湯 曉，方 偉，沈秀麗，方振飛，關(guān)亞璠

（寧波職業(yè)技術(shù)學(xué)院應(yīng)用化工系，浙江 寧波 315800）

多黃酮混合物抗氧化活性的協(xié)同與拮抗作用

湯 曉，方 偉，沈秀麗，方振飛，關(guān)亞璠

（寧波職業(yè)技術(shù)學(xué)院應(yīng)用化工系，浙江 寧波 315800）

以DPPH自由基清除能力、?OH清除能力、總抗氧化性、還原能力等不同機理的氧化還原反應(yīng)為評價指標(biāo)，分析7種黃酮類化合物中的3種以質(zhì)量比1∶1∶1混合后，混合物體外抗氧化活性的協(xié)同與拮抗作用；用高效液相色譜（high-performance liquid chromatography，HPLC）測定黃酮兩兩混合物與DPPH自由基反應(yīng)過程中的結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果表明：4-羰基與2,3-雙鍵對多黃酮混合物相互作用的影響大于B環(huán)鄰二羥基，B環(huán)鄰二羥基對多黃酮混合物相互作用的影響大于B環(huán)僅有一個酚羥基的結(jié)構(gòu)。黃酮之間相互作用的發(fā)生，與氧化還原反應(yīng)中氧化劑的比例和反應(yīng)時間有關(guān)，只有當(dāng)氧化劑比例以及反應(yīng)時間達到某一程度，黃酮之間的相互作用才開始發(fā)生。在此之前，抗氧化性更強的黃酮組分先被氧化。

多黃酮；抗氧化活性；協(xié)同作用；拮抗作用；結(jié)構(gòu)變化

黃酮類化合物泛指由兩個苯環(huán)通過中央三碳鏈相互連接而成的一系列化合物，它們廣泛存在于谷物、蔬菜、水果、紅酒、綠茶等食品中。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，黃酮類化合物具有抗心律失常、軟化血管、降血糖血脂、殺菌、消炎、抗癌等作用；它們還是一種天然抗氧化劑，具有清除超氧陰離子自由基、脂質(zhì)自由基、?OH、抗衰老、增加機體免疫力等生理活性[1-5]。

黃酮結(jié)構(gòu)中，B環(huán)鄰二羥基、2,3-雙鍵與4-羰基以及3,5-羥基是決定其抗氧化活性的重要因素[6]。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)某些結(jié)構(gòu)的黃酮共存時，混合物的抗氧化活性顯著增強（協(xié)同作用）或減弱（拮抗作用），因此，研究不同結(jié)構(gòu)黃酮共存后抗氧化活性的變化，可為設(shè)計含此類天然抗氧化劑的補給膳食或強化膳食，以及功能性食品提供科學(xué)依據(jù)。

目前，對于不同結(jié)構(gòu)黃酮共存后的相互作用對混合物抗氧化活性影響的研究仍然較少，而且往往采用單一的抗氧化指標(biāo)加以評價[7-17]，由于黃酮類化合物抗氧化活性的評價取決于自由基性質(zhì)以及特定反應(yīng)機理[18-20]，因此，單一指標(biāo)并不能確保對黃酮抗氧化活性相互作用判斷的準(zhǔn)確性。此外，亦很少有研究關(guān)注黃酮混合物參與抗氧化反應(yīng)過程中的結(jié)構(gòu)變化[19]，因此，對該類化合物相互作用的反應(yīng)機理仍有待進一步探討。本實驗前期研究中以DPPH自由基清除能力、?OH清除能力、總抗氧化性、還原能力等為評價指標(biāo)，探討了9種抗氧化性較強的黃酮單品兩兩混合后抗氧化活性的變化[21]。本研究進一步以上述黃酮兩兩混合物中抗氧化活性相對較強，同時協(xié)同作用或拮抗作用與其他混合物相比更加顯著的混合物為對象，增加黃酮組分，探討黃酮以質(zhì)量比1∶1∶1混合后，混合物抗氧化活性的變化，并探討黃酮兩兩混合物在抗氧化反應(yīng)過程中的結(jié)構(gòu)改變，以期明確黃酮類化合物相互作用的反應(yīng)機理，為進一步應(yīng)用于食品的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

