■劉娜娜 劉長(zhǎng)軍 李紅軍 傅玲琳 王彥波

（1.浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江杭州310018；2.象山縣水產(chǎn)技術(shù)推廣站，浙江象山315700；3.杭州天農(nóng)生物營(yíng)養(yǎng)技術(shù)有限公司，浙江杭州311107）

益生菌的概念最早由Lilly和Stillwell提出，他們認(rèn)為益生菌是由一種微生物產(chǎn)生的物質(zhì)，并能夠刺激另一種微生物的生長(zhǎng)，這種作用與抗生素恰好相反。隨后Parker（1974）將益生菌定義為能夠平衡和促進(jìn)腸道微生態(tài)的一類微生物，然而這個(gè)定義并沒(méi)有很好地與抗生素區(qū)分。Fuller（1987）又對(duì)益生菌進(jìn)行了描述，即它是一種活的微生物飼料添加劑，能夠改善腸道菌群的平衡從而對(duì)宿主動(dòng)物產(chǎn)生有益影響。Kozasa首次將益生菌應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中，使得益生菌更為廣泛地被推廣，其概念的外延也得到了擴(kuò)展。目前，一般認(rèn)為益生菌是一種活性微生物或微生物制劑，可以通過(guò)改善水產(chǎn)動(dòng)物等宿主腸道內(nèi)微生態(tài)平衡或調(diào)節(jié)宿主黏膜與免疫系統(tǒng)功能來(lái)提高宿主的免疫力，最終有利于宿主健康。常見的水產(chǎn)動(dòng)物飼料中益生菌種類主要包括乳酸菌、芽孢桿菌、酵母等。

1 水產(chǎn)動(dòng)物飼料中益生菌的應(yīng)用概述

隨著水產(chǎn)動(dòng)物飼料中抗生素等化學(xué)藥物的應(yīng)用帶來(lái)的負(fù)面作用日益突出，如何有效地提高水產(chǎn)動(dòng)物的免疫力和對(duì)疾病的抵抗力成為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵和研發(fā)熱點(diǎn)。由于具有使用安全和方便等優(yōu)點(diǎn)，益生菌被逐漸應(yīng)用于魚類、甲殼類等水產(chǎn)動(dòng)物飼料中，并取得了一定的成績(jī)。如嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）應(yīng)用于尼羅羅非魚養(yǎng)殖中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，羅非魚的生長(zhǎng)及成活率都有所提高，并且可以顯著抵抗病原菌海豚鏈球菌（Streptococcusiniae）的感染。剖析原因主要是由于嗜酸乳桿菌通過(guò)在細(xì)胞表面螯合元素鐵，使得海豚鏈球菌無(wú)法利用鐵，從而抑制了其生長(zhǎng)繁殖。在甲殼類水產(chǎn)動(dòng)物中，益生菌可以通過(guò)增強(qiáng)其免疫力來(lái)提高其成活率，如芽孢桿菌類制劑飼喂斑節(jié)對(duì)蝦后，與對(duì)照組比較成活率顯著升高，究其原因，與飼喂益生菌后斑節(jié)對(duì)蝦血淋巴吞噬作用顯著增強(qiáng)、體內(nèi)酚氧化酶和抗菌活性顯著提高，進(jìn)而增強(qiáng)蝦的細(xì)胞免疫和體液免疫競(jìng)爭(zhēng)性排斥病原菌有關(guān)。此外，芽孢桿菌制劑飼喂凡納濱對(duì)蝦后同樣發(fā)現(xiàn)其成活率顯著升高，進(jìn)一步研究表明，成活率的顯著升高與此類芽孢桿菌改善凡納濱對(duì)蝦腸道內(nèi)微環(huán)境、調(diào)節(jié)腸道中菌群的生長(zhǎng)和平衡有關(guān)。由此可見，益生菌的作用方式并不固定，與動(dòng)物種類、飼喂方式、菌種類別等均有關(guān)，從另一方面來(lái)講這就增加了相關(guān)研究的難度。

盡管益生菌在水產(chǎn)動(dòng)物飼料中得到了日益廣泛的應(yīng)用，但是目前仍然有許多問(wèn)題需要進(jìn)一步研究。如在定向篩選某種益生菌菌種時(shí)，要注意菌株的選育和培養(yǎng)條件對(duì)其特性的影響，這是因?yàn)榧词箤?duì)于同一種菌株，選育目標(biāo)和培養(yǎng)條件不同，菌株諸如胞外活性物質(zhì)的分泌能力、腸道中的穩(wěn)定定植時(shí)間等也不盡相同。研究還證實(shí)，不能單純根據(jù)益生菌在體外試驗(yàn)中得到的結(jié)果來(lái)預(yù)測(cè)其在水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)的效果。如以大西洋鮭為研究對(duì)象，體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)益生菌熒光假單胞菌具有顯著拮抗有害菌殺鮭氣單胞菌的作用，但是體內(nèi)試驗(yàn)的結(jié)果卻表明，對(duì)于由殺鮭氣單胞菌引起的大西洋鮭感染病沒(méi)有效果。所以，在水產(chǎn)動(dòng)物飼料中應(yīng)用的益生菌，應(yīng)該根據(jù)具體的養(yǎng)殖動(dòng)物和實(shí)際使用情況來(lái)定向篩選和研發(fā)，也只有這樣益生菌才能發(fā)揮出其應(yīng)有的效果。

