李 艷，董振玲，牟德華,*

（1.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050018；2.河北省發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，河北 石家莊 050018）

羊羔美酒大曲中酵母菌多樣性及分子鑒定

李 艷1,2，董振玲1，牟德華1,*

（1.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050018；2.河北省發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，河北 石家莊 050018）

目的：分離和鑒定羊羔美酒大曲中的酵母菌，探尋酵母菌群多樣性組成，為深入研究羊羔美酒的風(fēng)味特征奠定基礎(chǔ)。方法：對(duì)羊羔美酒大曲實(shí)施多點(diǎn)采樣、混合研磨、無(wú)菌水梯度稀釋、平板畫(huà)線分離、挑取酵母菌單菌落。酵母菌的形態(tài)鑒定采取菌落特征和顯微細(xì)胞特征結(jié)合的方法，分子鑒定采用5.8S rDNA-ITS區(qū)域限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）分析及序列分析法。結(jié)果：從羊羔美酒大曲中共分離出474株酵母菌，傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定為14種形態(tài)類型，經(jīng)5.8S rDNA-ITS區(qū)域RFLP分析法區(qū)分為6種分子類型。經(jīng)基因序列分析，將其鑒定為分屬于6個(gè)屬的6種酵母菌，分別為：異常畢赤酵母（Pichia anomala）、釀酒酵母（Saccharomyce cerevisia）、阿氏絲孢酵母（Trichosporon asahii）、黏質(zhì)紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa）、淺白隱球酵母（Cryptococcus albidus）、東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）。結(jié)論：羊羔美酒大曲中酵母菌多樣性豐富，除釀酒酵母外，還含有多種酵母菌輔助代謝產(chǎn)生各種風(fēng)味物質(zhì)，其中釀酒酵母為主要優(yōu)勢(shì)菌群。

羊羔美酒大曲；酵母菌；形態(tài)分類；5.8S rDNA-ITS區(qū)域RFLP分析

羊羔美酒選用優(yōu)質(zhì)北方黍米、鮮嫩羊肉、新鮮水果及名貴中藥材為原料，經(jīng)過(guò)黍米蒸飯與預(yù)先熬制的嫩羊肉湯和果藥汁混合，拌以大麥曲進(jìn)行糖化和發(fā)酵，經(jīng)過(guò)濾和3年以上陳釀而成，酒液呈琥珀色，酒度為17°，融酯香、奶香、果香、藥香于一體，酸甜適度、風(fēng)格獨(dú)特、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高，具有滋陰潤(rùn)肺、增補(bǔ)元?dú)?、壯腰益腎、開(kāi)胃健脾、養(yǎng)肝明目及烏發(fā)美容的功效，是中國(guó)獨(dú)有的高級(jí)滋補(bǔ)保健酒。羊羔美酒隸屬我國(guó)傳統(tǒng)黃酒范疇，但又有若干獨(dú)特之處，僅釀酒用曲就體現(xiàn)一大特色，作為羊羔美酒的生命之源，探討酒的風(fēng)味必先預(yù)知酒曲微生物及酶系組成，而對(duì)于釀酒來(lái)說(shuō)，酵母菌是眾多微生物中將糖轉(zhuǎn)化為酒的主要生命體，因此研究酵母菌群的組成可為深入研究酒的風(fēng)味特點(diǎn)奠定良好的基礎(chǔ)[1]。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)于酒曲微生物的研究主要集中于白酒酒曲[2-4]，而且對(duì)酒曲中霉菌的研究較多[5-6]，對(duì)于黃酒酒曲中酵母菌的研究報(bào)道較少，而對(duì)這款北方獨(dú)特的黃酒羊羔美酒酒曲中酵母菌的尚屬首例。

