夏光華，賀 敏，詹麒平，薛長湖，王靜鳳*

（中國海洋大學食品科學與工程學院，山東 青島 266003）

鯽魚卵唾液酸糖蛋白化學結構分析及對前成骨細胞MC3T3-E1增殖分化的影響

夏光華，賀 敏，詹麒平，薛長湖，王靜鳳*

（中國海洋大學食品科學與工程學院，山東 青島 266003）

目的：成熟的鯽魚卵經(jīng)提取、分離純化得到唾液酸糖蛋白（sialyglycoproteins of Carassius auratus eggs，CA-SGP），分析其化學結構，及對前成 骨細胞MC3T3-E1增殖分化的影響。方法：采用水提法從成熟鯽魚卵中提取水溶性蛋白，經(jīng)陰離子交換色譜、凝膠過濾色譜分離純化鯽魚卵水溶性蛋白得到CA-SGP，測定其基本組 成，采用高效凝膠液相色譜和聚丙烯酰胺凝膠電泳測定其分子質量和純度，PMP柱前衍生高效液相色譜法測定其單糖組成；采用噻唑藍法測定MC3T3-E1細胞的增殖率，酶聯(lián)免疫法測定Ⅰ型膠原蛋白（collagen type Ⅰ，COLⅠ）和骨鈣素（osteocalcin，OCN）的分泌量及堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）的活性，茜素紅染色法測定礦化結節(jié)的數(shù)量。結果：得到單一的組分CA-SGP，在高效凝膠過濾色譜色譜圖上呈現(xiàn)單一的糖和蛋白的檢測重疊峰，在凝膠電泳圖上呈現(xiàn)單一彌散性條帶，其蛋白質含量為14.33%，己糖含量為62.81%，N-乙酰神經(jīng)氨酸（N-acetylneurainic acid，Neu5Ac）含量為19.72%。單糖組成測定結果顯示：CA-SGP主要由甘露糖、葡萄糖胺、半乳糖胺組成，其物質的量比為7.61∶6.70∶1.00；MC3T3-E1細胞與CA-SGP共同孵育后，其增殖率顯著增加，COLⅠ和OCN的分泌量分別增加了39.28%和83.06%，ALP活性提高了285.08%，礦化結節(jié)的數(shù)量增加了96.41%，說明CA-SGP顯著促進MC3T3-E1細胞增殖、分化和礦化。結論：CA-SGP為富含Neu5Ac的糖蛋白，具有顯著促進MC3T3-E1細胞增殖、分化和礦化的作用，對開發(fā)抗骨質疏松功能性食品具有重要意義。

鯽魚卵唾液酸糖蛋白；分離純化；MC3T3-E1細胞；增殖；分化

骨內穩(wěn)態(tài)由成骨細胞介導的骨形成和破骨細胞介導的骨吸收的平衡來維持，骨內穩(wěn)態(tài)失衡后會導致包括骨質疏松在內的一系列疾病。骨質疏松是由于體內骨吸收強于骨形成而導致的慢性進行性疾病[1]。隨著人口老齡化趨勢的發(fā)展，骨質疏松已成為全人類的健康問題，全世界患病人數(shù)已超過2 億[2]，被世界衛(wèi)生組織列為三大老年病之一。成骨細胞在調控骨代謝中起著關鍵作用，成骨細胞[3]是骨形成中最重要的功能細胞，其增殖分化是骨形成的關鍵，而且，成骨細胞通過分泌骨保護素（osteoprotegerin，OPG）和核因子κB受體活化因子配體（receptor activator for nuclear factor- κB ligand，RANKL）調節(jié)破骨細胞的形成和活性，從而調控骨吸收作用。因此，調控成骨細胞活性對治療骨質疏松具有重要意義。目前，市場上用于治療骨質疏松的藥物主要包括雌激素、降鈣素、雙磷酸鹽、他汀類藥物等[4]，但長期服用具有較強的毒副作用。因此，尋找安全有效防治骨質疏松的功能因子具有重要研究意義。

魚卵是魚類加工過程中產生的主要副產物之一，包含了胚胎發(fā)育所必需的全部營養(yǎng)和生物活性物質，富含多不飽和脂肪酸、卵磷脂、糖蛋白等多種功效成分。有關魚卵高值化加工和利用的研究，主要集中在功能性脂質[5]方面，而魚卵糖蛋白的高值化加工利用尚未引起關注。課題組前期以MC3T3-E1細胞為模型，經(jīng)大量篩選發(fā)現(xiàn)魚卵水溶性蛋白中的唾液酸含量與其促進成骨細胞增殖活性呈正相關，其中，鯽魚卵水溶性蛋白中唾液酸的含量最高。

