紀 鵑，李 偉，陳曉紅，姜 梅，芮 昕，董明盛*

（南京農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，江蘇 南京 210095）

瑞士乳桿菌MB2-1胞外多糖發(fā)酵條件優(yōu)化

紀 鵑，李 偉，陳曉紅，姜 梅，芮 昕，董明盛*

（南京農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，江蘇 南京 210095）

對1株分離自新疆賽里木酸奶中的瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus MB2-1）胞外多糖（exopolysaccharide，EPS）的發(fā)酵條件進行優(yōu)化。利用單因素試驗確定發(fā)酵溫度、乳糖添加量、氮源種類及添加量、無機鹽種類及添加量對其EPS產(chǎn)量的影響。采用Box-Behnken法對其中的三因素三水平進行響應面分析以確定其最優(yōu)工藝條件。結(jié)果表明：L. helveticus MB2-1 EPS提取的最佳條件為發(fā)酵溫度37 ℃、Mg2+添加量為質(zhì)量濃度0.2 g/100 mL、大豆蛋白胨添加量為質(zhì)量濃度2 g/100 mL，在此工藝條件下，L. helveticus MB2-1 EPS的產(chǎn)量達到801.2 mg/L。

瑞士乳桿菌；胞外多糖；發(fā)酵；響應面法

乳酸菌胞外多糖（exopolysaccharides，EPS）是指鏈球菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬、雙歧桿菌屬、明串珠菌屬等乳酸菌在生長代謝過程中分泌到細胞壁外的黏液或莢膜多糖的總 稱[1-2]。據(jù)報道，EPS具有多種功能特性，例如在物理化學特性方面，EPS可以作為食品添加劑的替代品，具有改善食品的質(zhì)構(gòu)、穩(wěn)定性、流變性及口感等功效；在酸奶的應用中，EPS可以改變酸奶的外觀和口感，并可以控制酸奶的收縮脫水現(xiàn)象，防止酸奶中乳清的析出[3]；在生理功能特性方面，EPS具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、降血糖、抗腫瘤、降膽固醇以及改善人體胃腸道等功能[4]，使其在制藥領(lǐng)域有著廣闊的應用前景。

EPS的產(chǎn)量受諸多因素影響，除與菌種的遺傳特性（控制多糖基因產(chǎn)生的酶系種類和活性）有關(guān)[5]，菌株培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分和環(huán)境條件也會影響乳酸菌EPS的合成，且在不同營養(yǎng)條件和培養(yǎng)條件下合成的EPS的種類也不同[6]。研究表明，培養(yǎng)基成分主要包括碳源、氮源、碳氮比、金屬離子及無機鹽等，環(huán)境條件包括培養(yǎng)基初始pH值、接種量、發(fā)酵溫度和時間等，通過優(yōu)化這些發(fā)酵條件均能顯著提高EPS的產(chǎn)量[7-9]。目前，已有研究發(fā)現(xiàn)瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）MB2-1在發(fā)酵乳制品中具有高產(chǎn)黏和酸化的特性[10]，且分泌產(chǎn)生的莢膜多糖具有較好的抗氧化能力[11]。為了提高瑞士乳桿菌MB2-1 EPS的產(chǎn)量，本實驗利用單因素試驗篩選了4種因素，即發(fā)酵溫度、乳糖添加量、氮源和無機鹽，采用Box-Behnken設計對發(fā)酵溫度、Mg2+添加量和大豆蛋白胨添加量的組合進行優(yōu)化，進一步確定促進瑞士乳桿菌MB2-1 EPS產(chǎn)量的最優(yōu)條件，為以后更加深入研究EPS的特性以及生理功能等方面提供良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種與培養(yǎng)基

高產(chǎn)黏瑞士乳桿菌MB2-1從新疆拜城縣傳統(tǒng)賽里木酸奶中分離得到，由南京農(nóng)業(yè)大學食品微生物實驗室提供。

低蛋白乳清粉培養(yǎng)基（乳糖質(zhì)量濃度為64 g/L）：質(zhì)量濃度為120 g/L和80 g/L的乳清培養(yǎng)基，108 ℃滅菌15 min。

