李志海
胃癌細胞多藥耐藥相關(guān)基因的表達與其侵襲轉(zhuǎn)移能力的相關(guān)性研究
李志海
目的探討胃癌細胞株BGC-823、SGC-7901的多藥耐藥相關(guān)基因的表達與其侵襲轉(zhuǎn)移能力的關(guān)系。方法采用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測胃癌細胞株BGC-823、SGC-7901的多藥耐藥相關(guān)基因(包括ABCB1、MMP2、CDH1、CD44)的mRNA表達水平。采用細胞劃痕實驗、Transwell遷徙實驗評價兩株胃癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力,進而探討胃癌細胞多藥耐藥相關(guān)基因的表達與侵襲轉(zhuǎn)移能力的關(guān)系。結(jié)果熒光定量PCR實驗發(fā)現(xiàn)胃癌細胞株BGC-823的ABCB1、CDH1、CD44基因表達較SGC-7901高,而MMP2基因的表達在SGC-7901中較高。細胞劃痕實驗及Transwell遷徙實驗顯示胃癌細胞株BGC-823的遷徙能力比SGC-7901強。結(jié)論胃癌細胞的多藥耐藥與侵襲轉(zhuǎn)移有一定的關(guān)系,CD44的高表達在胃癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移中可能起主要作用。
多藥耐藥;侵襲轉(zhuǎn)移;ABCB1;MMP2;CDH1;CD44
胃癌是目前最為常見的惡性腫瘤之一,隨著新的化療藥物的不斷出現(xiàn),化療對胃癌的療效較以往有了顯著提高。然而大部分病人最終因腫瘤細胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性而使化療失敗,并常伴有侵襲轉(zhuǎn)移能力增強而導(dǎo)致病人最后死亡。腫瘤的化療多藥耐藥(multidrug resistance,MDR)和侵襲轉(zhuǎn)移(invasion/metastasis)成為了目前腫瘤治療中的兩大難題。為了克服化療耐藥性,減少腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的發(fā)生,眾多學(xué)者在過去的幾十年一直致力于對兩者關(guān)系的研究。本研究選取在癌細胞多藥耐藥與侵襲轉(zhuǎn)移中起重要作用的E-鈣粘蛋白[1](CDH1基因編碼)、金屬基質(zhì)蛋白酶-2(MMP-2基因編碼)[2]及與多藥耐藥密切相關(guān)的P-糖蛋白(MDR1基因編碼)[3]和CD44[4]等四個基因為對象,進一步在人胃癌細胞株上尋找有關(guān)腫瘤多藥耐藥和侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)性的證據(jù)。
一、材料
細胞人胃癌細胞株BGC-823、SGC-7901;購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。
其他材料細胞培養(yǎng)使用的DMEM培養(yǎng)基干粉購自GIBCO Life Technology公司(Grand Island,NY);DMEM培養(yǎng)基按GIBCO配方自制;小牛血清購自Hyclone公司;Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司;細胞培養(yǎng)板購自BD Falcon公司(BD Biosciences)。用于Western blot分析的抗體Anti-periostin抗體由國外合作實驗室提供;Horseradish peroxidase-conjugated IgG抗體購自美國Zymed公司(San Francisco,CA);其它抗體均購自Santa Cruz公司(Santa Cruz,CA);聚偏二氟乙烯膜(PVDF)購自Millipore公司;蛋白質(zhì)分子量標準分別購自Invitrogen或MBI公司。
二、細胞培養(yǎng)
本文選用的細胞都是貼壁細胞,細胞培養(yǎng)在DMEM完全培養(yǎng)基或?qū)嶒炛刑厥庠O(shè)計的培養(yǎng)基中,37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中通氣培養(yǎng)。通常當細胞生長密度到達80%~90%時,需要傳代,首先將培養(yǎng)液吸去。加入適量胰酶消化溶液,使其均勻覆蓋細胞層,室溫放置1~2 min,吸去胰酶消化溶液。待細胞從培養(yǎng)皿上脫落下來后,加入少量培養(yǎng)液終止胰酶的作用,并用移液管數(shù)次吹打細胞使其分散。加入適宜體積的培養(yǎng)液,吹打混勻后根據(jù)需要接種到不同的培養(yǎng)皿中以備下一步實驗之用。
三、實時定量qPCR
從BGC-823、SGC-7901中抽提總RNA,把RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以β-actin(肌動蛋白)基因(HumanACTB)為內(nèi)參基因,根據(jù)ABCB1、MMP2、CD44、CDH1基因序列信息設(shè)計并合成PCR引物,序列見表1。以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板,用目的基因特異性引物和內(nèi)參引物擴增待檢測的目的基因片段和看家基因。
表1 ABCB1、MMP2、CD44、CDH1基因qPCR檢測引物信息
四、細胞刮痕實驗