2 不同品種水產(chǎn)動(dòng)物飼料中益生菌的應(yīng)用研究

近年來(lái)，不同品種水產(chǎn)動(dòng)物（魚類、甲殼類和其他水產(chǎn)動(dòng)物）飼料中益生菌的應(yīng)用研究參見表1。由表1可見，盡管益生菌菌株各異，但是絕大多數(shù)研究表明在飼料中添加和使用，均可以顯著改善水產(chǎn)動(dòng)物的免疫和生長(zhǎng)性能，提高對(duì)于病原微生物的抵抗力，降低死亡率，最終改善生產(chǎn)性能，這也是益生菌在水產(chǎn)動(dòng)物飼料中應(yīng)用日益廣泛的直接原因。同時(shí)在應(yīng)用過(guò)程中也要注意益生菌的用量、穩(wěn)定性和使用方式，以及針對(duì)不同的水產(chǎn)動(dòng)物研究制定包括使用最佳時(shí)間和用量等在內(nèi)的相應(yīng)配套的應(yīng)用規(guī)范和標(biāo)準(zhǔn)，避免盲目的應(yīng)用導(dǎo)致的益生菌失效。

3 水產(chǎn)動(dòng)物飼料中益生菌的作用機(jī)制

3.1 產(chǎn)生抑菌和抗菌物質(zhì)

益生菌在自身生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生細(xì)菌素等代謝產(chǎn)物，這類具有抑菌活性的蛋白質(zhì)或小肽對(duì)于產(chǎn)生菌本身沒(méi)有作用，但是可以通過(guò)其特有的方式抑制或者拮抗其他菌株，一種方式是通過(guò)結(jié)合脂質(zhì)Ⅱ（糖肽亞基在細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)之間的主要載體）阻止細(xì)胞壁的合成而導(dǎo)致細(xì)胞死亡；另一種方式是脂質(zhì)Ⅱ插入到細(xì)胞膜中形成孔道，使細(xì)胞膜發(fā)生去極化和三磷酸腺苷（ATP）泄露，而此時(shí)胞外的水分子進(jìn)入細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生自溶而死亡，如乳酸鏈球菌素（Nisin）就采用此類抑菌方式。此外，還有一類熱穩(wěn)定小肽類非羊毛硫細(xì)菌素，也是通過(guò)膜透化作用而引起胞內(nèi)物質(zhì)泄漏并最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。而對(duì)于大分子溶菌蛋白如葡萄球菌溶菌素（Lysostaphin），則通過(guò)作用于目標(biāo)抑制/拮抗菌的細(xì)胞壁，從而導(dǎo)致細(xì)胞壁的溶解和最終的細(xì)胞死亡。

3.2 競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及黏附位點(diǎn)

益生菌可通過(guò)與病原菌競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，形成“優(yōu)勢(shì)菌群”，從而抑制病原菌的生長(zhǎng)繁殖。如細(xì)菌在生長(zhǎng)過(guò)程中需要鐵，而鐵在動(dòng)物體液和組織中的量是有限的且是多以不溶解的Fe3+存在。熒光假單胞菌作為益生菌可以通過(guò)分泌鐵載體，提高對(duì)鐵的利用率進(jìn)而與病原菌鰻弧菌爭(zhēng)奪游離的鐵離子，最終達(dá)到抑制該菌生長(zhǎng)的目的。益生菌通過(guò)黏附、定植在水產(chǎn)動(dòng)物腸道黏膜上，并形成一層厚的菌群膜，通過(guò)這種方式與病原菌競(jìng)爭(zhēng)黏附位點(diǎn)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而形成的菌群膜可以阻止病原菌的入侵，進(jìn)而達(dá)到抑制病原菌的作用。研究表明，參與與病原菌競(jìng)爭(zhēng)黏附位點(diǎn)的主要是益生菌的S-層蛋白、脂磷壁酸和胞外多糖等。如乳酸菌的S-層蛋白含有大量的疏水性氨基酸，不易被水等溶劑溶解，因此有助于乳酸菌與病原菌競(jìng)爭(zhēng)黏附位點(diǎn)，此外乳酸菌的胞外多糖可作為宿主配體或病原菌凝集素，對(duì)某些細(xì)菌在腸上皮細(xì)胞黏附過(guò)程中產(chǎn)生一定的屏障作用，可以導(dǎo)致病原菌因不能黏附在宿主細(xì)胞上而缺少生長(zhǎng)空間死亡。再如脂磷壁酸是益生菌雙歧桿菌細(xì)胞外的主要疏水成分，能夠在自身表面形成一種微毛結(jié)構(gòu)，同時(shí)脂磷壁酸由于具有等電點(diǎn)低的特點(diǎn)，可使自身表面分布較多的負(fù)電荷，而雙歧桿菌與受體細(xì)胞黏附的要點(diǎn)就是利用這種靜電作用，因此可以與病原菌競(jìng)爭(zhēng)黏附位點(diǎn)。

