祝 霞，盛文軍，楊學(xué)山，王 婧，李 敏，張 波，翦 祎，韓舜愈,*

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

紅佳釀酵母β-葡萄糖苷酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)

祝 霞1，盛文軍1，楊學(xué)山2，王 婧1，李 敏1，張 波1，翦 祎1，韓舜愈1,*

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

以紅佳釀釀酒酵母為出發(fā)菌株，通過(guò)離子交換法分離純化β-葡萄糖苷酶，測(cè)定酶活力和蛋白質(zhì)含量，并研究溫度、pH值穩(wěn)定性和金屬離子、葡萄糖、酒精度對(duì)酶活力的影響。結(jié)果表明：粗酶液經(jīng)過(guò)離子交換層析后，純化倍數(shù)為19.41，得率為38.67%；經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）電泳檢測(cè)為1 條譜帶，達(dá)到電泳純，分子質(zhì)量約為45 kD；β-葡萄糖苷酶熱穩(wěn)定性較差，在20～40 ℃較穩(wěn)定，在pH 5.0～10.0較穩(wěn)定；Al3+、Cu2+對(duì)酶活力有抑制作用，K+、Mg2+、Ca2+、Zn2+、Na+對(duì)酶活力的影響不明顯；葡萄糖和酒精對(duì)酶活力無(wú)明顯抑制作用。

紅佳釀酵母；β-葡萄糖苷酶；分離純化；酶學(xué)性質(zhì)

葡萄果實(shí)中存在大量不具有揮發(fā)性、無(wú)味的糖苷鍵合態(tài)風(fēng)味前體物質(zhì)，該成分可通過(guò)釀造過(guò)程釋放出來(lái)，呈現(xiàn)葡萄品種獨(dú)特的風(fēng)味，是影響葡萄酒質(zhì)量的關(guān)鍵因素之一[1-2]。β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，BGL，EC3.2.1.21）可以水解葡萄糖苷鍵釋放出相應(yīng)的糖苷配基[3-4]，將其轉(zhuǎn)化為有香味的游離態(tài)香氣物質(zhì)從而改善葡萄酒香氣[5]。

目前，國(guó)內(nèi)外提高葡萄酒芳香潛力的研究，主要通過(guò)外加風(fēng)味酶實(shí)現(xiàn)，不但增加了生產(chǎn)成本，而且也存在一些問(wèn)題[6-7]。例如葡萄汁和葡萄酒具有高含糖量、高酒精含量及低pH值等特殊性質(zhì)，應(yīng)用植物來(lái)源的β-葡萄糖苷酶活性很低，甚至完全失活，無(wú)法使游離態(tài)香味物質(zhì)充分釋放[8]；從真菌、霉菌中分離的商業(yè)化β-葡萄糖苷酶是一些非特異性葡聚糖酶的混合物，有報(bào)道指其只能水解3%的前體物，且由于葡聚糖酶的非特異性，可能會(huì)引發(fā)分解產(chǎn)生的香氣不自然等不利于產(chǎn)品品質(zhì)的反應(yīng)[9-11]。Chen Mei等[12]的研究結(jié)果表明，提高葡萄酒中游離態(tài)香味物質(zhì)最好的方法是利用釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶，此酶活力適當(dāng)，是釀酒體系的一部分，能夠適應(yīng)釀酒條件。實(shí)際生產(chǎn)中，釀酒酵母在發(fā)酵過(guò)程中只表現(xiàn)出非常弱β-葡萄糖苷酶活性，發(fā)酵完成后大多數(shù)的鍵合態(tài)風(fēng)味前體物仍然未被釋放[13-14]。因此系統(tǒng)研究釀酒酵母所產(chǎn)β-葡萄糖苷酶性質(zhì)，使其表現(xiàn)出良好的催化活性、有效地釋放香氣物質(zhì)，是定向修飾葡萄酒風(fēng)味品質(zhì)亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題之一。