本研究以羊羔美酒釀造用酒曲為原料，以酵母菌為研究對(duì)象，在培養(yǎng)條件下分離篩選酵母菌，并進(jìn)行傳統(tǒng)的形態(tài)分類和分子生物學(xué)鑒定，為探明羊羔美酒的奧秘和我國(guó)特色黃酒的風(fēng)味特征研究奠定基礎(chǔ)，具有深遠(yuǎn)的理論和現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 材料

羊羔美酒大曲由河北味道府酒業(yè)有限責(zé)任公司提供。

1.2 試劑與培養(yǎng)基

配制培養(yǎng)基的各種試劑和生化試劑，包括引物ITS1（5’-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3’），ITS4（5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’），限制性內(nèi)切酶HaeⅢ、HinfⅠ、HhaⅠ等均為分析純，購(gòu)自生工生物工程（上海）技術(shù)服務(wù)有限公司。

酵母菌培養(yǎng)用酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培養(yǎng)基[7-8]：葡萄糖20 g/L、蛋白胨20 g/L、酵母浸粉10 g/L、瓊脂20 g/L，pH值自然，121℃滅菌20 min。

酵母菌形態(tài)鑒定用Wallerstein Laboratory（WL）培養(yǎng)基：葡萄糖50 g/L、胰蛋白胨5 g/L、酵母浸粉4 g/L、磷酸二氫鉀0.55 g/L、氯化鉀0.425 g/L、氯化鐵0.25 mg/L、硫酸鎂0.125 g/L、氯化鈣0.125 g/L、硫酸錳0.25 mg/L、溴甲酚綠22 mg/L、瓊脂20 g/L，pH 5.5。

1.3 儀器與設(shè)備

PCR儀、凝膠成像分析儀 美國(guó)Bio-Rad公司；瓊脂糖水平板電泳儀 北京六一公司。

1.4 方法

1.4.1 酒曲中酵母菌的分離

干酒曲中酵母菌的分離：從羊羔美酒用大曲餅的外表面、中間和內(nèi)部分別取樣，混合研磨成粉，取1 g加入100 mL無(wú)菌水，置于搖床上150 r/min、30 min，靜止，取其上清液進(jìn)行一系列10倍梯度稀釋[9]，選擇適宜的稀釋梯度，取0.2 mL稀釋液于YEPD培養(yǎng)基進(jìn)行28 ℃涂布培養(yǎng)，2 d后從平板上挑取酵母菌，再劃線接種于相同培養(yǎng)基得單菌落。

培養(yǎng)狀態(tài)下酵母菌的分離：分別以大米、糯米為酒曲活化基質(zhì)進(jìn)行微生物的富集培養(yǎng)，同時(shí)以黍米的羊羔美酒發(fā)酵過(guò)程為對(duì)照，在接種后第0、1、2、4、6、8、10、14、18、25天分別取樣進(jìn)行酵母菌分離純化，培養(yǎng)溫度為30 ℃和25 ℃。取樣基質(zhì)1 g，加100 mL無(wú)菌水打漿，取5 mL漿液進(jìn)行系列10倍梯度稀釋，選3個(gè)合適的稀釋度0.2 mL進(jìn)行3個(gè)平行平板的涂布分離培養(yǎng)。28 ℃培養(yǎng)2 d，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)并挑取酵母菌，再劃線接種于相同培養(yǎng)基得單菌落。

1.4.2 酵母菌的形態(tài)聚類

將獲得的酵母菌用YEPD培養(yǎng)基進(jìn)行活化復(fù)篩，劃線接種于WL培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)5 d，觀察酵母菌在WL培養(yǎng)基上菌落的顏色、形態(tài)、表面是否光滑、邊緣是否整齊等菌落特征。同時(shí)，在顯微鏡下觀察酵母的細(xì)胞形態(tài)。以此對(duì)分離到的酵母菌株進(jìn)行初步的形態(tài)聚類[10-11]，并進(jìn)行保藏。

