化后的酶活力為10.25 U/mL，相對(duì)酶活力達(dá)到90.0%，分離純化效果顯著，且酶活力損失較小。

經(jīng)充分透析除離子及雜質(zhì)后，采用Sephadex G-150分離純化經(jīng)綠色木霉液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶，可得到2個(gè)洗脫峰，其中組分峰Ⅰ具有β-葡萄糖苷酶酶活力，其蛋白總含量為8.12 mg/mL，酶活力4.08 U/mL，比活力0.573 U/mg，純化倍數(shù)達(dá)到18.48倍。經(jīng)SDS-PAGE電泳測(cè)定洗脫組分Ⅰ分子質(zhì)量為66.0 kD。

綠色木霉β-葡萄糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)：最適pH值為5.0，最適反應(yīng)溫度60 ℃；在酸性條件下有較強(qiáng)穩(wěn)定性，耐酸堿性良好；溫度60～70 ℃時(shí)，能長(zhǎng)時(shí)間保持較高酶活力，熱穩(wěn)定性良好；離子濃度為1.0 mmol/L時(shí)，Ca2+、Mg2+、K+對(duì)β-葡萄糖苷酶活力起促進(jìn)作用，其中Ca2+促進(jìn)作用最強(qiáng)，Zn2+、Fe3+對(duì)該酶有不同程度的抑制作用，重金屬離子如Ag+、Cu2+、Hg2+幾乎使β-葡萄糖苷酶喪失全部活性。

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Separation, Purification and Enzymatic Properties of β-Glucosidase from Tridchoderma viride

LIU Ying, HAN Chun-ran, ZHANG Shuai, ZHANG Wei-wei, DOU Bo-xin
(College of Food Engineering, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China)

An extracellular β-glucosidase produced by Trichoderma viride AS3.3711 was separated and purified by ammonium acetate precipitation, dialysis and Sephadex G-150 column chromatography. The results of enzyme characterization showed that the protein concentration of the purified enzyme solution was 8.12 mg/mL, and the β-glucosidase activity was 4.08 U/mL, with a purification factor of 18.48. Its molecular weight was 66.0 kD. The β-glucosidase from Trichoderma viride displayed a strong stability under acidic conditions and its optimum pH value was 5.0. In the range of 60–70 ℃, it could still maintain a high enzyme activity for a long time with an optimum reaction temperature of 60 ℃. Some metal ions including Ca2+, Mg2+and K+improved its activity with Ca2+having the strongest effect. However, Zn2+and Fe3+inhibited the enzyme. Heavy metal ions such as Ag+, Cu2+and Hg2+almost totally inactivated its activity.

Tridchoderma viride; β-glucosidase; separation and purification; enzymatic properties

Q815；Q814；Q55

A

1002-6630（2014）05-0150-06

10.7506/spkx1002-6630-201405030

2013-03-30

黑龍江省高校科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)計(jì)劃項(xiàng)目（2010td04）；黑龍江省普通高等學(xué)校青年學(xué)術(shù)骨干支持計(jì)劃項(xiàng)目（160135）；

黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（D01-24）

劉穎（1968—），女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：dbx0803@163.com