1.1.2 試劑

低蛋白乳清粉 荷蘭DV營養(yǎng)公司；葡萄糖、乳糖、MnCl2·4H2O、MgSO4·7H2O、CaCl2·4H2O、KCl、大豆蛋白胨、酪蛋白胨、胰蛋白胨、蛋白胨、三氯乙酸、乙醇（95%）、濃硫酸和苯酚（6%）均為國產(chǎn)分析純試劑；MD34透析袋（截留分子質(zhì)量8 000～14 000 D） 北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設備

AUY120島津分析天平、UV-2450型紫外分光光度計 日本Shimadzu公司；SL-N電子天平 上海民橋精密科學儀器有限公司；手提式壓力蒸汽滅菌鍋 上海三申醫(yī)療器械有限公司；Air Tech超凈工作臺 蘇凈集團安泰公司；LRH系列生化培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；Avanti J-E冷凍離心機 美國Beckman Coulter公司；722可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司；AIPHAPPHOT-2 YS2光學顯微鏡 日本Nikon公司；Hei-VAP Advantage(HL)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國Heidolph公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化及發(fā)酵液制備

菌種活化：活化時采用質(zhì)量濃度為120 g/L的乳清培養(yǎng)基，從甘油管中接種瑞士乳桿菌MB2-1進行活化，接種量為體積分數(shù)4%，活化兩次，37 ℃條件下恒溫培養(yǎng)12 h。

發(fā)酵液制備：發(fā)酵時采用質(zhì)量濃度為80 g/L的乳清培養(yǎng)基，接種量為體積分數(shù)4%，培養(yǎng)24 h得到發(fā)酵液。

1.3.2 瑞士乳桿菌MB2-1 EPS的提取

將發(fā)酵液離心（15 min、12 000×g、4 ℃），除去菌體和雜質(zhì)；上清液添加質(zhì)量濃度為80 g/100 mL的三氯乙酸至終質(zhì)量濃度4 g/100 mL，靜置4～8 h，離心（15 min、12 000 r/min、4 ℃）除去沉淀蛋白；上清液中加入無水乙醇至終體積分數(shù)75%，4 ℃靜置12 h，離心去沉淀，去離子水溶解，離心去沉淀；上清液去離子水透析3 d，每8～10 h換水一次，收集透析液。

1.3.3 EPS產(chǎn)量的測定

以葡萄糖為標準品，采用硫酸-苯酚法[12]測定EPS的含量。

葡萄糖標準曲線的制作：將0.1 mg/mL的標準葡萄糖溶液0、50、100、150、200、250、300 μL分別置于8個同等規(guī)格的玻璃試管中，加水補足至500 μL。然后分別加入500 μL的蒸餾水、質(zhì)量分數(shù)6%的苯酚500 μL和濃硫酸2.5 mL，振蕩搖勻，室溫放置20 min后，采用紫外-可見分光光度計于490 nm波長處測定吸光度。以葡萄糖標準品的質(zhì)量濃度作橫坐標，吸光度作縱坐標繪制標準曲線，并得出回歸方程。取0.5 mL多糖溶液（質(zhì)量濃度為1 mg/mL）于試管中，替代標準品溶液，后續(xù)操作一樣，平行3次，測定每個樣品吸光度，并取平均值。葡萄糖標準曲線回歸方程為y =12.996x＋0.005 5（R2= 0.998 4），在葡萄糖質(zhì)量濃度0～0.06 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

EPS產(chǎn)量的測定：收集透析液測定終體積，然后全部定容至20 mL，混合均勻并計算稀釋度；取其中500 μL，加入500 μL的蒸餾水、6%的苯酚500 μL和濃硫酸2.5 mL，振蕩搖勻，室溫放置20 min后測定吸光度A490nm值；最后換算至原透析液中EPS的濃度。

