馬夢君，羅理勇,2，李 雙，曾 亮,2,*

（1.西南大學食品科學學院，重慶 400715；2.西南大學茶葉研究所，重慶 400715)

茶多酚和咖啡堿對茶乳酪形成的影響

馬夢君1，羅理勇1,2，李 雙1，曾 亮1,2,*

（1.西南大學食品科學學院，重慶 400715；2.西南大學茶葉研究所，重慶 400715)

采用茶多酚和咖啡堿模擬構建茶乳酪成因體系，通過分析溶液的透光率、粒徑、沉淀量、咖啡堿和兒茶素含量的變化，綜合評價茶多酚和咖啡堿對茶乳酪形成的影響。結果表明：隨茶多酚和咖啡堿質量濃度的增加，其聚合后溶液的透光率從95.5%降為24.7%；粒徑從198 nm增加到475 nm；沉淀量由8 mg/L增加到244 mg/L；當固定咖啡堿或茶多酚中任一物質的質量濃度，隨另一物質質量濃度的增加，上述變化趨勢增強。通過分析檢測咖啡堿和兒茶素各單體在模擬反應體系中的變化，表明咖啡堿和表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate，EGCG）是模擬體系中茶乳酪形成的關鍵組分。因此，盡量選用咖啡堿含量低于200 mg/L、茶多酚含量低于1 200 mg/L的綠茶原料，可避免茶乳酪的大量生成，增強綠茶飲料透亮的感官效果。

茶多酚；咖啡堿；茶乳酪；質量濃度

作為世界性三大無醇飲料之一的茶葉，被譽為21世紀的飲料，并以其天然、營養(yǎng)、保健的特點備受世人青睞，成為世人最受歡迎的飲品之一[1-4]。茶葉按其加工方法的不同分為綠茶、紅茶、青茶、白茶、黃茶、黑茶六大類。

茶多酚（tea polyphenols，TP）是茶葉中的特有成分和非常重要的功能因子，約占綠茶干質量的18%～36%[5]。TP按其化學結構可以分為黃烷醇類（兒茶素）、黃酮（黃酮醇）、花青素、酚酸（縮酚酸）4 類，其中兒茶素約占TP總量的70%，主要包括表兒茶素（epigallocatechin，EC）、表兒茶素沒食子酸酯（epicatechingallate，ECG）、表沒食子兒茶素（epigallocatechin，EGC）和表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate，EGCG）。茶多酚不僅是一種新型的天然抗氧化劑，還具有明顯的抗衰老、清除自由基，去脂減肥，降低血糖、血脂和膽固醇，預防心血管疾病，抑制腫瘤細胞等藥理功能[6-11]?？Х葔A（caffeine，CAF）約占綠茶干質量的2%～4%[5]，是茶葉中含量最多的生物堿。因一般植物中含咖啡堿的并不多，故也屬于茶葉的特征性物質?？Х葔A是茶葉重要的滋味物質，并且具有興奮、助消化、利尿、促進機體代謝等作用[12]。

GB/T 21733—2008《茶飲料》規(guī)定了茶飲料（茶湯）中的茶多酚和咖啡堿含量最低限度，對于綠茶而言，茶飲料（茶湯）中茶多酚含量和咖啡堿含量的最低限度分別500 mg/kg和60 mg/kg[13]。綠茶飲料中，若茶多酚和咖啡堿的含量過多，將會導致茶乳酪大量產生，高茶多酚含量的功能性飲料的開發(fā)受到了阻礙和限制。