本實(shí)驗(yàn)以甘肅河西地區(qū)莫高、紫軒、祁連等葡萄酒廠釀造干紅葡萄酒使用的紅佳釀活性干酵母為出發(fā)菌株，分離純化β-葡萄糖苷酶，深入分析其酶學(xué)性質(zhì)，以期通過(guò)調(diào)控發(fā)酵條件，提升發(fā)酵體系中β-糖苷酶活性，使葡萄酒中鍵合態(tài)香氣物質(zhì)釋放達(dá)到最佳狀態(tài)。

1 材料與方法

1.1 菌種與試劑

紅佳釀酵母 意大利Enartis公司。

對(duì)-硝基苯酚-β-D-葡萄糖苷（p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside，p-NPG） 美國(guó)Sigma公司；DEAE-52北京拜爾迪生物科技公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

BS-16A自動(dòng)部分收集器、HL-2B數(shù)顯恒流泵、TH-300A梯度混合器 上海青浦滬西儀器廠有限公司；SHB-III循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長(zhǎng)城科貿(mào)有限公司；TU-1810紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；SCIENTZ-ⅡD超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；SL-1001電子天平 上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；TDZ5-WS離心機(jī) 湘儀離心機(jī)儀器有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 國(guó)華電器有限公司；PHS-3C精密pH計(jì) 上海雷磁有限公司。

1.3 培養(yǎng)基

產(chǎn)酶培養(yǎng)基制備[15]：1 g/100 mL酵母膏、2 g/100 mL蛋白胨，取250 mL的三角瓶按20%的裝樣量分裝，121 ℃滅菌20 min。取出滅菌后的三角瓶，冷卻到60～70 ℃后每個(gè)三角瓶加入0.1% p-NPG底物。

1.4 方法

1.4.1 紅佳釀酵母β-葡萄糖苷酶分離純化技術(shù)路線(xiàn)

菌株活化→擴(kuò)大培養(yǎng)→β-葡萄糖苷酶分離提取→丙酮沉淀→DEAE-SephadexA-52柱層析→測(cè)定酶活力→合并活性組分→濃縮→純化酶

1.4.2 操作要點(diǎn)

1.4.2.1 酵母菌株活化

取適量紅佳釀活性干酵母，分別置于少許待接種的液體培養(yǎng)基中30 ℃水浴保溫30 min。

1.4.2.2 擴(kuò)大培養(yǎng)

將活化后的酵母接種至產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，30 ℃、150 r/min培養(yǎng)48 h。

1.4.2.3 酵母產(chǎn)β-葡萄糖苷酶提取[16]

將發(fā)酵液4 000 r/min離心20 min，棄掉上清液，蒸餾水洗滌，4 000 r/min離心10 min，棄去上清；用pH 6.2的緩沖液清洗沉淀后4 000 r/min離心10 min，反復(fù)兩次。洗滌后棄去上清液，加入10 mL左右緩沖液，超聲波功率400 W、破碎16 min，4 000 r/min離心20 min，收集上清液。

1.4.2.4 丙酮沉淀

將提取的上清液加1.25 倍體積冷丙酮，攪拌均勻，靜置20 min，離心收集沉淀物，加適量pH 6.2的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液，溶解沉淀，將溶解液過(guò)0.22 μm濾膜，收集濾液即為粗酶液。

1.4.2.5 DEAE-SephadexA-52柱層析

將過(guò)膜后的溶解液2 mL上樣至NaH2PO4-Na2HPO4（pH 6.2）平衡好的DEAE-SephadexA-52層析柱中，用0～1 mol/L NaCl溶液線(xiàn)性梯度洗脫，流速1 mL/min，每管3 mL。

1.4.2.6 β-葡萄糖苷酶純度的測(cè)定

采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）法[17]。5%濃縮膠，10%分離膠，濃縮電壓80 V，分離電壓120 V，當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑到達(dá)距電泳槽底部0.5 cm時(shí)結(jié)束電泳。將凝膠從玻璃板上輕輕剝下，考馬斯亮藍(lán)染色30 min，脫色至蛋白質(zhì)條帶清晰可見(jiàn)。

1.4.2.7 β-葡萄糖苷酶活力測(cè)定[18]