1.3.4 瑞士乳桿菌MB2-1 EPS單因素試驗設計

測定不同發(fā)酵溫度、乳糖添加量、氮源種類及添加量、無機鹽種類及添加量對菌種EPS產(chǎn)量的影響。

1.3.4.1 發(fā)酵溫度對EPS產(chǎn)量的影響

以發(fā)酵反應時間為24 h，設計發(fā)酵溫度分別為31、34、37、40、43 ℃，按1.3.2節(jié)進行操作，以發(fā)酵完成后離心透析得到的EPS含量作為指標，研究發(fā)酵溫度對EPS產(chǎn)量的影響。

1.3.4.2 乳糖添加量對EPS產(chǎn)量的影響

以低蛋白乳清粉培養(yǎng)基（乳糖質(zhì)量濃度為64 g/L）為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別添加質(zhì)量濃度為16、32、48、64 g/L的乳糖，接入4%活化2代的瑞士乳桿菌MB2-1培養(yǎng)液，37 ℃條件下恒溫培養(yǎng)24 h，測定發(fā)酵液中EPS的含量，研究乳糖添加量對EPS產(chǎn)量的影響。

1.3.4.3 氮源種類與添加量對EPS產(chǎn)量的影響

以低蛋白乳清粉培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別添加質(zhì)量濃度1 g/100 mL的大豆蛋白胨、酪蛋白、胰蛋白和蛋白胨，接入4%活化2代的瑞士乳桿菌MB2-1培養(yǎng)液，37 ℃條件下恒溫培養(yǎng)24 h，測定發(fā)酵液中EPS的含量，研究氮源種類對EPS產(chǎn)量的影響。

在上述實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，以低蛋白乳清粉為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別添加質(zhì)量濃度0.3、0.6、1、2、3 g/100 mL的大豆蛋白胨，接入4%活化2代的瑞士乳桿菌MB2-1培養(yǎng)液，37 ℃條件下恒溫培養(yǎng)24 h，測定發(fā)酵液中EPS的含量，研究大豆蛋白胨添加量對EPS產(chǎn)量的影響。

1.3.4.4 無機鹽種類及添加量對EPS產(chǎn)量的影響

以低蛋白乳清粉培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別添加質(zhì)量濃度0.3 g/100 mL的MnCl2·4H2O、MgSO4·7H2O、CaCl2·4H2O和KCl，接入4%活化2代的瑞士乳桿菌MB2-1培養(yǎng)液，37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，測定發(fā)酵液中EPS的含量，研究無機鹽種類對EPS產(chǎn)量的影響。

在上述實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，以低蛋白乳清粉為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別添加質(zhì)量濃度0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/100 mL的MgSO4·7H2O，接入4%活化2代的瑞士乳桿菌MB2-1培養(yǎng)液，37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，測定發(fā)酵液中EPS的含量，研究Mg2+添加量對EPS產(chǎn)量的影響。

1.3.5 瑞士乳桿菌MB2-1 EPS響應面優(yōu)化試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken設計原理，進行三因素三水平的響應面分析試驗，以發(fā)酵溫度、Mg2+添加量和大豆蛋白胨添加量為自變量，EPS產(chǎn)量為響應值，確定各因素對EPS產(chǎn)量的顯著性影響及各反應條件的最佳組合。

1.4 統(tǒng)計方法

單因素試驗設計中每項因素試驗重復3次，數(shù)據(jù)結(jié)果使用SPSS 13.0軟件對其進行方差分析（One-Way ANOVA），并使用Excel軟件進行圖表繪制。

響應面優(yōu)化試驗使用Design Expert（Version 8.0.6）軟件進行試驗設計、數(shù)據(jù)分析和模型建立。決定系數(shù)R2值的大小用來評估回歸模型的擬合度，該值越靠近1表明回歸方程的擬合度越好；回歸系數(shù)和回歸模型的顯著性均由F值來檢測，P值選取0.05和0.01兩個不同的顯著水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌體形態(tài)