將處于對數(shù)生長期的目的細胞進行胰酶消化,計數(shù)、制成細胞懸液。將細胞懸液(細胞數(shù)約為1× 106)接種于6-well中,37℃,5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)待細胞融合度達到約95%。在單層細胞培養(yǎng)細胞上,用200 μL槍頭沿培養(yǎng)板底部整齊垂直呈“一”字形劃痕,劃線時一定要呈直線,讓細胞斷層邊緣盡量的平滑,便于觀察細胞遷移。無血清培養(yǎng)基洗滌多次,去掉漂浮在上清里的細胞,然后每孔加入2 mL無血清培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。在6孔板板蓋上用記號筆垂直于劃痕畫4~5道線,拍照時光斑落在交叉區(qū)域,利于不同時間點拍照時在同一個地方進行觀察。培養(yǎng)板放回37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)。
五、Transwell實驗
在接種細胞前,向小室中加入600 μL PBS,室溫下放置30 min充分浸潤小室;吸出PBS后,在安全柜中自然晾干,約30 min;用胰酶消化細胞,細胞計數(shù),調(diào)整細胞濃度到2×106/mL;加入0.1 mL細胞懸液于小室中,同時加入0.65 mL完全培養(yǎng)基于下層孔板中;用鑷子將小室仔細放到加有培養(yǎng)基的孔板中(應(yīng)避免底部產(chǎn)生氣泡),置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng);每天觀察遷移情況,一般在48~72 h時,停止培養(yǎng);取出小室,去除被子中的上清,用濕潤的棉簽仔細擦掉小室上層的細胞;室溫,PBS稍洗滌。吸取0.5 mL Regent A(洗滌液)于24孔板中,放入小室輕輕搖晃孔板,潤洗小室,棄洗液。吸取0.5 mL Regent B(染色液)于另一個孔中,放入小室進行染色,室溫放置20 min。取0.5 mL Regent A于步驟1的洗滌孔中,將小室放回洗滌孔中洗滌,重復(fù)6次,直到regent A無色時,然后顯微鏡下拍照。
六、數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析
采用SPSS10.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析,計量資料以x±s表示,采用單因素方差分析或配對t檢驗;計數(shù)資料比較采用方差分析。P<0.05被認為有統(tǒng)計學(xué)意義。
一、qPCR檢測兩株細胞株中ABCB1、MMP2、CDH1和CD44基因的表達水平
ABCB1在BGC-823和SGC-7901細胞中表達量非常低。MMP2在BGC-823細胞中表達量非常低。CD44在兩株胃癌細胞株中表達較高。CDH1在兩株胃癌細胞株中表達較高。兩株胃癌細胞株中4個多藥耐藥相關(guān)基因表達的柱狀圖比較如圖1A和1B所示。ABCB1在BGC-823和SGC-7901細胞中表達量較低。MMP2基因在BGC-823細胞中表達量較低,在SGC-7901中表達量中等。CDH1、CD44在BGC-823和SGC-7901中均有較高的表達。
圖1 ABCB1、MMP2、CDH1和CD44基因在BGC-823和SGC-7901中的表達
二、細胞劃痕結(jié)果
細胞劃痕后0~30 h內(nèi)每5 h觀測一次劃痕的距離并拍照記錄。相同時間內(nèi),BGC-823細胞的移動距離較遠,遷移能力強,SGC-7901的遷移能力較弱,其劃痕結(jié)果統(tǒng)計如表2所示。
表2 細胞劃痕結(jié)果統(tǒng)計分析(μm)
三、細胞侵襲實驗
在24孔板加入0.5 mL的Regent C(裂解液),放入小室輕輕搖晃孔板,37℃孵育5 min,使小室下層粘附的細胞都裂解于Regent C中,呈藍紫色澄清溶液,去掉小室,吸取孔板中的溶液100 μL到一個清潔的96孔板中。用酶標儀檢測570 nm處的吸光值,然后計算細胞遷移。SGC-7901的細胞遷移能力要弱于BGC-823。見表3。
表3 OD值檢測遷移值結(jié)果統(tǒng)計
化療在胃癌的治療中占有非常重要的低位,尤其是對于不可切除或有轉(zhuǎn)移的病例。但大部分患者會在化療開始時及表現(xiàn)為耐藥或經(jīng)過初始的治療反應(yīng)后變得耐藥[5]。多藥耐藥是指腫瘤細胞對一種抗腫瘤藥物出現(xiàn)耐藥的同時,對其他許多結(jié)構(gòu)不同、作用機制不同的抗腫瘤藥物亦產(chǎn)生交叉抗藥性[6-7]。多藥耐藥分為兩種:一種是首次使用化療藥物就產(chǎn)生耐藥,稱為原發(fā)性耐藥(primary resistance)或天然性耐藥(initial resistance)[8-9];另一種則是在化療過程中產(chǎn)生耐藥,稱為繼發(fā)性耐藥(secondary resistance)或稱獲得性耐藥(acquired resistance)[7,10]。
多藥耐藥的機制包括:由P-gp或其他MRP家族成員的膜蛋白把藥物泵出細胞外,藥物作用靶點的性質(zhì)改變,谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)對化療藥物的解毒作用增強,化療藥物在人體內(nèi)未能有效激活,細胞對藥物的代謝增強使其變成低毒的小分子,細胞修復(fù)功能增強,細胞凋亡受影響等[11]。侵襲轉(zhuǎn)移是另一個導(dǎo)致胃癌患者死亡的原因。隨著時間的推移,大約50%的患者終會發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移。胃癌細胞侵犯基底膜和漿膜,越過細胞間隙及細胞外基質(zhì),是形成轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟。目前公認的癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的機制是有Liotta提出的三步理論[12]細胞表面的受體與細胞外基質(zhì)粘附,分泌水解酶降解細胞外基質(zhì),為腫瘤細胞的運動開辟道路,癌細胞移動到被降解的基質(zhì)區(qū)域。就這樣不斷地粘附-降解-移動,最終導(dǎo)致局部侵犯和遠處轉(zhuǎn)移。在這一過程中,細胞粘附分子的相互作用、細胞外基質(zhì)、蛋白酶、細胞骨架蛋白、細胞信號轉(zhuǎn)到系統(tǒng)均起到非常重要的作用,并構(gòu)成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)。
