楊 津

湖南省湘潭市婦幼保健院婦產(chǎn)科，湖南湘潭 411100

宮頸癌是目前全世界最常見的女性生殖道惡性腫瘤之一，其發(fā)病率僅次于乳腺癌。近年來發(fā)病率明顯升高，且逐漸呈年輕化改變。其具體發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，與HPV感染高度相關(guān)[1]。最新研究表明：基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的活性與癌癥的侵襲轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)。其中MMP-9可能參與人類宮頸癌的發(fā)生及轉(zhuǎn)移過程[2-3]。

I型血小板結(jié)合蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶（A Disintegrin and Metallo-proteinase with Thrombospondin motifs，ADAMTS）家族是一類具有金屬蛋白酶（MMP）特性的蛋白質(zhì)[4]。目前，國內(nèi)外學(xué)者對其與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系研究較少。其中，ADAMTS-1參與多種炎癥損傷反應(yīng)或血管修復(fù)過程，在多種炎性疾病尤其是前列腺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[5]。本研究應(yīng)用免疫印跡法（Western blot）檢測人類宮頸癌組織的ADAMTS-1、MMP-9蛋白表達(dá)情況，為該病的發(fā)生、侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制提供新的線索。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本組患者均為女性。收集本院2008年1月—2012年9月婦科收治的宮頸癌標(biāo)本（實(shí)驗(yàn)組）37例，年齡 36～64歲，平均年齡(49.3±3.2)歲；術(shù)后發(fā)現(xiàn)盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者2例（5.4%）。26例高級別宮頸上皮內(nèi)瘤變 （CINⅡ-Ⅲ級）標(biāo)本取自宮頸利普刀切除患者，年齡 28～46歲，平均年齡(38.4±4.6)歲。10例正常宮頸（對照組）樣本取自行子宮肌瘤術(shù)切除全子宮的患者，年齡32～75歲，平均年齡(52.5±2.6)歲。

1.2 主要儀器與試劑

聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）試劑盒與western blot電泳槽、電泳儀、預(yù)染蛋白Marker、loading buffer、化學(xué)發(fā)光液等由本院中心實(shí)驗(yàn)室提供。RIPA蛋白提取裂解液與蛋白定量試劑盒均購自大連寶生物技術(shù)有限公司。兔單克隆ADAMTS-1抗體、鼠單克隆MMP-9抗體、山羊抗兔、抗鼠二抗、內(nèi)參GAPDH抗體均購自中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 免疫印跡法（Western blot）檢測

收集新鮮宮頸癌、宮頸上皮內(nèi)瘤變與正常宮頸組織標(biāo)本與EP管中。按照一定比例加入RIPA裂解液提取總蛋白。在4℃環(huán)境中操作提取總蛋白，采用智能溫控離心機(jī)進(jìn)行高速離心時。遵照BCA法準(zhǔn)確測量測定各組標(biāo)本中蛋白濃度后，加入loading buffer于沸水煮樣，多余蛋白液立即置入-80℃冰箱凍存?zhèn)溆?。于電泳操作?5 min制備10%SDS-PAGE分離膠，然后配制濃縮膠。每泳道上樣量60 mg蛋白。等待樣品蛋白跑到合適位置后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。凝膠電泳時電壓80 V～120 V恒壓，1.5～2.0 h，轉(zhuǎn)印時電壓45V，2.0 h。轉(zhuǎn)印完畢后，將PVDF膜上的蛋白進(jìn)行封閉、一抗4℃冰箱孵育過夜、二抗室溫孵育2.5 h。完畢后，將PVDF膜充分洗滌后，加入plus-ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯影照相。

1.4 結(jié)果計算與統(tǒng)計分析

各組標(biāo)本ADAMTS-1、MMP-9蛋白的相對表達(dá)量為其灰度值/GAPDH灰度值。應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，方差分析或t檢驗(yàn)用于比較各組標(biāo)本兩種蛋白的相對表達(dá)量，P＜0.05且在95%可信區(qū)間（Confidence Index，CI）表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組標(biāo)本ADAMTS-1、MMP-9蛋白的相對表達(dá)量

本組宮頸癌、CINⅡ-Ⅲ級、對照組患者分別為37例、26例、11例。其ADAMTS-1蛋白相對表達(dá)量分別為：0.0307±0.0054（0.0289～0.0325）、0.0149±0.0037（0.0133～0.0164）、0.4613±0.08185（0.4063～0.5163）（圖 1）。三組標(biāo)本中，MMP-9 蛋白相對表達(dá)量分別為 ：0.4642±0.0918 （0.4335～0.4948）、0.1456±0.0520 （0.1246～0.1666）、0.0164±0.0057（0.0126～0.0203）（圖 2）。