1.4.3 酵母菌的分子鑒定

酵母菌的分子鑒定的方法采用5.8S rDNA-ITS區(qū)域限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）分析法。經(jīng)初步形態(tài)聚類的酵母菌分別取一株代表菌株，用十二烷基硫酸鈉（sodium dodecylsulfate，SDS）熱裂解法[12]提取基因組DNA，用引物ITS1和ITS4對(duì)菌株的5.8S rDNA-ITS區(qū)進(jìn)行基因擴(kuò)增[13-14]。PCR反應(yīng)混合液包括：雙蒸水33.65 ?L，Buffer 10 ?L，dNTP 1 ?L，正向引物2 ?L，反向引物2 ?L，DNA模板1 ?L，Taq酶0.35 ?L，反應(yīng)總體積為50 ?L。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min，變性35 s，55 ℃退火35 s，72 ℃延伸35 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸3 min。將得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳。溴化乙錠染色10 min，凝膠成像分析儀下觀察并攝影。

5.8 S-ITS區(qū)域基因擴(kuò)增產(chǎn)物限制性酶切分析（20 ?L）：雙蒸水9 ?L，Buffer 2 ?L，PCR產(chǎn)物8 ?L，內(nèi)切酶（HaeⅢ 、HinfⅠ、HaeⅢ）1 ?L。酶切條件：37 ℃水浴2.5 h。取出置于4 ℃冰箱保存。酶切產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，酶切產(chǎn)物加樣量8 ?L與1 ?L 的10×Loading buffer混勻后加樣，加入5 ?L的Marker為對(duì)照，電泳電壓為70～80 V，時(shí)間60～70 min，溴化乙錠染色10 min，凝膠成像分析儀下觀察并攝影。

將酵母菌株5.8S rDNA ITS區(qū)PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）技術(shù)服務(wù)有限公司，委托其進(jìn)行基因序列測(cè)定。測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)，進(jìn)行同源性分析。下載相關(guān)菌株序列信息，使用MEGA4軟件中的鄰接法（Neighbor-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù)圖，并以Bootstrap對(duì)進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行1 000次可信度分析。

1.4.4 羊羔美酒發(fā)酵過(guò)程中酵母菌群動(dòng)態(tài)微生態(tài)結(jié)構(gòu)研究

根據(jù)酵母菌的形態(tài)菌類結(jié)果與分子鑒定結(jié)果，對(duì)羊羔美酒發(fā)酵過(guò)程中分離到的不同種類的酵母菌種類與數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，分析發(fā)酵過(guò)程各類酵母所占比例和變化規(guī)律[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌的形態(tài)聚類

經(jīng)分離純化共得到474株酵母菌，其中非培養(yǎng)狀態(tài)下得到17株，大米和糯米為培養(yǎng)基質(zhì)，不同培養(yǎng)溫度條件下得到152株，在羊羔美酒發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中分離得到305株。依據(jù)在WL培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的酵母菌菌落形態(tài)和顏色特征，結(jié)合顯微鏡下觀察酵母菌的細(xì)胞形態(tài)，可將其區(qū)分為14種形態(tài)類型，結(jié)果見(jiàn)表1。

不同種類的酵母菌在WL營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落顏色和形態(tài)不同，因此可作為酵母菌鑒別性培養(yǎng)基。在羊羔美酒大曲中分離得到的酵母菌絕大多數(shù)可以用WL培養(yǎng)基進(jìn)行區(qū)分，再結(jié)合不同酵母菌的細(xì)胞顯微形態(tài)不同，可以將酵母菌進(jìn)行初步形態(tài)聚類分析。從表1可以看出，成品干曲中僅可分離到1種類型的酵母菌。而在利用大米和糯米為培養(yǎng)基質(zhì)，25 ℃和30 ℃培養(yǎng)條件下可分離到8種形態(tài)類型的酵母菌。在以黍米為原料的羊羔美酒發(fā)酵過(guò)程中，分離得到了13種形態(tài)類型的酵母菌。其中，形態(tài)2是成品曲中分離到的唯一酵母菌，它同時(shí)出現(xiàn)在各種分離條件下和實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中，根據(jù)其形態(tài)學(xué)特征，可以初步判定為釀酒酵母，其數(shù)量也占分離酵母菌的最大比重，為典型的優(yōu)勢(shì)菌群，顯微鏡下其細(xì)胞形態(tài)如圖1。