本實驗以鯽魚卵為原料提取水溶性蛋白，采用QFF陰離子交換色譜和凝膠過濾色譜分離得到唾液酸糖蛋白（sialyglycoproteins of Carassius auratus eggs，CA-SGP），鑒定其唾液酸糖蛋白特性并分析其化學結構，研究其對MC3T3-E1細胞增殖、Ⅰ型膠原蛋白（collagen type Ⅰ，COLⅠ）和骨鈣素（osteocalcin，OCN）的分泌量、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性和礦化結節(jié)形成量的影響，以期為開發(fā)治療骨質疏松安全有效的功能性食品提供理論依據(jù)，促進魚卵高值化利用。

1 材料與方法

1.1 材料

成熟鮮活的雌性鯽魚，購于青島大連路水產品市場，在冰浴條件下取魚卵并去除卵包膜，魚卵于－80 ℃保存?zhèn)溆?；小鼠成骨細胞株MC3T3-E1，購于美國菌種保藏中心。

1.2 試劑

α-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清 Gibco公司；葡聚糖系列標準品、N-乙酰神經(jīng)氨酸（N-acetylneurainic acid， Neu5Ac）、抗壞血酸、β-磷酸甘油、茜素紅 美國Sigma公司；堿性磷酸酶檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所；小鼠骨鈣素和Ⅰ型膠原蛋白ELISA檢測試劑盒 美國R&D公司；鄰苯二氨鹽酸 美國BBI公司；Q Sepharose Fast Flow（QFF）填料、Sephacryl S-200（S-200）填料 美國GE公司；其他試劑均為國產分析純。

1.3 儀器與設備

BJ5060UV型CO2培養(yǎng)箱 德國Heraeus公司；電泳儀、680型酶標儀 美國Bio-Rad公司；IX51倒置顯微鏡系統(tǒng) 日本Olympus公司；JS-780型全自動凝膠成像分析儀 上海培清科技有限公司；1100高效液相色譜儀美國Agilent公司；AKTA UPC 100 FPLC蛋白純化系統(tǒng)美國GE公司。

1.4 方法

1.4.1 CA-SGP的分離純化及鑒定

鯽魚卵清洗、除雜后，勻漿研磨，加入等體積的蒸餾水浸提30 min，雙層紗布過濾，浸提液于8 000 r/min條件下離心15 min，上清液加入等體積的90%苯酚溶液，攪拌2～3 h后離心，將上清液透析3 d即得粗糖蛋白。粗糖蛋白緩慢上樣于QFF陰離子交換柱（緩沖液為0.02 mol/L Tris-HCl，pH 8.0），采用0～1 mol/L NaCl（溶于0.02 mol/L Tris-HCl，pH 8.0緩沖液）進行梯度洗脫，每管收集8 mL，分別測定各管多糖含量（硫酸苯酚法）及280 nm波長處的吸光度，繪制洗脫曲線，收集并合并各洗脫峰，測定各峰的Neu5Ac含量。富含Neu5Ac的組分采用S-200凝膠柱進一步分離純化，含唾液酸組分經(jīng)G-25凝膠柱脫鹽后凍干，得到純CA-SGP，并用高效凝膠液相色譜（high-performance size-exclusion chromatography，HPSEC）和十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）鑒定其糖蛋白特性。

1.4.2 CA-SGP的分子質量及純度測定

分子質量測定采用HPSEC法[6]，以葡聚糖系列物為標準品。純度測定和糖蛋白鑒定采用SDS-PAGE[7]和HPSEC法[6]。

1.4.3 CA-SGP基本組成分析

蛋白質含量測定采用Folin-酚法[8]；總糖含量測定采用硫酸苯酚法[9]；Neu5Ac含量測定采用柱前衍生二極管陣列/熒光檢測器串聯(lián)高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）[10]；磷含量測定采用鉬藍比色法[11]；單糖組成測定采用PMP柱前衍生-HPLC法[6]。

1.4.4 MC3T3-E1細胞的培養(yǎng)

MC3T3-E1細胞培養(yǎng)于含10%（V/V）胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基（含100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素）中。以0.25%的胰酶消化傳代，于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，平均每2～3 d傳代1 次，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.4.5 MC3T3-E1細胞增殖活性檢測