槲皮素（110802）、表兒茶素（110920）、楊梅素（110922）、異槲皮苷（110927）、山萘酚（111013）、芹菜素（130224）、兒茶素（130302），上述標(biāo)準(zhǔn)品均為色譜純（純度＞98%） 上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司；乙腈、乙酸為色譜純；其余試劑為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV759紫外-可見分光光度計 上海精密科學(xué)儀器有限公司；LC-20AT高效液相色譜儀 島津中國上海分公司。

1.3 方法

1.3.1 DPPH自由基清除能力的測定

按Blois等[22]的方法，3種黃酮標(biāo)準(zhǔn)品按質(zhì)量比1∶1∶1混合。結(jié)果以對DPPH自由基的清除率達到50%的EC50值（μg/mL）表示[14]。

式中：EC50A、EC50B、EC50C分別為3種黃酮的EC50值。

1.3.2 ?OH清除能力的測定

按Smirnoff等[23]的方法，3種黃酮標(biāo)準(zhǔn)品按質(zhì)量比1∶1∶1混合。結(jié)果以對?OH的清除率達到50%的EC50值（μg/mL）表示。

?OH清除能力差異的計算方法同式（1）。

1.3.3 總抗氧化性的測定

按Prieto等[24]的方法，3種黃酮標(biāo)準(zhǔn)品按質(zhì)量比1∶1∶1混合。結(jié)果以695 nm波長處的吸光度表示。

式中：A為混合物的吸光度；A1、A2、A3分別為3種黃酮的吸光度。

1.3.4 還原能力的測定

按Oyaizu等[25]的方法，3種黃酮標(biāo)準(zhǔn)品按質(zhì)量比1∶1∶1混合。結(jié)果以700 nm波長處的吸光度表示。

還原能力差異的計算方法同式（2）。

1.3.5 黃酮的結(jié)構(gòu)鑒定

按Apáti等[26]的方法進行測定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 DPPH自由基清除能力

前期已選取槲皮素、異槲皮苷、楊梅素、山萘酚等黃酮醇類，飛燕草素-3-O-葡萄糖苷、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷等花青素類，兒茶素、表兒茶素等黃烷醇類，芹菜素等黃酮類，探討這些黃酮兩兩混合后抗氧化活性的相互作用。結(jié)果表明，槲皮素與異槲皮苷、槲皮素與山萘酚、槲皮素與兒茶素、表兒茶素與楊梅素、表兒茶素與芹菜素、表兒茶素與槲皮素、表兒茶素與兒茶素、表兒茶素與異槲皮苷、楊梅素與槲皮素、楊梅素與兒茶素、楊梅素與異槲皮苷等組合與其他的黃酮兩兩混合物相比，協(xié)同作用或拮抗作用更加顯著（與理論加和值的差異大），且抗氧化活性相對較強[21]。此外，這些組合的組成成分彼此有一定關(guān)聯(lián)（如楊梅素與槲皮素、楊梅素與異槲皮苷、槲皮素與異槲皮苷，互為構(gòu)成的組分），因此，在這些組合基礎(chǔ)上，進一步將黃酮組分增加為3種（如槲皮素＋異槲皮苷＋楊梅素），確定了10種新的組合，按質(zhì)量比1∶1∶1混合后，混合物DPPH自由基清除能力如表1所示。

表1 黃酮混合物對DPPH自由基的清除能力Table 1 DPPH scavenging activities of flavonoid mixtures

當(dāng)黃酮兩兩混合時，槲皮素與異槲皮苷、槲皮素與表兒茶素組合均呈現(xiàn)較強拮抗作用；而當(dāng)這3種黃酮共存后，卻呈協(xié)同作用。表兒茶素、兒茶素與楊梅素混合后亦呈協(xié)同作用；而這3種黃酮的兩兩組合卻均呈拮抗作用。在楊梅素、槲皮素與表兒茶素，楊梅素、槲皮素與兒茶素，以及楊梅素、異槲皮苷與表兒茶素組合中，組成的3種黃酮兩兩之間基本呈拮抗作用；然而，3種黃酮混合后的相互影響卻并不顯著（P＞0.05）。但是，槲皮素、異槲皮苷與楊梅素組合卻仍呈現(xiàn)顯著的拮抗作用，混合物DPPH自由基清除能力與理論加和值的差異達35.55%。槲皮素與山萘酚、表兒茶素與芹菜素組合呈現(xiàn)較強協(xié)同作用；當(dāng)槲皮素、山萘酚與表兒茶素，表兒茶素、芹菜素與兒茶素，以及表兒茶素、芹菜素與槲皮素共存后，混合物也均呈協(xié)同作用。