圖1 瑞士乳桿菌MB2-1菌體形態(tài)（10×100）Fig.1 Morphology of L. helveticus MB2-1 (10 × 100)

由圖1可知，菌體呈鏈狀，革蘭氏陽性，菌落直徑在MRS瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h達2～3 mm，白色不透明，邊緣不整齊，呈扁平狀；菌株在乳清培養(yǎng)基中發(fā)酵24 h能觀察到明顯的拉絲現(xiàn)象，且培養(yǎng)基有著極高的黏度。

2.2 發(fā)酵溫度對EPS產(chǎn)量的影響

培養(yǎng)溫度是影響EPS生成的一個重要因素。不同溫度下EPS的產(chǎn)量如圖2所示，當溫度在31～37 ℃范圍內(nèi)，EPS產(chǎn)量隨著溫度的升高而增大；溫度為37 ℃時，EPS產(chǎn)量達到最高（0.339 g/L）；當溫度在37～43 ℃范圍內(nèi)時，EPS產(chǎn)量隨溫度的升高而降低。且瑞士乳桿菌最適生長溫度為40 ℃左右，此結(jié)果與前人報道一致，即微生物EPS產(chǎn)生的最適溫度一般低于細菌生長的最適溫度。Gassem等[13]認為，微生物EPS屬于菌體的次級代謝產(chǎn)物，一般于對數(shù)生長的末期和穩(wěn)定期生成，因此低溫將導致菌體生長緩慢，延長其生長對數(shù)期和穩(wěn)定期，從而有利于EPS產(chǎn)量的提高。Kojic等[14]認為，低溫下菌體生長速度慢，細胞壁的合成也相應緩慢，從而使更多的磷酸異戊二烯用于EPS的產(chǎn)生。

圖2 培養(yǎng)溫度對EPS產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of culture temperature on the yield of EPS

2.3 乳糖添加量對EPS產(chǎn)量的影響

一般來說，碳源對于乳酸菌EPS的產(chǎn)量有很大的影響，是細胞生長最重要的能量和營養(yǎng)來源[15-16]。本研究采用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為低蛋白乳清粉培養(yǎng)基，乳糖作為培養(yǎng)基中唯一的碳源，其含量為64 g/L。在不添加其余碳源種類的情況下，研究增加乳糖量對EPS產(chǎn)量的影響，結(jié)果如圖3所示。當乳糖添加量在0～16 g/L時，EPS產(chǎn)量隨著乳糖的添加而增大，且在16 g/L時達到最高值（0.459 g/L）；但再隨著乳糖量的增加，EPS產(chǎn)量反而降低，在質(zhì)量濃度為32 g/L時EPS產(chǎn)量減至最小并逐漸趨于平穩(wěn)，表明高質(zhì)量濃度的乳糖對EPS產(chǎn)量的影響不大。

圖3 乳糖添加量對EPS產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of lactose concentration on the yield of EPS

2.4 氮源與添加量對EPS產(chǎn)量的影響

氮源是乳酸菌合成EPS所必需的養(yǎng)分，不同的氮源和適量的添加量對菌體分泌EPS均有一定的影響[17-18]。有機氮源含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸和維生素等，本研究選擇的有機態(tài)氮源有大豆蛋白胨、酪蛋白、胰蛋白和蛋白胨，添加量均為質(zhì)量濃度1 g/100 mL，比較各成分對EPS產(chǎn)量的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 氮源對EPS產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of nitrogen source on the yield of EPS

由圖4可知，大豆蛋白胨對EPS的合成最有利，產(chǎn)量達到0.533 g/L，較無添加的提高58.63%，故選擇大豆蛋白胨作為氮源。另外，酪蛋白的添加不僅未提高EPS的產(chǎn)量，反而降低了產(chǎn)量，說明酪蛋白對瑞士乳桿菌MB2-1分泌EPS有一定的抑制作用。