3.3 改善機(jī)體免疫功能

在水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖中，益生菌被作為飼料中免疫調(diào)節(jié)劑日益受到重視。在魚類養(yǎng)殖中，益生菌可以刺激先天性免疫和細(xì)胞免疫，包括增加紅細(xì)胞壓積，增強(qiáng)吞噬細(xì)胞、溶菌酶、超氧化物歧化酶以及過(guò)氧化酶等的活性。對(duì)于蝦類養(yǎng)殖來(lái)說(shuō)，益生菌可以改善蝦的肝體指數(shù)、酚氧化酶以及超氧化物歧化酶等活性，最終提高蝦的免疫力和對(duì)疾病的抵抗力。近期研究表明，益生菌免疫調(diào)節(jié)的機(jī)制與動(dòng)物腸道上皮細(xì)胞或某些特異腸道微生物有關(guān)。益生菌在進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)時(shí)先黏附于宿主腸道上皮細(xì)胞（IECs），然后靶向識(shí)別其表面的受體，進(jìn)而開始一系列的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，其中包括調(diào)節(jié)細(xì)胞間信號(hào)核因子κB的功能、加強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞的活力以及改善腸道微生態(tài)平衡。如益生菌嗜酸乳桿菌可增加結(jié)腸黏液細(xì)胞數(shù)量和黏蛋白數(shù)量，促進(jìn)黏蛋白MUC2的表達(dá)進(jìn)而穩(wěn)定腸道屏障功能；而益生菌雙歧桿菌可降低白介素（IL-6和IL-8）等促炎因子，進(jìn)而降低腸道通透性以對(duì)腸道黏膜發(fā)揮保護(hù)作用。

表1 益生菌在魚類飼料中的應(yīng)用研究

3.4 促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收

益生菌在水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)定植后可以產(chǎn)生消化酶，從而協(xié)同動(dòng)物內(nèi)源酶共同消化和降解飼料中的蛋白質(zhì)、脂肪和碳水化合物等，促進(jìn)宿主對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和代謝，改善飼料的消化率和提高飼料利用率，最終促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育。此外，大部分益生菌自身含有多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，例如光合細(xì)菌中含有較為豐富的蛋白質(zhì)、維生素、鈣、磷和輔酶Q10等，酵母中同樣含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素和微量元素，并含有消化酶和一些未知的生長(zhǎng)刺激因子。此外，近期研究發(fā)現(xiàn)，益生菌可以通過(guò)與宿主細(xì)胞和腸道土著菌的相互作用，促進(jìn)水產(chǎn)動(dòng)物自身消化酶的分泌，相關(guān)機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究。

4 水產(chǎn)動(dòng)物飼料中益生菌的應(yīng)用前景

在廣泛推廣益生菌的同時(shí)，在水產(chǎn)動(dòng)物飼料中應(yīng)用也面臨著現(xiàn)實(shí)的困惑，目前仍有許多研究者對(duì)益生菌菌株的安全性提出質(zhì)疑，他們認(rèn)為益生菌可能由于自身含有的一些條件性可編碼致病性、耐抗生素基因而引發(fā)安全性事件，而且一旦存在這類基因，可以通過(guò)水平轉(zhuǎn)移在菌間和菌外傳播。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)和檢測(cè)手段的不斷進(jìn)步，益生菌菌株的全基因測(cè)序和分析成為了可能，隨著基因譜圖的不斷研究和后基因組時(shí)代功能基因的剖析，這一問(wèn)題將會(huì)被解決。盡管相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道乳酸菌作為益生菌在水產(chǎn)動(dòng)物飼料中是最常用的類別，但是研究發(fā)現(xiàn)，并不是所有的乳酸菌菌株都適合用作益生菌生產(chǎn)，需要綜合考慮菌株的特性和生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)性。此外，目前隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，益生菌菌株的數(shù)量或者活力均有所下降，造成了應(yīng)用效果的不穩(wěn)定，因此定向篩選技術(shù)和穩(wěn)定保存技術(shù)也需要進(jìn)一步研究，可結(jié)合分子遺傳育種學(xué)和途徑工程在菌株誘變和選育上更加突出針對(duì)性和功能性，可通過(guò)菌株理化特性和生化代謝分析，研發(fā)長(zhǎng)期穩(wěn)定保存過(guò)程中相應(yīng)的保護(hù)劑或者保存技術(shù)。由此可見，水產(chǎn)動(dòng)物飼用益生菌的研究是一個(gè)系統(tǒng)工程，需要借助于多學(xué)科的理論知識(shí)和現(xiàn)代先進(jìn)技術(shù)的發(fā)展，旨在為可持續(xù)的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)提供一定理論和技術(shù)支撐，實(shí)現(xiàn)水產(chǎn)品的安全生產(chǎn)。

表2 益生菌在甲殼類動(dòng)物飼料中的應(yīng)用研究

表3 益生菌在其他水產(chǎn)動(dòng)物飼料中的應(yīng)用研究

（參考文獻(xiàn)43篇，刊略，需者可函索）