2.2 ?OH清除能力

表2 黃酮混合物對·OH的清除能力Table 2 Hydroxyl radical scavenging activities of flavonoid mixtures

如表2所示，與DPPH自由基清除能力不同的是，這些組合的?OH清除能力幾乎都呈拮抗作用。其中，槲皮素、異槲皮苷與表兒茶素組合的?OH清除能力與理論加和值之間的差異達59.25%。盡管槲皮素與山萘酚兩兩混合時的?OH清除能力呈協(xié)同作用[21]，但槲皮素、山萘酚與表兒茶素，以及槲皮素、山萘酚與異槲皮苷組合卻均呈現(xiàn)較強拮抗作用。

2.3 總抗氧化性

表3 黃酮混合物的總抗氧化性Table 3 Total antioxidant capacities of flavonoid mixturesTable 3 Total antioxidant capacities of flavonoid mixtures

如表3所示，在表兒茶素、兒茶素與楊梅素，以及表兒茶素、兒茶素與芹菜素等組合中，盡管表兒茶素或兒茶素與其他黃酮兩兩混合時的總抗氧化性多呈拮抗作用[21]，但加入第3種黃酮組分后，混合物的總抗氧化性卻未受拮抗作用影響。

2.4 還原能力

如表4所示，多數(shù)混合物的還原能力與理論加和值相比，并無顯著差異，而組成的3種黃酮兩兩混合后，卻多呈協(xié)同作用[21]。

表4 黃酮混合物的還原能力Table 4 Reducing power of flavonoid mixtures

2.5 抗氧化反應(yīng)中的黃酮結(jié)構(gòu)變化

黃酮混合物抗氧化活性的協(xié)同與拮抗作用，可能與黃酮之間的氫鍵締合等相互反應(yīng)有關(guān)[9,18]，但目前，鮮有文獻報道黃酮相互反應(yīng)的結(jié)構(gòu)變化。本實驗以槲皮素與異槲皮苷組合為對象，通過調(diào)整黃酮混合物溶液與DPPH自由基溶液的體積比以及反應(yīng)時間，探求黃酮間相互作用的機理與條件。

圖1 1 m（槲皮素）::m（異槲皮苷）=1:3混合物與DPPH自由基溶液在不同體積比下的HPLC圖HPLCFig.1 HPLC analysis of reaction products from quercetin-isoquercetin mixture (1 : 3, m/m) and DPPH at different ratios

前期研究已發(fā)現(xiàn)，槲皮素與異槲皮苷組合的DPPH自由基清除能力在黃酮兩兩混合物中為最高，且具有顯著拮抗作用，當(dāng)m（槲皮素）∶m（異槲皮苷）=1∶3混合時，拮抗作用最強[21]。調(diào)整m（槲皮素）∶m（異槲皮苷）=1∶3混合物與DPPH的比例，使V（黃酮混合物）∶V（DPPH自由基）從10∶1下降到1∶10。圖1為m（槲皮素）∶m（異槲皮苷）=1∶3混合物與DPPH自由基溶液不同體積比條件下反應(yīng)5 min時的高效液相色譜圖，當(dāng)V（黃酮混合物）∶V（DPPH自由基）為10∶1時，槲皮素結(jié)構(gòu)（標(biāo)準(zhǔn)品保留時間約為14 min）未發(fā)生顯著變化；異槲皮苷（標(biāo)準(zhǔn)品保留時間約為6 min）則在相鄰保留時間內(nèi)出現(xiàn)兩峰；當(dāng)V（黃酮混合物）∶V（DPPH自由基）從10∶1逐漸下降至1∶1，異槲皮苷峰逐漸減小，直至消失（V（黃酮混合物）∶V（DPPH自由基）=1∶1時）。當(dāng)V（黃酮混合物）∶V（DPPH自由基）=1∶2時，槲皮素峰消失，原異槲皮苷保留時間處再次出峰；當(dāng)V（黃酮混合物）∶V（DPPH自由基）=1∶10時，槲皮素、異槲皮苷峰均消失，在約26 min處出一峰。