在確定培養(yǎng)基中乳糖的添加量為16 g/L，氮源為大豆蛋白胨的情況下，為獲得更高的EPS產(chǎn)量，需調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中乳糖與大豆蛋白胨添加的比例，故研究大豆蛋白胨的添加量，結(jié)果如圖5所示。

圖5 大豆蛋白胨添加量對EPS產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of soybean peptone concentration on the yield of EPS

由圖5可知，在質(zhì)量濃度為0～2 g/100 mL范圍內(nèi)，隨著大豆蛋白胨添加量的增加，菌株合成EPS的量也隨著增加，當大豆蛋白胨的添加量為2 g/100 mL時，其產(chǎn)量達到最高（0.685 g/L）；當繼續(xù)增加大豆蛋白胨的量（2～3 g/100 mL范圍內(nèi)），EPS的產(chǎn)量反而隨著減小，因此最終選擇質(zhì)量濃度2 g/100 mL為最適大豆蛋白胨的添加量。

2.5 無機鹽對EPS產(chǎn)量的影響

根據(jù)文獻報道，選取4種鹽類添加到培養(yǎng)基中，由圖6可知，添加Mg2+可以提高EPS產(chǎn)量，達到0.479 g/L，相比未添加的提高了48.3%。

圖6 無機鹽對EPS產(chǎn)量的影響Fig.6 Effect of mineral source on the yield of EPS

無機鹽離子對乳酸菌EPS的合成有著重要影響，與菌體內(nèi)EPS合成酶系轉(zhuǎn)錄和翻譯的調(diào)節(jié)有關(guān)，或是能夠激活某些酶類。研究表明，影響EPS合成的酶一般為糖原水解酶類，該酶類含有2個組分，分別為α-葡萄糖苷酶和β-葡萄糖醛酸糖苷酶；α-葡萄糖苷酶在Na+、K+、Ca2+、Mg2+作用下活性有所提高，而Mn2+則會抑制α-葡萄糖苷酶和β-葡萄糖醛酸糖苷酶的活性[19]。Mg2+可以促進瑞士乳桿菌MB2-1 EPS的產(chǎn)量，而Mn2+的添加會減低EPS產(chǎn)量。

在上述結(jié)果的基礎(chǔ)上，還需將無機鹽離子的質(zhì)量濃度控制在一定的范圍內(nèi)，以保證乳酸菌處于最適合成EPS的環(huán)境中。如圖7所示，當Mg2+的添加量在0～0.2 g/100 mL范圍內(nèi)時，隨著添加量的增加EPS產(chǎn)量也相應提高，且在質(zhì)量濃度0.2 g/100 mL時菌株EPS的產(chǎn)量達到最高（0.477 g/L）；但隨著Mg2+添加量的逐漸增加，EPS的產(chǎn)量反而降低，因此最終選擇質(zhì)量濃度0.2 g/100 mL為最適Mg2+的添加量。

圖 7 MMgg22++添加量對EPS產(chǎn)量的影響Fig.7 Effect of Mg2+concentration on the yield of EPS

2.6 響應面法優(yōu)化EPS產(chǎn)量

2.6.1 因素水平的選擇

綜合上述單因素試驗結(jié)果，可以看出添加大豆蛋白胨后EPS的產(chǎn)量增加最為顯著，其次為Mg2+的添加，發(fā)酵溫度和乳糖添加量的改變對EPS產(chǎn)量增加的效果相一致，但考慮到原料成本問題，最終選取了發(fā)酵溫度、Mg2+添加量和大豆蛋白胨添加量3個因素進行響應面分析。

根據(jù)Box-Behnken試驗設計原理[20]，對影響EPS產(chǎn)量的3個因素（發(fā)酵溫度、Mg2+添加量、大豆蛋白胨添加量）進行三因素三水平的響應面分析試驗，以EPS產(chǎn)量為響應值，試驗方案及結(jié)果見表1。

表1 響應面分析試驗設計組合和響應值Table 1 Experimental design and results for response surface analysis

