王朝雯等

摘要 [目的]建立臺蘭穩(wěn)定可靠的ISSR-PCR分子標(biāo)記反應(yīng)體系。[方法]用改良的CTAB法提取葉片的基因組DNA，并對影響臺蘭ISSR-PCR反應(yīng)體系的主要成分進(jìn)行篩選和優(yōu)化。[結(jié)果]臺蘭的ISSR-PCR優(yōu)化反應(yīng)體系為：25 μl PCR反應(yīng)體積中，2.5 μl 10×PCR buffer，2.0 mmol/L MgCl2，100 ng模板DNA，0.5 mmol/L dNTPs，0.22 U Taq DNA 聚合酶，0.4 μmol/L 引物，15.78 μl雙蒸水。最佳擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)：94 ℃變性30 s，復(fù)性溫度根據(jù)各引物的TM值略低1～2 ℃，30 s，72 ℃延伸50 s，循環(huán)結(jié)束后72 ℃延伸7 min。[結(jié)論] 臺蘭ISSR-PCR優(yōu)化反應(yīng)體系為今后利用ISSR技術(shù)進(jìn)行臺蘭種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 臺蘭（Cymbidium floribundum var.pumilum）；ISSR分子標(biāo)記；ISSR-PCR反應(yīng)體系

中圖分類號 S682.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼

A 文章編號 0517-6611（2014）15-04583-04

Abstract [Objective] This research aimed to establish the optimized ISSR-PCR reaction system ofCymbidium floribundum var. pumilum. [Method] The genomic DNA from fresh leaves was extracted according to the modified CTAB method. Different factors that affected ISSR amplification reaction were optimized. [Result] High-quality genomic DNA was obtained from Cymbidium floribundum var. pumilum. The 25 μl optimized ISSR-PCR reaction mixture contained 2.5 μl 10×PCR buffer， 2.0 mmol/L MgCl2， 100 ng template DNA， 0.22 U Taq DNA polymerase， 0.5 mmol/L dNTPs， 0.4 μmol/L primer and 15.78 μl ddH2O. The PCR was performed as follow： an initial step of 5 min at 94 ℃， named pre-denaturing， followed by 40 cycles of denaturing at 94 ℃ for 30 s， annealing for 30 s due to 1-2 ℃ lower than denaturing temperature of different primers， extension for 50 s at 72 ℃， and a 7 min final extension step at 72 ℃. [Conclusion] The optimal system was established and it could provide a favorable basis for further study on genetic diversity of C. floribundum var. pumilum， using ISSR molecular marker.

Key words C. floribundum var. pumilum； ISSR； ISSR-PCR reaction system

臺蘭（Cymbidium floribundum var.pumilum ）又名蜜蜂蘭、蜂子蘭、金棱邊、蒲蘭等，為蘭科 （Orchidaceae）蘭屬（Cymbidium）多年半地生性蘭科植物。蘭花的種質(zhì)資源是選種育種的基礎(chǔ)，種質(zhì)資源一旦滅絕，無法再造，從這一意義上來說，野生蘭花若再不加以保護(hù)，將會對世界蘭花的育種、研究造成不可彌補(bǔ)的損失，并將會直接威脅到我國蘭花經(jīng)濟(jì)的持續(xù)發(fā)展。目前，關(guān)于蘭科植物的研究主要集中在形態(tài)學(xué)、分類學(xué)、生理學(xué)、孢粉學(xué)、區(qū)系地理學(xué)和繁殖生物學(xué)等方面[1-2]，而關(guān)于居群遺傳學(xué)的研究則很少。

近年來，應(yīng)用 ISSR-PCR 分子標(biāo)記技術(shù)對植物進(jìn)行遺傳多樣性研究已有較多報(bào)道[3-5]，而采用ISSR技術(shù)對野生臺蘭的遺傳多樣性和居群遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行的研究鮮有報(bào)道。筆者以采自江西省贛州市齊云山的臺蘭作為試驗(yàn)材料，對臺蘭ISSR-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，以建立比較完善的反應(yīng)條件，以期為建立為進(jìn)一步利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行臺蘭遺傳多樣性研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 試驗(yàn)樣品采自江西省贛州市齊云山的一個(gè)自然居群，每個(gè)居群采集 15～20個(gè)樣本。記錄采集樣品的經(jīng)緯度、海拔和生境，同時(shí)對每個(gè)居群采集憑證標(biāo)本供研究用。采集完成后用硅膠干燥法進(jìn)行處理、保存，備用。