圖1 優(yōu)勢(shì)酵母菌的細(xì)胞（a）和菌落（b）形態(tài)（×4400）Fig.1 Cellular (a) and colony (b) morphology of the predominant yeast species (×4400)

2.2 酵母菌株5.8S rDNA- ITS區(qū)RFLP分析

圖2 5.8S rDNA-ITS區(qū)域PCR產(chǎn)物電泳圖譜Fig.2 PCR electrophoretogram of 5.8S rDNA-ITS region

目前，鑒定酵母菌常用的分子手段是酵母菌的5.8S rDNA-ITS區(qū)RFLP分析，其原理是酵母菌5.8S rDNA及兩側(cè)的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS區(qū)）既有高度保守性又具有明顯的種間差異性，因此可以作為區(qū)分鑒定酵母菌的分類依據(jù)[15-18]。本研究在WL培養(yǎng)基進(jìn)行酵母菌形態(tài)聚類分析的基礎(chǔ)上，從每種形態(tài)類型中隨機(jī)選擇1株酵母菌進(jìn)行核糖體5.8S-ITS區(qū)基因擴(kuò)增，14種形態(tài)酵母菌的5.8S- ITS區(qū)rRNA基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖見(jiàn)圖2。同時(shí)使用HaeⅢ、HinfⅠ和HhaⅠ酶對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切分析，酶切電泳圖譜見(jiàn)圖3。

表1 WL培養(yǎng)基上酵母菌的形態(tài)特征及數(shù)量Table 1 Morphological characteristics and number of the yeasts on WL medium

圖3 PCR產(chǎn)物的3種限制性內(nèi)切酶酶切分析圖譜Fig.3 Restriction analysis patterns of the PCR-amplified 5.8S-ITS region

14種酵母菌的PCR產(chǎn)物大小均在500～800 bp，經(jīng)過(guò)HaeⅢ、HinfⅠ和HhaⅠ酶進(jìn)行酶切后，可以將其區(qū)分為6種分子類型。Ⅰ類：包括形態(tài)1和8，PCR產(chǎn)物大小為626 bp，經(jīng)HaeⅢ、HinfI和HhaI酶切后，均產(chǎn)生1個(gè)酶切片段，分別為600、281、567 bp。Ⅱ類：包括形態(tài)2、3、5、6、7、9和11，PCR產(chǎn)物大小為850 bp，經(jīng)HaeⅢ酶切后，有4個(gè)酶切片段，即310、230、179 bp和125 bp；經(jīng)HinfⅠ酶切后，有2個(gè)酶切片段，345 bp和120 bp；由HhaⅠ酶進(jìn)行酶切后，有2個(gè)主要酶切片段，364 bp和335 bp。Ⅲ類：形態(tài)4，PCR產(chǎn)物大小為536 bp，經(jīng)HaeⅢ、HinfⅠ和HhaⅠ酶切后，均產(chǎn)生1個(gè)酶切片段，分別為481、224、268 bp。Ⅳ類型：形態(tài)10，PCR產(chǎn)物大小為616 bp，經(jīng)HaeⅢ酶切后，有2個(gè)酶切片段，406 bp和221 bp；經(jīng)HinfⅠ酶切后，有2個(gè)酶切片段，353 bp和225 bp；由HhaⅠ酶進(jìn)行酶切后，有2個(gè)酶切片段，292 bp和223 bp。Ⅴ類型：形態(tài)12和13，PCR產(chǎn)物大小為621 bp，經(jīng)HaeⅢ酶切后，有1個(gè)酶切片段，504 bp；經(jīng)HinfⅠ酶切后，有3個(gè)酶切片段，335、144 bp和117 bp；由HhaⅠ酶進(jìn)行酶切后，有1個(gè)酶切片段，309 bp。VI類型：形態(tài)14，PCR產(chǎn)物大小為514 bp，經(jīng)HaeⅢ酶切后，有1個(gè)酶切片段，336 bp；經(jīng)HinfⅠ酶切后，有2個(gè)酶切片段，217 bp和133 bp；由HhaⅠ酶進(jìn)行酶切后，有1個(gè)酶切片段，348 bp。結(jié)合5.8S rDNA-ITS區(qū)基因PCR擴(kuò)增結(jié)果及其限制性內(nèi)切酶HaeⅢ、HinfⅠ和HhaⅠ酶切片段的RFLP分析，可將14種酵母菌區(qū)分為6類，見(jiàn)表2。