茶乳酪（又稱冷后渾）是指茶湯在冷卻后形成的混濁現(xiàn)象，是茶湯體系沉淀產生的前期過程。目前茶類飲料加工中主要存在香低、色變和沉淀三大關鍵問題，由于茶湯沉淀形成過程復雜，迄今缺乏明確、系統(tǒng)的形成機理和滿意的解決方法。Roberts等[14-15]率先開展紅茶冷后渾方面的研究，研究結果認為，茶黃素、茶紅素及咖啡堿是紅茶茶乳酪的主要化學成分。梁月榮等[16]率先開展了綠茶茶乳酪方面的相關研究，指出茶乳酪在缺乏茶黃素和茶紅素情況下也能產生。茶乳酪主要是有茶多酚-蛋白質、茶多酚-咖啡堿、咖啡堿-蛋白質、茶多酚-咖啡堿-蛋白質共同形成。雖然茶乳酪的主要成分已經明確，但是茶多酚-咖啡堿互作對茶乳酪形成的作用尚不明確，本實驗的目的是以茶多酚-咖啡堿為模型，研究茶乳酪的形成。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茶多酚（咖啡堿含量＜0.5%） 長沙華誠生物科技有限公司；咖啡堿 上海晶純生化科技股份有限公司；甲醇、冰乙酸（色譜純） 重慶滴水實驗儀器有限公司；表沒食子兒茶素（EGC）、兒茶素（catechin，C）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、表兒茶素（EC）、沒食子兒茶素沒食子酸酯（（－）-gallocatechingallate，GCG）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）標準品 成都普瑞法科技開發(fā)有限公司；超純水 美國Millipore公司。

1.2 儀器與設備

LC-20高效液相色譜、UV-2450紫外-可見分光光度計日本島津公司；PWC124分析天平 上海京工實業(yè)有限公司；TOMY ES-315高壓滅菌鍋 上海艾高德生物科技有限公司；ZEN3690 Zeta電位分析儀 英國Malvern公司；5810臺式高速離心機 德國Eppendorf公司；ALPHA1-4LSC真空冷凍干燥機 德國Christ公司。

1.3 方法

1.3.1 茶多酚和咖啡堿混合液的制備

按要求稱量后分別用超純水配制10 g/L的茶多酚溶液和10 g/L的咖啡堿溶液。根據這兩個母液，分別取相應的體積，配制茶多酚質量濃度（400、800、1 200、1 600 mg/L）和咖啡堿質量濃度（50、100、200、400 mg/L）交互組成的16 個茶多酚-咖啡堿混合液。采用121 ℃滅菌10 min，冷卻，加蓋。放置室溫（25 ℃）貯藏觀察，30 d后取出進行分析，測定其透光率、粒徑、沉淀量、咖啡堿和兒茶素各單體含量的變化。

1.3.2 透光率、粒徑、沉淀量的測定

透光率測定：在640 nm波長處，用紫外-可見分光光度計測定透光率，超純水做空白[17-18]；粒徑測定：室溫下，采用Zeta電位分析儀檢測不同質量濃度溶液的粒徑；沉淀量測定：室溫下，采用8 000 r/min高速離心機離心茶多酚-咖啡堿混合液，棄掉上清液，沉淀冷凍干燥稱其質量。

1.3.3 咖啡堿和兒茶素單體測定

樣品用0.45 μm微孔濾膜過濾，濾液采用高效液相色譜檢測。

色譜柱：Hypersil BDS C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流速：0.9 mL/min；檢測波長：278 nm；柱溫：35 ℃；進樣量：10 μL；流動相：A：2%冰乙酸，B：純甲醇，TP采用梯度洗脫，梯度見表1。

表1 兒茶素各組分檢測梯度洗脫表Table 1 Linear gradient elution of catechins components

在上述色譜條件下進行檢測，得到兒茶素混合標準品的高效液相色譜圖，見圖1。

圖1 20000 μg/mL混合標準品色譜圖Fig.1 Chromatogram of 200 μg/mL mixed standard

1.4 數據處理

2 結果與分析

2.1 不同質量濃度茶多酚-咖啡堿混合液透光率變化

圖2 不同質量濃度茶多酚-咖啡堿混合液透光率變化Fig.2 Transmittance changes of mixed solutions of tea polyphenols and caffeine with different concentrations