1.2 基因組 DNA 的提取 采用改良的 CTAB 法提取臺蘭基因組DNA，步驟如下：①取0.05 g硅膠干燥的臺蘭葉片材料，置于1.5 ml離心管中加液氮研磨成粉末后，加入0.75 ml 65 ℃預(yù)熱的2×CTAB抽提緩沖液（ pH8.0），20 μl β-硫基乙醇，輕輕搖動使溶液分散均勻，65 ℃水浴1 h，水浴過程每隔10 min輕輕搖動。②冷卻至室溫，加等體積的氯仿∶異戊醇（ 24∶1），混合均勻，12 000 r/min離心10 min。③吸取上層液相轉(zhuǎn)入新的1.5 ml離心管，加等體積氯仿異戊醇，搖勻。④12 000 r/min離心10 min。取上層液相，加1/10體積3 mol/L的冰醋酸鈉，2倍體積-20 ℃的無水乙醇，-20 ℃保存20 min。⑤勾出 DNA。⑥加70 %乙醇洗滌2 次，用無水乙醇洗滌1 次，風(fēng)干。⑦用40 μl 0.1TE溶解 DNA，-20 ℃長期保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 DNA 樣品的檢測 用1.0%瓊脂糖電泳檢測DNA質(zhì)量；用分光光度計(jì)測定其純度和濃度，DNA純度以O(shè)D260/OD280的比值來估算，濃度估算法為：DNA 濃度 （ng/μl） =OD260×50×稀釋倍數(shù)。計(jì)算DNA獲得率（ DNA量/所用葉片量×100%）為1.8%。

1.4 ISSR-PCR 擴(kuò)增反應(yīng)

1.4.1 ISSR-PCR 條件篩選。反應(yīng)體系為25 μl，其中10×buffer 2.5 μl，引物濃度為0.4 μmol/L，雙蒸水15.78 μl。為確定 PCR 反應(yīng)中其他4項(xiàng)因素 （ DNA模板、Taq DNA聚合酶、Mg2+和dNTPs ） 的最佳水平，試驗(yàn)用引物對 ISSR-PCR 反應(yīng)的這4項(xiàng)影響因素逐個(gè)進(jìn)行5個(gè)水平的研究，各反應(yīng)參數(shù)變化量見表 1。反應(yīng)總體積為25 μl （含2.5 μl 10×buffer和15.78 μl ddH2O）。

1.4.3 PCR 擴(kuò)增步驟及參數(shù)。取1.5 ml已滅菌eppendorf管，依擴(kuò)增的樣本數(shù)計(jì)算各成分的量，依次加入ddH2O→10×buffer→dNTPs →Taq酶，混勻后分裝到各擴(kuò)增薄壁管中，依次加入模板，按循序放入 PCR 擴(kuò)增儀樣本中，按以下程序進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增完畢，將樣本取出，置于4 ℃ 冰箱保存，等待電泳。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，50～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，共40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，并回收純化目的條帶。

1.5 電泳與拍照 PCR 擴(kuò)增結(jié)束后，以 GeneRuler 100 bp DNA Ladder Plus（上海生物工程公司產(chǎn)品SM0321 ）為分子量標(biāo)記，用含有0.1% EB的1.5%瓊脂糖凝膠電泳（0.6 g瓊脂糖，40 ml 1×TAE緩沖液），電泳緩沖液為1×TAE 電泳緩沖液100 V穩(wěn)壓100 mA電泳45～60 min，凝膠成像儀下成像拍照并保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 Taq DNA 聚合酶對 ISSR-PCR 反應(yīng)的影響 試驗(yàn)設(shè)計(jì)了 Taq DNA 聚合酶5個(gè)濃度梯度為0.18、0.20、0.22、0.25和0.28 U，同時(shí)對5個(gè)引物18291、18294、18295、18297和18298進(jìn)行篩選。圖1表明，當(dāng) Taq DNA 聚合酶濃度為0.18和0.20 U 時(shí)，擴(kuò)增譜帶模糊不清；濃度為0.20、0.25、0.28 U時(shí)，擴(kuò)增譜帶較弱，且數(shù)量相對較少；濃度為0.22 U時(shí)擴(kuò)增條帶較多且較亮，效果最好，故確定為最佳濃度。同時(shí)可以看出引物18257和18297的條帶較為清晰而且數(shù)量較多，篩選出效果較好的引物為18257和18297。

2.2 dNTPs 濃度對 ISSR- PCR 反應(yīng)的影響 圖2表明，當(dāng)濃度為0.3 mmol/L時(shí)，幾乎無擴(kuò)增產(chǎn)物；在0.4 mmol/L時(shí)，雖有擴(kuò)增產(chǎn)物，但譜帶較弱不易辨認(rèn)；濃度為0.5～0.7 mmol/L時(shí)，均能擴(kuò)增出清晰的譜帶，但在0.6～0.7 mmol/L，擴(kuò)增產(chǎn)物不穩(wěn)定且有非特異性擴(kuò)增；在0.6 mmol/L時(shí)，擴(kuò)增譜帶較弱或一些大的片段擴(kuò)增缺失。考慮到結(jié)果的穩(wěn)定性和減少試驗(yàn)成本，選用0.5 mmol/L 的dNTPs濃度，在此濃度下，擴(kuò)增產(chǎn)物穩(wěn)定、重復(fù)性強(qiáng)。同時(shí)對引物18262、18265、18266、18268和18269進(jìn)行篩選，得出18265和18269擴(kuò)增效果較好。