表2 酵母菌5.8S rDNA -ITS區(qū)域RFLP分析Table 2 Results of RFLP analysis of 5.8S rDNA-ITS region of yeast isolates

2.3 酵母菌株5.8S-ITS區(qū)基因序列分析

本研究將酵母菌的5.8S rDNA-ITS區(qū)域RFLP分析結(jié)果與本研究室已經(jīng)過(guò)測(cè)序的酵母菌進(jìn)行了比對(duì)，發(fā)現(xiàn)分子類型Ⅱ，包括形態(tài)類型2、3、5、6、7、9、11酵母菌的5.8S rDNA-ITS 區(qū) RFLP分析結(jié)果與自選釀酒酵母（編號(hào)KDLYC19-255，GenBank登錄號(hào)：HQ909096）完全一致，因此可確定其為釀酒酵母[19]。其余5種分子類型的酵母菌隨機(jī)選擇1株進(jìn)行基因測(cè)序，將所得基因序列結(jié)果登錄GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行BLAST（http: // www. ncbi. nlm. nih. gov /blast /Blast. cgi）相似性比對(duì)，以相似度大于99%確定其屬種，測(cè)序結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 酵母菌5.8S rDNA-ITS區(qū)序列分析結(jié)果Table 3 Sequence analysis of the 5.8S rDNA-ITS region of yeast

結(jié)合表2、3可以看出，經(jīng)過(guò)形態(tài)學(xué)區(qū)分和分子生物學(xué)鑒定，可以將14種形態(tài)的酵母菌區(qū)分成6種5.8S rDNA-ITS區(qū)RFLP類型，歸屬到6個(gè)屬中的6種酵母菌，分別為異常畢赤酵母（Pichia anomala）、釀酒酵母（Saccharomyce cerevisia）、阿氏絲孢酵母（Trichosporon asahii）、黏質(zhì)紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa）、淺白隱球酵母（Cryptococcus albidus）和東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）。

通過(guò)Neighbor-Joining法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可以判斷酵母菌的同源關(guān)系，如圖4所示。在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上同一分支的酵母同源關(guān)系最近，從聚類結(jié)果可以清楚的看出所分離酵母菌的分類情況及各自的種屬名稱。

圖4 基于5.8S rDNA-ITS區(qū)序列和Neighbor-Joining法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree based on 5.8S-ITS region sequences by neighbor-jointing method

2.4 羊羔美酒發(fā)酵過(guò)程中酵母菌群動(dòng)態(tài)微生態(tài)結(jié)構(gòu)

圖5 羊羔美酒發(fā)酵過(guò)程中第一批（a）和第二批（b）酵母菌的菌群動(dòng)態(tài)變化Fig.5 Yeast population dynamics during Yanggaomeijiu fermentation