樣品試管中取0.1 mL適當(dāng)稀釋的酶液，加入0.9 mL pH 6.2的0.2 mol/L Na2HPO4-0.1 mol/L檸檬酸緩沖溶液，于45 ℃水浴預(yù)熱10 min；加入已預(yù)熱10 min的1 mL 5 mmol/L p-NPG溶液，計(jì)時(shí)；13 min后立即加入2 mL 1 mol/L Na2CO3溶液終止反應(yīng)；室溫放置5 min，測(cè)定吸光度（A400nm）。

空白對(duì)照試管中加入0.1 mL沸水加熱失活的酶液，按同樣方法處理。

酶活力單位定義：1 個(gè)酶活力單位（U）定義為每分鐘水解p-NPG產(chǎn)生1 μmol對(duì)硝基苯酚所需的酶量。

1.4.3 β-葡萄糖苷酶酶學(xué)性質(zhì)研究

1.4.3.1 β-葡萄糖苷酶熱穩(wěn)定性

將純化后的β-葡萄糖苷酶分別置于20、30、40、50、60、70、80 ℃條件下保溫20、40、60 min，冷卻后測(cè)定酶活力。計(jì)算相對(duì)酶活力（以4 ℃保存的原酶液酶活力為100%），評(píng)價(jià)β-葡萄糖苷酶的熱穩(wěn)定性。

1.4.3.2 β-葡萄糖苷酶pH值穩(wěn)定性

分別在0.8 mL pH值分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0的緩沖液中，加入0.2 mL酶液，4 ℃保溫24 h，分別測(cè)定剩余酶活力，計(jì)算相對(duì)酶活力（以加入0.8 mL雙蒸水中酶活力為100%）。

1.4.3.3 金屬離子對(duì)β-葡萄糖苷酶活力的影響

取純化后的酶液0.1 mL，分別加入0.9 mL 10 mmol/L葡萄酒中常見(jiàn)的金屬離子K+、Mg2+、Ca2+、Na+、Al2+、Zn2+和Cu2+，25 ℃保溫4 h，測(cè)定酶活力，計(jì)算相對(duì)酶活力（以未加入金屬離子的酶液酶活力為100%）。

1.4.3.4 酒精度對(duì)β-葡萄糖苷酶活力的影響

取純化后酶液0.1 mL，加入0.9 mL含5%、10%、15%、20%酒精的緩沖液中，25 ℃保溫4 h，測(cè)定酶活力，計(jì)算相對(duì)酶活力（以未加入酒精的酶液酶活力為100%）。

1.4.3.5 葡萄糖對(duì)β-葡萄糖苷酶活力的影響

取純化后酶液0.1 mL，加入0.9 mL含5、10、15、20 g/100 mL葡萄糖的緩沖液中，25 ℃保溫4 h測(cè)定酶活力，計(jì)算相對(duì)酶活力（以未加葡萄糖的酶液酶活力為100%）。

2 結(jié)果與分析

2.1 β-葡萄糖苷酶的分離純化

2.1.1 DEAE-SephadexA-52層析結(jié)果

經(jīng)冷丙酮沉淀后的酶液經(jīng)DEAE-SephadexA-52陰離子交換柱層析洗脫，洗脫曲線(xiàn)如圖1所示。洗脫過(guò)程中共收集到3 個(gè)蛋白峰，對(duì)每個(gè)蛋白峰以p-NPG為底物檢測(cè)酶活力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)峰值最高的第2個(gè)為活性峰，說(shuō)明目的酶與雜蛋白得到較好的分離。

圖1 DEAE-SephadexA-52離子層析分離β-葡萄糖苷酶Fig.1 Elution profile of β-glucosidase on DEAE-SephadexA-52 column

2.1.2 β-葡萄糖苷酶純化結(jié)果

表 11 β-葡萄糖苷酶純化結(jié)果Table 1 Summery of the purification procedures of β-glucosiiddaassee