2.6.2 回歸模型的建立與顯著性分析

利用Design Expert（Version 8.0.6）軟件對表2試驗數(shù)據(jù)進行二次回歸擬合分析，得到瑞士乳桿菌MB2-1 EPS產(chǎn)量（Y）對發(fā)酵溫度（A）、Mg2+添加量（B）和大豆蛋白胨添加量（C）3個因素的二次多項式回歸模型為：Y=－8.510 46＋0.417 89A＋6.245 33B＋0.893 78C＋4.166 67AB－4.458 33AC－5.532 64A2－14.792 5B2－0.156 68C2。

表2 擬合二次多項式模型的方差分析Table 2 Analysis of variance (ANOVA) for the fitted quadratic polynomial mooddeell

由表2可知，模型的P值小于0.000 1，表示該模型是極顯著的，其中各因子的變化對EPS產(chǎn)量的影響不是簡單的線性關(guān)系，與實際試驗的擬合度較好。試驗中回歸方程的線性相關(guān)系數(shù)R2= 0.996 3，擬合度良好，說明試驗各因素對EPS產(chǎn)量的影響很大，即因變量與3個自變量之間的線性關(guān)系顯著。模型的校正系數(shù)R2Adj= 0.991 6，說明該模型能夠解釋0.991 6的響應值變化。失擬項的F值為1.73，P值為0.298 5＞0.05，即失擬不顯著，說明該方程對試驗擬合較好，模型能準確地模擬各因素對EPS產(chǎn)量的影響。

對回歸方程各項進行方差分析，結(jié)合A、B、C各因素的F值大小，可以得出3個因素對EPS產(chǎn)量的影響次序為：大豆蛋白胨添加量＞Mg2+添加量＞發(fā)酵溫度。其中，C、A2、B2、C2以及交互項AC對EPS產(chǎn)量的影響極顯著，BC對其影響顯著，而A、B及交互項AB對其影響不顯著。

2.6.3 響應面分析

響應面圖形是響應值對各實驗因素構(gòu)成的三維空間曲面圖，其表示的是最佳參數(shù)和各參數(shù)之間的相互作用[21]。利用Design Expert（Version 8.0.6）軟件對表1進行處理，可得到回歸方程的響應面及其等高線圖，如圖8所示。

圖8 發(fā)酵溫度、Mg2+添加量與大豆蛋白胨添加量對EPS產(chǎn)量影響的響應面及等高線圖Fig.8 Response surface and contour plots for the effects of culture temperature, Mg2+concentration and soybean peptone concentration on the yield of EPS

一般而言，等高線圖形的性狀可直觀地表現(xiàn)出各因素之間的交互作用是否具有顯著性：圓形曲線表明兩因素間交互作用不顯著，橢圓形曲線則表示具有顯著的交互作用。從圖8可知，發(fā)酵溫度和Mg2+添加量的交互作用不顯著，而發(fā)酵溫度和大豆蛋白胨添加量，以及Mg2+添加量和大豆蛋白胨添加量的交互作用是顯著的。比較各圖結(jié)果可知，大豆蛋白胨添加量對EPS產(chǎn)量的影響最為顯著，表現(xiàn)為曲面最陡，Mg2+添加量對EPS產(chǎn)量的影響其次，而發(fā)酵溫度的影響最小，表現(xiàn)為曲線較為平滑，且隨著數(shù)值的變化，響應值沒有顯著的變化。

2.6.4 發(fā)酵條件的優(yōu)化組合及驗證

從上述結(jié)果可知，回歸模型存在最大值，通過軟件分析得到瑞士乳桿菌MB2-1 EPS產(chǎn)量的最佳條件為：發(fā)酵溫度36.96 ℃、Mg2+添加量為0.2 g/100 mL、大豆蛋白胨添加量為2.19 g/100 mL，在此條件下理論預測最大的EPS產(chǎn)量為816.2 mg/L。