圖1 各組標(biāo)本ADAMTS-1蛋白的相對表達(dá)量

圖2 各組標(biāo)本MMP-9蛋白的相對表達(dá)量

2.2 統(tǒng)計分析

兩組比較的方差分析顯示各組標(biāo)本ADAMTS-1、MMP-9蛋白的表達(dá)差異情況。LSD檢驗(yàn)結(jié)果顯示：宮頸癌標(biāo)本中ADAMTS-1蛋白的表達(dá)量明顯高于高級別上皮內(nèi)瘤變組織 （F=0.016，P=0.050；95%CI：0.0001～0.0316），然而其表達(dá)量明顯低于與對照組（F=-0.4306，P＜0.001；95%CI：-0.4518～-0.4093）。宮頸癌標(biāo)本中MMP-9蛋白的表達(dá)量明顯高于高級別上皮內(nèi)瘤變組織 （F=0.3185，P＜0.001；95%CI：0.2816～0.3554） 與對照組 （F=0.4477，P＜0.001；95%CI：0.3981～0.4973）。高級別上皮內(nèi)瘤變組織標(biāo)本中MMP-9蛋白的表達(dá)量明顯高于對照組 （F=0.1291，P＜0.001；95%CI：0.0772～0.1811）。非參數(shù)相關(guān)性檢驗(yàn)（Kendall、Spearman檢驗(yàn)）結(jié)果均顯示：人類宮頸癌組織中ADAMTS-1與MMP-9蛋白的相對表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)（P均＜0.05）（表1），而宮頸上皮內(nèi)瘤變與正常宮頸組織標(biāo)本中ADAMTS-1與MMP-9蛋白的相對表達(dá)量在無顯著地相關(guān)性（P 均>0.05）。

表1 非參數(shù)相關(guān)性檢驗(yàn)（Kendall、Spearman）顯示宮頸癌中ADAMTS-1與MMP-9表達(dá)的相關(guān)性

3 討論

ADAMTS蛋白家族廣泛存在于哺乳動物中，是能夠溶解細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白質(zhì)。有19個家族成員，結(jié)構(gòu)與MMP蛋白酶類似，有Zn2+結(jié)合位點(diǎn)。每個成員在不同年齡段、不同組織中表達(dá)有明顯差異[6-7]。例如：成人的腦、神經(jīng)、前列腺等組織均表達(dá)ADAMTS-13、17、18；而胚胎時期的腎臟、肺組織均主要表達(dá) ADAMTS-14、16、17、18 等，肝臟組織主要表達(dá) ADAMTS-13、15、18[8-9]。與 MMP蛋白家族相比，目前國內(nèi)學(xué)者對ADAMTS的結(jié)構(gòu)與功能研究較少。

ADAMTS-1屬于分泌型蛋白,是目前研究較多的一個成員。其位于21號染色體長臂21～22，編碼951個氨基酸，分子量為100kd左右。最早在小鼠結(jié)腸腺癌基因差異表達(dá)的研究中被發(fā)現(xiàn)[10-11]。ADAMTS-1有多個結(jié)構(gòu)域，其中血小板凝血酶敏感蛋白樣序列區(qū)（TSP）被認(rèn)為是其主要功能區(qū)域。ADAMTS-1通過C末端3個TSP重復(fù)序列和間隔區(qū)錨定在細(xì)胞外基質(zhì)中，可通過aggrecan、Versican、brevican等蛋白來發(fā)揮降解細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的作用。人為干擾ADAMTS1的表達(dá)，可導(dǎo)致小鼠中TSP表達(dá)下降，進(jìn)而引起組織血管增多、延長傷口愈合時間[12-13]。

腫瘤的發(fā)生是一個多步驟、多基因突變的過程。已證實(shí)，宮頸癌的發(fā)生可能與多種基因如 HDAC1、DNMT1、RECK、P53、P2X7、MMP-9等基因突變及炎癥相關(guān)蛋白表達(dá)異常有關(guān)[16]。部分研究表明：ADAMTS-1參與多種炎癥損傷反應(yīng)或血管修復(fù)過程與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。C.Mastronard等研究發(fā)現(xiàn)：IL-1β、IL-1可上調(diào)ADAMTS-1的表達(dá)，而TGF-β1則抑制其過度表達(dá)，從而維持炎癥損傷反應(yīng)的平衡。ADAMTS-1可通過降低VEGF的過表達(dá)進(jìn)而抑制血管再生修復(fù)功能[14-15]。本組共74例標(biāo)本，免疫印跡檢測發(fā)現(xiàn)，慢性宮頸炎組標(biāo)本中ADAMTS-1呈高表達(dá)狀態(tài)，提示ADAMTS-1直接參與慢性宮頸損傷與炎癥修復(fù)的重要功能。然而，其在高級別上皮內(nèi)瘤變、浸潤性癌組織的表達(dá)量明顯降低（P均＜0.001），提示ADAMTS-1有抑制腫瘤發(fā)生的作用。然而，腫瘤組織中其表達(dá)下調(diào)機(jī)制目前尚未明確。