羊羔美酒發(fā)酵過(guò)程中存在的酵母菌包括產(chǎn)酒精酵母和產(chǎn)酯酵母，酒精酵母利用可發(fā)酵糖轉(zhuǎn)化為乙醇，產(chǎn)酯酵母可產(chǎn)酯或產(chǎn)酸，與酒體香氣、口感密切相關(guān)。這些酵母菌從酒曲或發(fā)酵環(huán)境中進(jìn)入發(fā)酵醪液，在發(fā)酵前期利用可發(fā)酵糖生長(zhǎng)繁殖，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，酒精含量逐漸升高，低發(fā)酵能力和酒精耐受力較差的微生物菌株逐漸被抑制或消亡，到發(fā)酵中后期，發(fā)酵能力強(qiáng)、耐酒精能力好的酵母成為優(yōu)勢(shì)菌群。羊羔美酒發(fā)酵過(guò)程中酵母菌的菌群動(dòng)態(tài)變化見(jiàn)圖5。從整體來(lái)看，兩批發(fā)酵過(guò)程中大體趨勢(shì)相同，都是以釀酒酵母為主要優(yōu)勢(shì)菌，其他類型的酵母菌在發(fā)酵過(guò)程中出現(xiàn)的種類和比例略有不同。分析可能是由于酒曲的批次不同，導(dǎo)致在后續(xù)的發(fā)酵過(guò)程中菌群出現(xiàn)了波動(dòng)。畢竟酒曲的制備過(guò)程是在一個(gè)開(kāi)放的環(huán)境中，網(wǎng)羅自然環(huán)境的微生物群落，環(huán)境的微改變可能會(huì)影響酒曲最終微生物比例的波動(dòng)。羊羔美酒的發(fā)酵也是傳統(tǒng)的開(kāi)放式發(fā)酵環(huán)境，使用的器具、設(shè)備及周圍的環(huán)境中存在的微生物均對(duì)研究結(jié)果產(chǎn)生影響。

羊羔美酒發(fā)酵前期第0～5天，存在的酵母菌有Saccharomyces cerevisiae、Pichia anomala和Rhodotorula mucilaginosa，前2 d的主要菌群為Saccharomyces cerevisiae。第3～5天，第一批主導(dǎo)酵母菌群是Saccharomyces cerevisiae釀酒酵母菌，第二批優(yōu)勢(shì)酵母菌群為Saccharomyces cerevisiae和Pichia anomala。發(fā)酵5 d以后至15 d時(shí)，第二批發(fā)酵醪液中的酵母菌群明顯豐富，有Saccharomyces cerevisiae、Trichosporon asahii、Pichia anomala和Cryptococcus albidus等，在第7天大量出現(xiàn)Pichia anomala和Rhodotorula mucilaginosa酵母菌，而在第10天時(shí)Saccharomyces cerevisiae酵母菌占主導(dǎo)優(yōu)勢(shì)，此后的15 d最多的酵母菌為T(mén)richosporon asahii和Saccharomyces cerevisiae，而第一批發(fā)酵在該階段的優(yōu)勢(shì)菌群依然是酵母菌Saccharomyces cerevisiae，發(fā)酵后期，即發(fā)酵15 d以后，羊羔美酒發(fā)酵醪液中的優(yōu)勢(shì)菌群為Saccharomyces cerevisiae酵母菌。