為方便實際操作，調(diào)整各參數(shù)值為：發(fā)酵溫度37 ℃、Mg2+添加量為0.2 g/100 mL和大豆蛋白胨添加量為2.19 g/100 mL，根據(jù)此條件得到的實際EPS產(chǎn)量為801.2 mg/L，比理論值降低了1.83%左右，表明該模型能夠較好的預測實驗結(jié)果。

3 結(jié) 論

本實驗通過單因素試驗分析了高產(chǎn)黏瑞士乳桿菌

MB2-1 EPS產(chǎn)量的最佳發(fā)酵條件，并結(jié)合Box-Behnken的中心組合設計及響應面分析，建立了瑞士乳桿菌MB2-1 EPS發(fā)酵條件的二次多項式模型，并經(jīng)顯著性檢驗證明了該模型具有可靠性。利用模型的響應面分析，得到的最佳發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度37 ℃、Mg2+添加量為

0.2 g/100 mL和大豆蛋白胨添加量為2.19 g/100 mL，此條件下獲得的實際EPS產(chǎn)量為801.2 mg/L。這為今后更深入的研究瑞士乳桿菌MB2-1 EPS結(jié)構(gòu)和抗氧化、抗腫瘤等生理功能以及其機理的闡明奠定了基礎(chǔ)，同時也為EPS在食品和醫(yī)藥中的應用提供了參考價值。

[1] YANG Zhennai, LI Shengyu, ZHANG Xue, et al. Capsular and slime-polysaccharide production by Lactobacillus rhamnosus JAAS8 isolated from Chinese sauerkraut: potential application in fermented milk products[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2010, 110 (1): 53-57.

[2] 凌代文. 乳酸細菌分類鑒定及實驗方法[M]. 北京: 中國輕工業(yè)出版社, 1999.

[3] LAURE J, SEBASTIEN J F V, PHILIPPE D, et al. Exploiting exopolysaccharides from lactic acid bacteria[J]. Antonie van Leeuwenhoek, 2002, 82(1/4): 367-374.

[4] 包怡紅, 梁雪, 李銳達, 等. 產(chǎn)胞外多糖酵母菌株的篩選鑒定及發(fā)酵產(chǎn)糖[J]. 微生物學報, 2010, 50(2): 278-283.

[5] RUAS M P, HUGENHOLTZ J, ZOON P. An overview of the functionality of exopolysaccharides produced by lactic acid bacteria[J]. International Dairy Journal, 2002, 12(2/3): 163-167.

[6] WELMAN A D, MADDOX I S. Exopolysaccharides from lactic acid bacteria: perspectives and challenges[J]. Trends in Biotechnology, 2003, 21(6): 269-274.

[7] PAN Daodong, MEI Xiuming. Antioxidant activity of an exopolysaccharide purified from Lactococcus lactis subsp. lactis 12[J]. Carbohydrate Polymers, 2010, 80(3): 908-914.

[8] VINDEROLA C G, REINHEIMER J A. Culture media for the enumeration of Bifi dobacterium bixdum and Lactobacillus acidophilus in the presence of yoghurt bacteria[J]. International Dairy Journal, 1999, 9(8): 497-505.

[9] 劉俊. 多黏類芽孢桿菌胞外多糖的發(fā)酵條件、結(jié)構(gòu)、化學修飾及其抗氧化活性的研究[D]. 南京: 南京農(nóng)業(yè)大學, 2010.

[10] LI Wei, MAHINUR M, CHEN Xiaohong, et al. Isolation and identification of high viscosity-producing lactic acid bacteria from traditional fermented milk in Xinjiang and its role in fermentation process[J]. European Food Research Technology, 2012, 235(3): 497-505.

[11] 李偉, 紀鵑, 徐希研, 等. 源自新疆賽里木酸奶的瑞士乳桿菌MB2-1莢膜多糖提取及其抗氧化活性[J]. 食品科學, 2012, 33(21): 34-38.

[12] KANMANI P, SATISH K R, YUVARAJ N, et al. Production and purification of a novel exoploysaccharide from lactic acid bacterium Streptococcus phocae PI80 and its functional characteristics activity in vitro[J]. Bioresource Technology, 2011, 102(7): 4827-4833.