2.5 臺蘭優(yōu)化體系的建立 通過對以上各種影響因素的分析優(yōu)化，建立了反應(yīng)穩(wěn)定、重復(fù)性好的臺蘭ISSR-PCR 反應(yīng)體系：在25 μl 反應(yīng)體系中含2.5 μl 10×buffer，0.5 mmol/L dNTPs，2.0 mmol/L MgCl2，0.4 μmol/L引物，0.22 U Taq DNA 聚合酶，100 ng模板 DNA，雙蒸水15.78 μl。PCR 擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，50～60 ℃退火（退火溫度隨引物不同而定，根據(jù)各引物的Tm值略低1～2 ℃）30 s，72 ℃延伸50 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。

為了檢測優(yōu)化的效果，試驗(yàn)利用建立的優(yōu)化體系，選用UBC822引物，在復(fù)性溫度為50 ℃條件下，對12個(gè)篩選的引物進(jìn)行批量擴(kuò)增。圖5表明，優(yōu)化后的反應(yīng)體系是比較理想的。

3 結(jié)論與討論

3.1 ISSR 反應(yīng)體系主要成分對ISSR-PCR反應(yīng)穩(wěn)定性的影響 ISSR是基于PCR反應(yīng)的一種分子標(biāo)記技術(shù)，具有DNA用量少、操作簡單、快速靈敏、成本低等優(yōu)點(diǎn)[6]，但I(xiàn)SSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)容易受許多因素的影響，如：Taq DNA聚合酶、Mg2+濃度、dNTPs用量、DNA模板的濃度和純度等，而且這些因素之間存在相互作用。因此，不同物種的最佳擴(kuò)增條件各有不同，為確保 ISSR 分析結(jié)果的可靠性和重復(fù)性，獲得較高的 ISSR-PCR擴(kuò)增譜帶，提高分析的準(zhǔn)確性，針對不同物種相應(yīng)的反應(yīng)體系中各種影響因子進(jìn)行優(yōu)化，篩選出最適宜的ISSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件非常重要。

在ISSR-PCR反應(yīng)體系中，Taq DNA聚合酶的用量直接決定著實(shí)驗(yàn)的成功與否，量多不僅增加試驗(yàn)成本而且容易產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物；量少則會使酶過早地消耗完，產(chǎn)物合成效率低[7]。試驗(yàn)中Taq DNA聚合酶用量低于0.22 U時(shí)條帶數(shù)量少且比較暗，用量多于0.22 U時(shí)條帶雖然沒有減少，但是出現(xiàn)了非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，結(jié)果表明0.22 U是臺蘭ISSR-PCR反應(yīng)的最佳條件。

dNTPs是ISSR-PCR反應(yīng)的原料，通常dNTPs濃度范圍為0.02～0.20 mmol/L[8]。dNTPs為Taq DNA聚合酶提供底物，使產(chǎn)物得以延伸。當(dāng)dNTPs濃度過高，則導(dǎo)致Taq DNA聚合酶的錯(cuò)誤摻入，會導(dǎo)致PCR錯(cuò)配，從而使擴(kuò)增出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，影響擴(kuò)增的準(zhǔn)確性；濃度過低，又會影響合成效率，甚至?xí)蜻^早的消耗而使產(chǎn)物單鏈化，影響擴(kuò)增效果[9]。試驗(yàn)中dNTPs濃度為0.3和0.4 mmol/L時(shí)，因濃度太低而擴(kuò)增產(chǎn)物過少，濃度為0.5、0.6和0.7 mmol/L時(shí)都有較多擴(kuò)增產(chǎn)物，但后兩者非特異性擴(kuò)增相對較多，結(jié)果表明0.5 mmol/L為dNTPs最佳濃度。

Mg2+濃度是影響ISSR-PCR結(jié)果的一個(gè)重要因素，Mg2+濃度不僅影響Taq酶的活性[10]，還能與反應(yīng)液中的dNTPs、模板DNA及引物結(jié)合，影響引物與模板的合效率、模板與產(chǎn)物的解鏈溫度以及產(chǎn)物的特異性和引物二聚體的形成[11]。試驗(yàn)中Mg2+濃度對反應(yīng)無明顯影響，所設(shè)置的幾個(gè)濃度都有較多擴(kuò)增產(chǎn)物，但濃度為2.0 mmol/L時(shí)條帶較亮，結(jié)果表明2.0 mmol/L為Mg2+ 最佳濃度。

DNA模板濃度也是影響ISSR-PCR擴(kuò)增效果的因素之一，濃度過低，擴(kuò)增產(chǎn)物不穩(wěn)定或無擴(kuò)增產(chǎn)物；濃度過高，又會相應(yīng)增加非特異性產(chǎn)物的擴(kuò)增。最佳的模板濃度范圍取決于研究的物種和模板純度，在DNA模板不純的情況下，寧可使用有效濃度范圍內(nèi)的最低濃度，使抑制Taq DNA 聚合酶的影響降到最小。試驗(yàn)中隨著DNA模板濃度升高，擴(kuò)增產(chǎn)物也相應(yīng)增加，但同時(shí)非特異性產(chǎn)物也在增加，因此，考慮到穩(wěn)定性和節(jié)約成本，試驗(yàn)采用的最佳DNA模板濃度為100 ng/L。