釀酒酵母是成品酒曲的主體酵母菌，采用大米和糯米為基質(zhì)培養(yǎng)酒曲分離到的酵母菌中釀酒酵母仍為主體菌株，在羊羔美酒實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中依然是釀酒酵母為主發(fā)酵菌，它將糖轉(zhuǎn)化為乙醇，符合黃酒發(fā)酵的一般規(guī)律[20]。分子類型Ⅲ即形態(tài)類型4的絲孢酵母，有分解脂肪的能力，且耐酒精度有時(shí)可達(dá)17%以上，因此在發(fā)酵后期酒精濃度很高的條件下仍可以分離到該酵母菌[21]。分子類型Ⅵ即形態(tài)類型14為東方伊薩酵母，劉婷婷[22]在酒曲或出池酒醅中曾分離到此菌株，其結(jié)果表明東方伊薩酵母在42 ℃條件下仍有較好的生長(zhǎng)。在本實(shí)驗(yàn)麥曲制作過(guò)程中有55～60 ℃的高溫階段[23]，另外可能由于其對(duì)發(fā)酵環(huán)境的變化耐受力弱，因此本研究中分離到該菌的數(shù)量很少。形態(tài)類型1、10、12分別為Pichia anomala（異常畢赤酵母）、Rhodotorula mucilaginosa（黏質(zhì)紅酵母）、Cryptococcus albidus（淺白隱球酵母），曹鈺等[24]的研究結(jié)果中也有發(fā)現(xiàn)，但其具體性能還未見(jiàn)報(bào)道，需要進(jìn)一步研究。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)研究了對(duì)羊羔美酒用大曲中酵母菌的多樣性和優(yōu)勢(shì)酵母菌群。共分離到酵母菌474株，形態(tài)聚類和分子鑒定的結(jié)果顯示出羊羔美酒大曲中酵母菌的多樣性。通過(guò)基因序列分析最終鑒定出分屬于6個(gè)屬的6種酵母菌。釀酒酵母為主要優(yōu)勢(shì)菌群。本實(shí)驗(yàn)將傳統(tǒng)酵母菌的形態(tài)學(xué)分析與現(xiàn)在分子技術(shù)相結(jié)合，通過(guò)基因序列分析使菌種鑒定的結(jié)果準(zhǔn)確性和可靠性提高。研究結(jié)果可以反映羊羔美酒大曲中酵母菌的多樣性，為進(jìn)一步研究具有我國(guó)北方特色的地方性名酒風(fēng)味物質(zhì)特征、改進(jìn)傳統(tǒng)的配料和釀造工藝提供參考。

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Diversity and Molecular Biological Identification of Yeast Strains from Yanggaomeijiu Liquor Fermentation Starter (Daqu)

LI Yan1,2, DONG Zhen-ling1, MOU De-hua1,*
(1. College of Bioscience and Bioengineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang 050018, China; 2. Research & Development Center for Fermentation Engineering of Hebei Province, Shijiazhuang 050018, China)

Purpose: The aims of this work were to isolate and identify yeast strains from Yanggaomeijiu liquor fermentation starter (Daqu) and to explore the diversity of yeast in Yanggaomeijiu Daqu. Methods: To analyze Yanggaomeijiu Daqu, multipoint sampling, mixing and grinding the samples, a serial dilution with sterile water, streak plating and single colony picking were used in this study. Conventional microbiological analysis and RFLP analysis of the 5.8S-ITS region were conducted to identify the yeast species. Results: A total of 474 yeast isolates were directly obtained from Yanggaomeijiu Daqu, and they can be divided into 14 different groups by conventional microbiological analyses and into 6 genotypes by RFLP analysis of the 5.8S-ITS region. By gene sequencing, 6 different yeast species belonging to 6 genera were detected in the Daqu samples tested, including Pichia anomala, Saccharomyce cerevisia, Trichosporon asahii, Rhodotorula mucilaginosa, Cryptococcus albidus and Issatchenkia orientalis. Conclusions: The yeast diversity in Yanggaomeijiu Daqu was abundant. Besides Saccharomyce cerevisia, there were various yeast species contributing to various kinds of flavor substances, and the predominant yeast was Saccharomyce cerevisia.

Yanggaomeijiu Daqu; yeast; morphological classification; RFLP analysis of 5.8S rDNA-ITS region

TS261.1

A

1002-6630（2014）05-0144-06

10.7506/spkx1002-6630-201405029

2013-08-27

河北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（C2011208028）；河北省石家莊市科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（101171271A；10117901A）

李艷（1958—），女，教授，本科，研究方向?yàn)轱嬃暇漆勗旒夹g(shù)。E-mail：lymdh5885@163.com

*通信作者：牟德華（1960—），男，教授，本科，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工。E-mail：dh_mou@163.com