[13] GASSEM M A, SCHMIDT K A, FRANK J F. Exopolysaccharide production from whey lactose by fermentation with Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus[J]. Journal of Food Science, 1997, 62(1): 171-173.

[14] KOJIC M, VUJCIC M, BANINA A, et al. Analysis of exopolysaccharide production by Lactobacillus casei CG11, isolated from cheese[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1992, 58(12): 4086-4088.

[15] MOZZI F, ROLLAN G, SAVOY G, DIORI D, et al. Effect of galactose and glucose on the exopolysaccharide production and the activities of biosynthetic enzymes in Lactobacillus casei CRL 87[J]. Journal of Applied Microbiology, 2001, 91(1): 160-167.

[16] XIANG Xiaoli, YANG Liyi, HUA Shuang, et al. Determination of oligosaccharide contents in 19 cultivars of chickpea (Cicer arietinum L.) seeda by high performance liquid chromatography[J]. Food Chemistry, 2008, 111(1): 215-219.

[17] 馮美琴, 邱遠, 張琦, 等. 響應曲面法優(yōu)化植物乳桿菌胞外多糖的醇沉工藝[J]. 食品科學, 2011, 32(19): 188-192.

[18] RODRIGO V S, GUILHERME L S, PHILIP A J G, et al. Structural characterization of an acidic exoheteropolysaccharide produced by the nitrogen-fixing bacterium Burkholderia tropica[J]. Carbohydrate Polymers, 2008, 73(4): 564-572.

[19] 楊冀艷, 胡磊, 許楊. Plackett-Burman設計和響應面法優(yōu)化荷葉總黃酮的提取工藝[J]. 食品科學, 2009, 30(6): 29-33.

[20] 吳有煒. 試驗設計與數(shù)據(jù)處理[M]. 蘇州: 蘇州大學出版社, 2002.

[21] 李清春, 張景強, 賀稚非. 乳酸菌胞外多糖的研究[J]. 電子科技大學學報, 2003, 32(6): 764-769.

Optimization of Fermentation Conditions for the Production of Exopolysaccharides by Lactobacillus helveticus MB2-1

JI Juan, LI Wei, CHEN Xiao-hong, JIANG Mei, RUI Xin, DONG Ming-sheng*
(College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

The fermentation conditions for the production of exopolysaccharides (EPS) by Lactobacillus helveticus MB2-1 isolated from Sayram traditional yogurt in Xinjiang were optimized. The effects of culture temperature, lactose concentration, nitrogen source and concentration, and mineral source and concentration on EPS yield were studied through single factor analysis. Response surface analysis (RSM) involving three independent variables at three different levels was carried out to determine the optimal process conditions by using Box-Behnken method. Results showed that the optimum extraction conditions were 37 ℃, 0.2 g/100 mL and 2 g/100 mL for culture temperature, Mg2+concentration and soybean peptone concentration, respectively. Under these conditions, the yield of EPS by L. helveticus MB2-1 was as high as 801.2 mg/L.

Lactobacillus helveticus MB2-1; exopolysaccharides (EPS); fermentation; response surface methodology (RSM)

TS201.3

A

1002-6630（2014）07-0095-07

10.7506/spkx1002-6630-201407020

2013-04-12

國家自然科學基金青年科學基金項目（31201422）；國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（863計劃）項目（2011AA100903；2013BAD18B01-4）；江蘇省自然科學基金項目（BK2011651）；教育部博士點基金項目（新教師類）（20110097120028）；國家農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項目（2012GB23600639）；江蘇高校優(yōu)勢學科建設工程資助項目（PAPD）

紀鵑（1989—），女，碩士研究生，研究方向為食品微生物。E-mail：2011108011@njau.edu.cn

*通信作者：董明盛（1961—），男，教授，博士，研究方向為食品微生物與生物技術(shù)。E-mail：dongms@njau.edu.cn