當(dāng)m（槲皮素）:m（異槲皮苷）=1∶3混合物溶液與DPPH自由基溶液體積比以10∶1混合時，不同反應(yīng)時間的結(jié)構(gòu)變化如圖2所示。黃酮混合物與DPPH自由基溶液混合反應(yīng)5 min，異槲皮苷在相鄰保留時間內(nèi)出現(xiàn)兩峰；反應(yīng)10 min后，槲皮素、異槲皮苷峰消失，在約26 min處出現(xiàn)一較大峰，在約42 min處亦有一峰；反應(yīng)15 min后，原有兩峰消失，在12 min內(nèi)出現(xiàn)較多峰。

圖2 2 m（槲皮素）::m（異槲皮苷）=1=1∶3混合物與DPPH自由基體積比溶液1010∶1條件下反應(yīng)不同時間后的HPLC圖HPLCFig.2 HPLC analysis of reaction products from quercetin-isoquercetin mixture (1 : 3) and DPPH after different reaction times (the ratio of flavonoid mixture to DPPH= 10:1)

3 討 論

3.1 黃酮結(jié)構(gòu)對多黃酮混合物抗氧化活性的影響

前期研究表明，楊梅素、槲皮素、異槲皮苷、兒茶素、表兒茶素等含較多B環(huán)羥基的黃酮兩兩混合后更易發(fā)生拮抗作用[21]。但是，多黃酮混合物（質(zhì)量比1∶1∶1）的抗氧化活性，并非是黃酮兩兩混合物作用的簡單疊加，其相互影響仍與組成的黃酮結(jié)構(gòu)有關(guān)。

DPPH自由基與?OH清除是黃酮類化合物清除自由基能力的表征，而總抗氧化性與還原能力是黃酮還原金屬離子能力的表征。其中，?OH清除的反應(yīng)機理為氫原子轉(zhuǎn)移，其他3種方法的機理為單電子轉(zhuǎn)移[14]。在不同機理的實驗中發(fā)現(xiàn)兒茶素或表兒茶素在黃酮兩兩混合物中的拮抗作用，可能會由于其他黃酮的介入，而在多黃酮混合物中被減弱。例如，在槲皮素、異槲皮苷與表兒茶素組合中，盡管表兒茶素與槲皮素混合物的總抗氧化性呈現(xiàn)較強拮抗作用[21]，但加入異槲皮苷后，多黃酮的總抗氧化性卻呈協(xié)同作用（表3）；而表兒茶素與槲皮素混合物DPPH自由基清除能力的拮抗作用，表兒茶素與異槲皮苷混合物還原能力的協(xié)同作用，均未在槲皮素、異槲皮苷與表兒茶素組合中得以體現(xiàn)（表1、4）。同理，在楊梅素、槲皮素與兒茶素組合中，兒茶素與槲皮素、兒茶素與楊梅素混合物DPPH自由基清除能力的拮抗作用，兒茶素與槲皮素混合物?OH以及還原能力的拮抗作用[21]，均未在楊梅素、槲皮素與兒茶素組合中得以體現(xiàn)（表1、2、4）。在表兒茶素、兒茶素與芹菜素，以及表兒茶素、兒茶素與楊梅素組合中，表兒茶素與兒茶素之間的拮抗作用[21]，也未對多黃酮混合物的抗氧化活性產(chǎn)生顯著影響（表1、3、4）。在不含兒茶素、表兒茶素的多黃酮組合中，情況則不同。如槲皮素、異槲皮苷與楊梅素組合的DPPH自由基清除能力呈拮抗作用，總抗氧化性呈協(xié)同作用（幾乎達100%），而這3種黃酮兩兩混合后的DPPH自由基清除能力亦呈拮抗作用，總抗氧化性也呈現(xiàn)較強協(xié)同作用[21]。

比較兒茶素、表兒茶素與其他5種黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)可知，這兩種黃酮缺乏4-羰基與2,3-雙鍵，由此推測，對黃酮抗氧化活性影響較大的結(jié)構(gòu)中，4-羰基與2,3-雙鍵對多黃酮混合物相互作用的影響可能大于B環(huán)鄰二羥基。此外，山萘酚對黃酮兩兩混合物的協(xié)同作用，可能會由于除兒茶素、表兒茶素外的其他黃酮的介入（如槲皮素、異槲皮苷與山萘酚組合），而在多黃酮混合物中被減弱（表1、2）。由此推測，B環(huán)鄰二羥基對多黃酮混合物相互作用的影響大于B環(huán)僅有一個酚羥基的結(jié)構(gòu)。