MMP-9蛋白在人類宮頸癌組織與Hela細(xì)胞中表達(dá)明顯增強(qiáng)，并與癌癥的侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)[2-3]。然而，其在宮頸高級別上皮內(nèi)瘤變組織的表達(dá)卻尚未清楚。本組高級別上皮內(nèi)瘤變組織標(biāo)本中MMP-9蛋白的表達(dá)量明顯于高對照組（P＜0.001）。這一結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)MMP-9蛋白與宮頸癌的發(fā)生相關(guān)。然而，其表達(dá)量明顯低于浸潤性宮頸癌組織，提示著MMP-9的確參與癌癥的侵襲、轉(zhuǎn)移過程（P＜0.001）。

血管的長入是癌組織生長最關(guān)鍵因素，其主要步驟包括：血管內(nèi)皮細(xì)胞的增值與遷移、毛細(xì)血管基底膜降解以及基底膜等再生等[17]。目前，越來越多的學(xué)者意識到：MMP與ADAMTS蛋白家族存在相互交聯(lián)，然而其具體機(jī)制尚未闡明。一些皮膚損傷的研究發(fā)現(xiàn)：ADAMTS-1、MMP-2與FGF-2存在相互調(diào)節(jié)作用。上調(diào)ADAMTS-1的表達(dá)可促進(jìn)FGF-2的高表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)成纖維細(xì)胞的聚集和遷移[18]。這一現(xiàn)象可能與ADAMTS-1促進(jìn)MMP-2的高表達(dá)相關(guān)。此外，J.Kim等研究發(fā)現(xiàn)：動脈粥樣硬化中ADAMTS-1高表達(dá)，基因敲除ApoE表達(dá)的轉(zhuǎn)ADAMTS-1基因小鼠的血管內(nèi)膜較ApoE正常表達(dá)的內(nèi)膜明顯增厚[19]。

本研究采用Kendall、Spearman等非參數(shù)相關(guān)性檢驗(yàn)，進(jìn)一步顯示人類宮頸癌組織中ADAMTS-1與MMP-9蛋白的相對表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)（P均＜0.05），而宮頸上皮內(nèi)瘤變與正常宮頸組織標(biāo)本中ADAMTS-1與MMP-9蛋白的相對表達(dá)量在無顯著地相關(guān)性（P均>0.05）。這一結(jié)果提示：宮頸癌組織中ADAMTS-1的低表達(dá)引起腫瘤組織的血管生長失衡，炎性介質(zhì)（MMP-9蛋白）釋放增加，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。然而，ADAMTS-1與MMP-9蛋白的具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步深入的研究來闡明。

與本研究類似，其他學(xué)者在乳腺癌、肝癌中研究發(fā)現(xiàn)：ADAMTS-1可能參與癌癥的侵襲轉(zhuǎn)移過程。ADAMTS-1低表達(dá)或缺失的腫瘤組織中，其腫瘤體積、血管數(shù)目與壞死度明顯大于ADAMTS-1陽性組織。ADAMTS-1的上調(diào)能明顯抑制腎、結(jié)腸組織的轉(zhuǎn)移性肝癌的生長[20-21]。相反，最近研究結(jié)果顯示：ADAMTS-1對癌癥的轉(zhuǎn)移具有促進(jìn)作用，主要機(jī)制是ADAMTS-1促進(jìn)可ECM中信號蛋白3C的釋放與膜相關(guān)磷酸化肝素多聚蛋白-4的脫落，引起細(xì)胞黏附力減弱、進(jìn)而促進(jìn)癌癥轉(zhuǎn)移[22-23]。本組病例中，盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者所占比例太少（僅5.4%），無法做出有意義的統(tǒng)計。因而，本研究尚未發(fā)現(xiàn)ADAMTS-1與宮頸癌預(yù)后有顯著相關(guān)性。

4 小結(jié)

綜上所述，本研究初步檢測了宮頸癌組織中ADAMTS-1與MMP-9蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示：宮頸癌中ADAMTS-1表達(dá)量明顯下調(diào)、MMP-9蛋白表達(dá)量明顯上調(diào)。宮頸癌中ADAMTS-1與MMP-9蛋白的相對表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)，兩者在宮頸上皮內(nèi)瘤變與正常宮頸組織中的表達(dá)無顯著地相關(guān)性。這一現(xiàn)象提示：ADAMTS-1可能與宮頸癌中的發(fā)生有關(guān)，且可能通過上調(diào)MMP-9蛋白的表達(dá)途徑實(shí)現(xiàn)；為ADAMTS蛋白的深入研究打下了基礎(chǔ)。然而，本研究的主要缺點(diǎn)在于實(shí)驗(yàn)樣本太少、研究方法單一，更多可靠結(jié)論尚需更多研究來證實(shí)。

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