酶液經(jīng)過(guò)冷丙酮沉淀及陰離子交換層析純化后，對(duì)每一步分離得到的酶液進(jìn)行蛋白質(zhì)含量和酶活力測(cè)定，并計(jì)算β-葡萄糖苷酶比活力、純化倍數(shù)和得率，結(jié)果見(jiàn)表1。在提取的各個(gè)步驟中，β-葡萄糖苷酶的比活力逐漸上升，由323.286 U/mg上升至6 276.470 U/mg，酶被純化了19.41 倍，說(shuō)明β-葡萄糖苷酶經(jīng)過(guò)冷丙酮沉淀及DEAESephadexA-52柱層析，除去了大量的雜蛋白。酶的得率達(dá)38.67%，由此可見(jiàn)，隨著提純步驟的進(jìn)行，β-葡萄糖苷酶純度逐漸提高，比活力逐漸上升。

2.1.3 β-葡萄糖苷酶純度鑒定

為驗(yàn)證純化后的樣品是否已經(jīng)達(dá)到電泳純水平，取分離純化后的β-葡萄糖苷酶，合并濃縮后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，如圖2所示。圖中濃縮液只顯示1 條蛋白帶，說(shuō)明純化后的β-葡萄糖苷酶達(dá)到電泳純。對(duì)照Marker得酵母菌中β-葡萄糖苷酶的分子質(zhì)量約為45 kD。

圖2 2 β-葡萄糖苷酶純化SDS-PAGE圖譜AGEFig.2 SDS-PAGE of the purified β-glucosidase

2.2 β-葡萄糖苷酶酶學(xué)性質(zhì)研究結(jié)果

2.2.1 溫度穩(wěn)定性

圖3 3 β-葡萄糖苷酶的熱穩(wěn)定性Fig.3 Thermalstability of β-glucosisase

以p-NPG為底物測(cè)定酶活力，分析酶的溫度穩(wěn)定性，結(jié)果如圖3所示。β-葡萄糖苷酶在溫度50 ℃以下（20、30、40 ℃）保溫20 min，酶活力下降不明顯，保溫60 min后酶活力均保留在60%以上；溫度大于等于50 ℃（50、60、70、80 ℃）條件下20 min內(nèi)酶活力便急劇下降，均在20%以下。由此可知，β-葡萄糖苷酶在20～40 ℃之間具有較好的熱穩(wěn)定性。

2.2.2 pH值穩(wěn)定性

如圖4所示，β-葡萄糖苷酶在pH 5.0～10.0時(shí)酶活力相對(duì)穩(wěn)定，均在60%以上。在pH值較低時(shí)酶活力較低，在pH 6.0時(shí)酶活力最大，當(dāng)pH值大于10.0后，酶活力急劇下降，直至基本不具有活性。

圖 44 β-葡萄糖苷酶的pH值穩(wěn)定性Fig.4 pH Stability of β-glucosidase

2.2.3 金屬離子的影響

表2 不同金屬離子（10 mmol/L）對(duì)β-葡萄糖苷酶活力的影響Table 2 Effects of various metal ions on the activity of β-glucosiiddaassee

酶是一種蛋白質(zhì)，其催化效果受諸多因素的影響，其中不同金屬離子對(duì)酶活力的影響不同。它們可能是酶的組成部分，也有可能是酶的激活劑或抑制劑。因而酶解環(huán)境中含有或在酶制劑貯存過(guò)程中添加不同種類(lèi)的金屬離子對(duì)大多數(shù)酶的降解效率及其穩(wěn)定性影響很大。為了解金屬離子對(duì)酵母β-葡萄糖苷酶活性的影響，以p-NPG

為底物研究了不同金屬離子（10 mmol/L）對(duì)β-葡萄糖苷酶活力的影響，以不含待檢離子的β-葡萄糖苷酶的活性為100%，結(jié)果如表2所示。結(jié)果表明：10 mmol/L Al3+、Cu2+對(duì)β-葡萄糖苷酶的抑制作用強(qiáng)烈；而K+、Mg2+、Ca2+、Zn2+、Na+的影響不明顯。

2.2.4 酒精度的影響

圖5 乙醇對(duì)β-葡萄糖苷酶酶活性的影響Fig.5 Effect of temperature on the activity of β-glucosidase