調整細胞密度為1.5×104個/mL，接種于96孔板，每孔100 μL。24 h后，換含不同質量濃度CA-SGP（0、50、100、200、400 μg/mL）的完全培養(yǎng)基，每組4 復孔，200 μL/孔。分別培養(yǎng)48、72、96 h后，加入噻唑藍溶液（終質量濃度0.5 mg/mL），200 μL/孔，孵育4 h。棄上清，加入酸化異丙醇，200 μL/孔，吹打使其充分溶解，于酶標儀570 nm波長處檢測各光密度（OD）值，細胞增殖活性按照公式（1）表示。

1.4.6 MC3T3-E1細胞COLⅠ和OCN含量測定

取密度為2×104個/mL的MC3T3-E1細胞接種于24 孔板，每孔1 mL，24 h后，換含0、50、100、200、400 μg/mL CA-SGP的完全培養(yǎng)液，分別培養(yǎng)7 d或14 d后，收集培養(yǎng)液，參照酶聯(lián)免疫吸附測定法（enzy me-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒方法檢測COLⅠ和OCN含量。

1.4.7 MC3T3-E1細胞堿性磷酸酶活性檢測

調整細胞密度為2×104個/mL，接種于24 孔板，每孔1 mL，24 h后，分別用0、50、100、200、400 μg/mL的CA-SGP干預，培養(yǎng)7 d后，棄培養(yǎng)液，每孔加入200 μL細胞裂解液（1% TritonX-100），取上清，按ALP試劑盒說明書步驟測ALP含量，計算相對ALP活力。

1.4.8 MC3T3-E1細胞礦化結節(jié)的測定

調整細胞密度為2×104個/mL，接種于24孔板，每孔1 mL，待細胞融合后，棄培養(yǎng)液，換含0、50、100、200 μg/mL CA-SGP的分化完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，分化完全培養(yǎng)液中含50 μg/mL的抗壞血酸和10 mmol/L的β-磷酸甘油，每2 d換液1次。于第21天將細胞用4%中性甲醛固定15 min，0.1%茜素紅-Tris溶液染色30 min后，水洗，于倒置顯微鏡下觀察并拍照。加入100 mmol/L的氯化十六烷基吡啶溶解細胞中的茜素紅，于570 nm波長處測定光密度（OD）值，半定量檢測細胞礦化程度。

1.5 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)分析采用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析，同時進行LSD法進行兩兩比較，P＜0.05為差異顯著，實驗結果用±s表示。

2 結果與分析

2.1 CA-SGP的分離純化及鑒定

如圖1所示，鯽魚卵粗蛋白經(jīng)過QFF陰離子交換色譜純化后，得到6 個組分，各組分蛋白和糖的檢測峰均重疊，說明各組分均為糖蛋白。F-1～F-6組分的Neu5Ac含量分別為6.69%、16.55%、0.43%、0.19%、0.25%、0%， F-2組分的含量最高。采用S-200 凝膠過濾色譜對F-2組分進一步純化，得到了S-1組分，其蛋白和糖的檢測峰重疊，Neu5Ac含量為19.72%，說明S-1組分為鯽魚卵唾液酸糖蛋白（CA-SGP）。

圖1 CA-SGP的分離純化色譜圖Fig.1 Elution curves on QFF and Sephacryl S-200 of CA-SGP

2.2 CA-SGP的糖蛋白特性鑒定及分子質量測定

圖2 CA-SGP的高效液相凝膠色譜及SDS-PAGE電泳圖Fig.2 HPSEC and SDS-PAGE profiles of CA-SGP

CA-SGP在HPSEC圖中呈現(xiàn)單一狹窄對稱的蛋白和糖的檢測重疊峰（圖2A），且在凝膠電泳 PAS染色圖中呈現(xiàn)單一彌散性的紅色條帶（圖2B），表明CA-SGP為唾液酸糖蛋白，根據(jù)HPSEC峰面積計算，純度為94.76%。采用HPSEC測得CA-SGP的分子質量為195.35 kD。

2.3 CA-SGP的基本組成分析

圖3 CA-SGP多糖水解液PMP衍生物的高效液相色譜圖Fig.3 HPLC separation of PMP derivatives of CA-SGP hydrolysate

CA-SGP中蛋白質含量為14.33%，己糖含量為62.81%，Neu5Ac含量為19.72%，不含磷。其單糖組成分析如圖3所示，CA-SGP主要由甘露糖（ketodeoxynonulonsonic acid，Man）、葡萄糖胺（glucosamine，GlcN）、半乳糖胺（galactosamine，GalN）組成，其物質的量比為7.61 ∶6.70∶1.00。