3.2 抗氧化反應(yīng)試劑與時間對黃酮混合物結(jié)構(gòu)變化的影響

DPPH反應(yīng)所用試劑簡單，對黃酮結(jié)構(gòu)變化測定的干擾因素較少。在槲皮素與異槲皮苷1∶3混合物與DPPH自由基不同比例的反應(yīng)中，提高DPPH自由基比例，抗氧化性更強的異槲皮苷首先發(fā)揮抗氧化功能，結(jié)構(gòu)逐漸發(fā)生變化（圖1）。當(dāng)V（黃酮混合物）∶V（DPPH自由基）= 1∶2時，黃酮混合物的抗氧化壓力增大，槲皮素結(jié)構(gòu)亦發(fā)生改變，槲皮素峰消失，而異槲皮苷原保留時間處再次出峰，推測槲皮素在氧化釋放電子的過程中，可能促進了異槲皮苷的再生。當(dāng)V（黃酮混合物）∶V（DPPH自由基）=1∶10時，在約26 min處出一峰，推測可能為槲皮素、異槲皮苷發(fā)生氫鍵締合后的產(chǎn)物；對照圖2可見，當(dāng)V（黃酮混合物）∶V（DPPH自由基）=10∶1混合反應(yīng)時間增至10 min，亦在約26 min處出一峰。由此推測，當(dāng)黃酮混合物與DPPH自由基發(fā)生氧化還原反應(yīng)時，氧化劑（DPPH自由基）達到一定比例，或是反應(yīng)達到一定時間，黃酮之間才開始發(fā)生相互作用，當(dāng)反應(yīng)時間進一步延長，黃酮間相互作用的產(chǎn)物再次發(fā)生改變。

4 結(jié) 論

多黃酮混合物抗氧化活性的相互作用，與黃酮兩兩混合后的相互影響并無一定關(guān)聯(lián)，而仍與黃酮結(jié)構(gòu)有關(guān)。黃酮結(jié)構(gòu)中，4-羰基與2,3-雙鍵對多黃酮混合物相互作用的影響可能大于B環(huán)鄰二羥基，而B環(huán)鄰二羥基對混合物相互作用的影響則大于B環(huán)僅有一個酚羥基的結(jié)構(gòu)。DPPH自由基清除實驗表明，黃酮類化合物之間相互作用的發(fā)生，與氧化還原反應(yīng)中氧化劑的比例和反應(yīng)時間有關(guān)，當(dāng)氧化劑比例以及反應(yīng)時間達到某一程度，相互作用才開始發(fā)生，在此之前，抗氧化性更強的黃酮組分先被氧化。

由于食品中的黃酮組分更加復(fù)雜，富含黃酮的食品之間抗氧化活性的相互作用仍有待進一步研究。此外，黃酮混合物在抗氧化反應(yīng)中的結(jié)構(gòu)變化，仍無法完全闡釋清楚，需要借助其他測試手段進一步加以補充。

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Synergism and Antagonism of Flavonoid Mixtures on Antioxidant Capacities

TANG Xiao, FANG Wei, SHEN Xiu-li, FANG Zhen-fei, GUAN Ya-fan
(Department of Chemical Engineering, Ningbo Polytechnic College, Ningbo 315800, China)

This study investigated antioxidant activities of 1:1:1 (m/m) mixtures of three selected from seven flavonoid compounds to evaluate their synergism and antagonism in vitro. 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging activity, hydroxyl radical scavenging activity, total antioxidant activity and reducing power were used as evaluation indicators under different redox reaction mechanisms. HPLC method was used to analyze the structural change of binary flavonoid mixtures during DPPH scavenging reaction. The results indicated that the 2,3-double bond and the 4-oxo had stronger influence on the interactions of mixed flavonoids than the o-dihydroxy structure in the B-ring, and this o-dihydroxy structure had stronger influence than single hydroxy structure in the B-ring. HPLC analysis indicated that the occurrence of interaction among flavonoids was related to reaction time and the ratio of reducing agents in the redox reaction, which can happen only when both conditions reach the required levels. Before that, the component with stronger antioxidant activity in flavonoid mixtures was firstly oxidized.

mixed flavonoids; antioxidant activity; synergism; antagonism; structural change

TS201.2

A

1002-6630（2014）05-0111-05

10.7506/spkx1002-6630-201405022

2013-09-03

浙江省教育廳2013年度科研計劃項目（Y201326641）

湯曉（1981—），女，講師，碩士，研究方向為黃酮類化合物的提取與應(yīng)用。E-mail：laymantang@126.com