如圖5所示，總體而言該酶對(duì)酒精具有較強(qiáng)的耐受性。在酒精低于20%時(shí)對(duì)β-葡萄糖苷酶酶活力有一定的促進(jìn)作用，甚至使酶活力增加了10%左右，這一方面可能是低體積分?jǐn)?shù)的酒精可以刺激酵母細(xì)胞產(chǎn)酶，另一方面由于酒精刺激使β-葡萄糖苷酶活性作用位點(diǎn)發(fā)生了改變。

2.2.5 葡萄糖對(duì)β-葡萄糖苷酶活力的影響

由圖6可知，由于β-葡萄糖苷酶作用于底物產(chǎn)生葡萄糖，β-葡萄糖苷酶的酶活力隨葡萄糖質(zhì)量濃度的增加而下降，高質(zhì)量濃度葡萄糖對(duì)酶活力具有一定的抑制作用，葡萄糖20 g/100 mL時(shí)酶活力為88.39%，較未添加葡萄糖時(shí)下降11.61%。

圖6 葡萄糖質(zhì)量濃度對(duì)β-葡萄糖苷酶活力的影響Fig.6 Effect of glucose concentration on the activity of β-glucosidase

3 結(jié) 論

以紅佳釀釀酒酵母為原料，經(jīng)分離純化得到β-葡萄糖苷酶純品，并研究了溫度、pH值穩(wěn)定性和金屬離子、葡萄糖、酒精度對(duì)酶活力的影響。結(jié)果表明：粗酶液經(jīng)過(guò)離子交換層析后，純化倍數(shù)為19.41 倍，得率為38.67%，分子質(zhì)量約為45 kD；β-葡萄糖苷酶熱穩(wěn)定性較差，在20～40 ℃較穩(wěn)定，在pH 5.0～10.0較穩(wěn)定；10 mmol/L Al3+、Cu2+對(duì)β-葡萄糖苷酶有抑制作用，K+、Mg2+、Ca2+、Zn2+、Na+對(duì)β-葡萄糖苷酶的影響不明顯；葡萄糖和酒精度對(duì)β-葡萄糖苷酶酶活力沒(méi)有明顯的抑制作用。

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Purification and Enzymatic Characterization of β-Glucosidasein from Vintage Red Yeast

ZHU Xia1, SHENG Wen-jun1, YANG Xue-shan2, WANG Jing1, LI Min1, ZHANG Bo1, JIAN Yi1, HAN Shun-yu1,*
(1. College of Food Science and Engineering, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China; 2. College of Life Science and Technology, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China)

An intracellular β-glucosidase from Vintage Red Yeast was purifi ed by ion exchange column chromatography. The effects of temperature, pH, metal ions, glucose and alcohol on the stability of the purifi ed β-glucosidase were studied. The results showed that the enzyme was purifi ed to 19.41 folds with a yield of 38.67%. The purity of β-glucosidase was determined by sodium dodecyl sulphate–polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). One band was obtained with a molecular mass of about 45 kD. Characterization of the purifi ed β-glucosidase indicated good thermostability in the range from 20 to 40℃ and good pH stability in the range from 5.0 to 10.0. The enzyme activity was strongly inhibited by Al3+, and Cu2+, whereas K+, Mg2+, Ca2+, Zn2+and Na+had no effect on the β-glucosidase activity. Glucose and alcohol did not have signifi cant inhibitory effect on the β-glucosidase activity.

vintage red yeast; β-glucosidase; purifi cation; enzymatic characterization

Q939.97

A

1002-6630（2014）13-0147-04

10.7506/spkx1002-6630-201413028

2014-01-15

國(guó)家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項(xiàng)目（31160310）；甘肅省青年科學(xué)基金項(xiàng)目（1208RJYA082）

祝霞（1977—），女，講師，碩士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工及風(fēng)味化學(xué)。E-mail：zhux@gsau.edu.cn

*通信作者：韓舜愈（1963—），男，教授，博士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工及風(fēng)味化學(xué)。E-mail：lzhansy@126.com