2.4 CA-SGP促進MC3T3-E1細胞增殖

圖4 CA-SGP對MC3T3-E1細胞增殖的影響Fig.4 Effect of CA-SGP on proliferation of MC3T3-E1 cells

如圖4所示，CA-SGP顯著提高MC3T3-E1細胞的增殖活性，并且劑量-效應和時間-效應關系顯著。當培養(yǎng)96 h、CA-SGP的質量濃度為400 μg/mL時，MC3T3-E1細胞增殖率達到153.57%。說明CA-SGP具有顯著促進MC3T3-E1增殖的作用。

2.5 CA-SGP促進MC3T3-E1細胞分泌COLⅠ

圖5 CA-SGP對MC3T3-E1細胞分泌COLⅠ的影響Fig.5 Effect of CA-SGP on COLⅠ secretion of MC3T3-E1 cells

COLⅠ是骨組織形成的先決條件和成骨細胞分化最早的標志[12]。如圖5所示，CA-SGP顯著促進MC3T3-E1細胞分泌COLⅠ，并具有劑量-效應，當質量濃度為400 μg/mL時，COLⅠ分泌量為對照組的1.39 倍。表明CA-SGP顯著促進MC3T3-E1細胞分泌COLⅠ。

2.6 CA-SGP提高MC3T3-E1細胞ALP活性

圖6 CA-SGP對MC3T3-E1細胞ALP活性的影響Fig.6 Effect of CA-SGP on ALP activity of MC3T3-E1 cells

ALP是一種同 源二聚體糖蛋白，其主要作用是促進成骨細胞成熟和礦化，是成骨細胞分化和細胞外基質成熟的早期標志[13]。由圖6可知，CA-SGP顯著提高MC3T3-E1細胞ALP活力，并且劑量-效應關系顯著，當質量濃度為400 μg/mL時，ALP活力較對照組提高了285.08%（P＜0.01）。說明CA-SGP顯著提高MC3T3-E1細胞ALP活力。

2.7 CA-SGP促進MC3T3-E1細胞分泌OCN

圖7 CA-SGP對MC3T3-E1細胞分泌OCN的影響Fig.7 Effect of CA-SGP on OCN secretion of MC3T3-E1 cell s

OCN是成骨細胞特異合成和分泌的一種非膠原蛋白，具有維持骨組織正常礦化的作用，是成骨細胞成熟的標志物[14]。如圖7所示，CA-SGP顯著促進MC3T3-E1細胞分泌OCN，當質量濃度為400 μg/mL時，OCN的分泌量較對照組增加了83.06%。表明CA-SGP顯著促進MC3T3-E1細胞分泌OCN。

2.8 CA-SGP促進MC3T3-E1細胞形成礦化結節(jié)

成骨細胞在分化成熟后進入基質礦化期，礦化結節(jié)的形成能力是成骨功能的直觀表現(xiàn)[15]。與正常對照組相比，CA-SGP組礦化結節(jié)量明顯增多，且劑量效應-關系顯著（圖8A）。當CA-SGP質量濃度為200 μg/mL時，礦化結節(jié)量較對照組增加了96.41%（P＜0.01）（圖8B）。表明CA-SGP具有顯著促進骨形成作用。

圖8 CA-SGP對MC3T3-E1細胞形成礦化結節(jié)的影響Fig.8 Effect of CA-SGP on mineralization of MC3T3-E1 cells

5 討 論

鯽魚卵水溶性蛋白經(jīng)分離純化得到CA-SGP，鑒定了其唾液酸糖蛋白特性并分析其化學結構，探討其對MC3T3-E1細胞增殖、COLⅠ和OCN分泌量、ALP活性和礦化結節(jié)形成量的影響。結果表明：CA-SGP為唾液酸糖蛋白，分子質量為195.35 kD，Neu5Ac含量為19.72%?；钚詫嶒灲Y果顯示：CA-SGP顯著促進MC3T3-E1細胞增殖，增加COLⅠ和OCN的分泌量，提高ALP的活性，促進礦化結節(jié)的產生。表明鯽魚卵唾液酸糖蛋白具有顯著促進骨形成作用。