在本實驗中,BGC-823中MMP2基因表達較低,而MDR1、CD44、E-cadherin的表達均較SGC-7901高。在癌細胞的遷徙功能檢測中,BGC-823的遷徙能力較強。因此,我們推測在本研究中對漢族起作用的基因不是MMP2,因為MMP2的高表達可導(dǎo)致癌細胞遷徙能力增強,BGC-823細胞中MMP2較低表達與其遷徙能力較強不一致。另外,BGC-823細胞株來自于胃癌原發(fā)組織,而SGC-7901來自于胃癌的轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)。根據(jù)以往的經(jīng)驗,轉(zhuǎn)移性病灶較原發(fā)灶有更強的耐藥性和侵襲能力,因此實驗前我們推測SGC-7901的遷徙能力可能會較BGC-823強,但實驗結(jié)果明確顯示BGC-823的遷徙能力強。這項結(jié)果與之前的推測不一致,可能是由于這兩株胃癌細胞不是來自同一患者,即不是同一親代細胞來源的克隆,基因表達譜不同,而BGC-823來源的標本術(shù)后病理為低分化腺癌,惡性程度較高,可解釋上述不一致。
本實驗中,兩株胃癌細胞的MDR1基因表達均較低,考慮原因為兩株胃癌細胞均為術(shù)后標本直接取材培養(yǎng),未經(jīng)化療藥物的誘導(dǎo),故MDR1低表達。所以,在本實驗中期主要作用的基因為CD44、E-cadherin。而CD44、E-cadherin的作用相反,CD44介導(dǎo)癌細胞的轉(zhuǎn)移,E-cadherin則使腫瘤組織趨于穩(wěn)定,本實驗中CD44、E-cadherin在BGC-823中表達較高,故CD44在促進BGC-823的遷徙中起著關(guān)鍵作用。
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(本文編輯:南清振)
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The expression of multidrug resistance related genes and invasion/metastasis ability of gastric cancer cell
LI Zhi-hai.Department of Gastroenterology,Xiangyang People′s Hospital;441001
Objective To investigate the relationship between the expression of multidrug resistance related genes and invasion/metastasis ability of gastric cancer cell.Methods mRNA of multidrug resistance related genes(including ABCB1,MMP2,CDH1,CD44)in gastric cell lines BGC-823 and SGC-7901 were validated by real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction(FQ-PCR)technique.Invasion/metastasis ability was assessed by cell scratch test and transwell migrating test.Then,the relationship between the expression of multidrug resistance related genes and invasion/metastasis ability was explored.Results FQ-PCR test revealed that the expression level of ABCB1,CDH1,and CD44 was higher in cell line BGC-823,while the expression level of MMP2 was higher in cell line SGC-7901.Cell scratch test and transwell migrating test revealed cell line BGC-823 had more powerful migrating ability.Conclusion Multidrug resistance related genes and invasion/metastasis ability of gastric cancer cell were relevant.High expression of CD44 may play an important role in invasion/metastasis.
Multidrug resistance;Invasion/metastasis;ABCB1;MMP2;CDH1;CD44
2014-07-07)
10.3961/j.issn.1672-2159.2014.04.003
441001襄陽市襄州區(qū)人民醫(yī)院消化內(nèi)科