魚卵唾液酸糖蛋白由Inoue等[16]首次發(fā)現(xiàn)從虹鱒魚卵中提取水溶性 蛋白，經(jīng)苯酚除雜蛋白、DEAESephadex A-25陰離子交換色譜、S-200凝膠過濾色譜分離純化得到唾液酸糖蛋白，其唾液酸含量為50%，蛋白含量為分子質量200 kD。采用以上方法陸續(xù)從青鳉[17]、鯡魚[18]、大馬哈魚[19]等中提取魚卵唾液酸糖蛋白，并發(fā)現(xiàn)魚卵唾液酸糖蛋白總糖含量為80%～90%。本實驗從鯽魚卵中提取CA-SGP，其己糖含量為62.81%，Neu5Ac含量為19.72%，分子質量為195.35 kD，與Inoue等[16]結果相似，說明CA-SGP為鯽魚卵唾液酸糖蛋白，有關CA-SGP的精細結構尚在研究中。

成骨細胞在調控骨形成/骨吸收平衡中起著極其重要的作用。在骨形成過程中，成骨細胞要經(jīng)歷了增殖、分化、礦化等階段[20]。COLⅠ、ALP和OCN是成骨細胞不同分化時期標志物，礦化結節(jié)是成骨細胞礦化的直觀表現(xiàn)。Ji等[21]發(fā)現(xiàn)雞蛋卵黃水溶性蛋白顯著促進MC3T3-E1細胞增殖、分化和礦化，具有促進骨形成作用。Koketsu[22]、Kim[23]等研究結果表明 雞蛋卵黃水溶性蛋白及其水解物中促進骨形成作用的主要成分與唾液酸糖蛋白有關。本實驗從鯽魚卵中提取的CA-SGP顯著提高MC3T3-E1細胞增殖，提高ALP的活性，增加COLⅠ和OCN的分泌量，并促進礦化結節(jié)的產生，說明CA-SGP具有顯著促進MC3T3-E1細胞增殖、分化和礦化的作用。有關CA-SGP對破骨細胞的作用及體內驗證實驗尚在研究中。

綜上所述，CA-SGP為富含Neu5Ac的糖蛋白，具有顯著促進MC3T3-E1細胞增 殖、分化和礦化的作用。

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Chemical Structure Analysis of Sialyglycoproteins of Crucian Carp Carassius auratus Eggs and the Effect of the Sialyglycoproteins on Proliferation and Differentiation of MC3T3-E1 Cells

XIA Guang-hua, HE Min, ZHAN Qi-ping, XUE Chang-hu, WANG Jing-feng*

(College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

This study was designed to investigate the chemical structure of sialyglycoproteins from crucian carp Carassius auratus eggs (CA-SGP) and the effects of CA-SGP on the proliferation, differentiation and mineralization of MC3T3-E1 cells. CA-SGP was isolated from the water soluble protein of crucian carp eggs using anion exchange chromatography and gel exclusion chromatography, and its composition was determined. The proliferation of MC3T3-E1 cells was determined by MTT assay, the secretion of collagen type (COLⅠ）, alkaline phosphatase (ALP), and osteocalcin (OCN) were detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELI SA) and the mineralized nodule of MC3T3-E1 cells was evaluated by staining with Ali zarin red S dye. The analysis of chemical structure showed that the CA-SGP was composed of 14.33% protein and 62.81% carbohydrates in which the content of N-acetylneurainic acid (Neu5Ac) was 19.72%, and the monosaccharide composition of CA-SGP was Man, GlcN, GalN, and Neu5Ac. The activity assays indicated that the CA-SGP effectively promoted the proliferation of MC3T3-E1 cells, significantly increased the secretion of ALP, OCN and COLⅠand enhanced the mineralization ability. In conclusion, CA-SGP significantly promotes the proliferation, differentiation and mineralization of MC3T3-E1 cells and can be used as an active ingredient in a safe and effective anti-osteoporosis functional food.

sialyglycoproteins; isolation and purification; MC3T3-E1 cell; proliferation; differentiation

TS254.4

A

1002-6630（2014）13-0203-05

10.7506/spkx1002-6630-201413039

2014-05-25

國家自然科學基金面上項目（31371876）；山東省自主創(chuàng)新專項（2012CX80201）；

教育部“長江學者和創(chuàng)新團隊發(fā)展計劃”項目（IRT1188）

夏光華（1987—），男，博士研究生，研究方向為海洋生物活性物質。E-mail：xiaguanghua2011@126.com

*通信作者：王靜鳳（1964—），女，教授，博士，研究方向為海洋生物活性物質和分子營養(yǎng)。E-mail：jfwang@ouc. edu.cn