在640 nm波長測定的透光率可以用來描述茶湯的混濁度[17]。由圖2可知，當茶多酚和咖啡堿的質量濃度較小時，聚合后產物的濁度較??；隨茶多酚和咖啡堿質量濃度的增加，聚合后產物的濁度增大，其聚合后溶液的透光率降低。當體系由茶多酚400 mg/L、咖啡堿50 mg/L變?yōu)椴瓒喾? 600 mg/L、咖啡堿400 mg/L時，溶液的透光率從95.5%降為24.7%。固定咖啡堿或茶多酚的 質量濃度，隨茶多酚或咖啡堿質量濃度的增加，溶液的透光率降低。茶多酚在400 mg/L時，增加咖啡堿的質量濃度，溶液的透光率從95.5%降為88.9%，僅降低了6.9%；而茶多酚在1 600 mg/L時，增加咖啡堿的質量濃度，溶液的透光率從71.4%降為24.7%，降低了65.4%，說明茶多酚對透光率有較大的影響。同樣，咖啡堿在50 mg/L時，增加茶多酚的質量 濃度，溶液的透光率降低了25.2%；而咖啡堿在400 mg/L時，增加茶多酚的質量濃度，溶液的透光率降低了72.2%，說明咖啡堿質量濃 度對透光率也有較大的影響。

通過對實驗結果進行Pearson分析，得出透光率與茶多酚質量濃度相關系數為－0.762**，呈現(xiàn)極顯著負相關；與咖啡堿質量濃度相關系數為－0.566*，呈現(xiàn)顯著負相關，即茶多酚、咖啡堿質量濃度越高，透光率越小，且茶多酚質量濃度對其影響更大一些。通過對其進行逐步回歸分析，得出透光率（Y）與質量濃度（ρ）的關系式為：Y=123.336－0.035ρTP－0.085ρCAF（R2=0.901）。

2.2 不同質量濃度茶多酚-咖啡堿混合液粒徑變化

溶液的粒徑大小與其質量濃度大小無關，所以貯藏后溶液的粒徑增加說明茶多酚與咖啡堿發(fā)生聚合反應，生成了新的大分子物質。模型建立初期，所有溶液的粒徑均為（180±15）nm。由圖3可知，貯藏30 d后，隨茶多酚和咖啡堿質量濃度的增加，其聚合后溶液的粒徑也增加，并且變化趨勢是固定咖啡堿或茶多酚的質量濃度，隨茶多酚或咖啡堿質量濃度的增加，溶液的粒徑都呈現(xiàn)增加趨勢。當體系由茶多酚400 mg/L、咖啡堿50 mg/L變?yōu)椴瓒喾? 600 mg/L、咖啡堿400 mg/L時，溶液的粒徑從198 nm增加到475 nm。當咖啡堿質量濃度從200 mg/L增加到400 mg/L時，粒徑顯著增大。當咖啡堿質量濃度200 mg/L，茶多酚質量濃度400、800、1 200、1 600 mg/L時的粒徑分別為231、286、319、347 nm；當咖啡堿質量濃度400 mg/L，茶多酚質量濃度400、800、1 200、1 600 mg/L時的粒徑分別為274、357、462、474 nm，分別增加了19%、25%、45%和37%?？Х葔A質量濃度高于200 mg/L時，在茶多酚質量濃度較高時，粒徑明顯變大，并且透光率明顯降低，說明咖啡堿質量濃度高的不適合開發(fā)高茶多酚飲料，若要研發(fā)高茶多酚的功能飲料，需控制咖啡堿的質量濃度低于200 mg/L。

圖3 不同質量濃度茶多酚-咖啡堿混合液粒徑變化Fig.3 Particle size changes of mixed solutions of tea polyphenols and caffeine with different concentrations

通過對實驗結果進行Pearson分析，得出溶液粒徑與茶多酚質量濃度相關系數為0.567*，呈現(xiàn)顯著正相關；與咖啡堿質量濃度相關系數為0.755**，呈現(xiàn)極顯著正相關，即茶多酚、咖啡堿質量濃度越高，溶液粒徑越大，且咖啡堿質量濃度對其影響更大一些。通過對其進行逐步回歸分析，得出粒徑（Y）與質量濃度ρ的關系式為：Y=114.306－0.099ρTP+0.441ρCAF（R2=0.892）。

2.3 不同質量濃度茶多酚-咖啡堿混合液沉淀量變化

圖4 不同質量濃度茶多酚-咖啡堿混合液沉淀量變化Fig.4 Change in tea cream amounts in mixed solutions of polyphenols and caffeine with different concentrations

由圖4可知，隨茶多酚和咖啡堿質量濃度的增加，其聚合后溶液的沉淀量也增加，并且變化趨勢是固定咖啡堿或茶多酚的質量濃度，隨茶多酚或咖啡堿質量濃度的增加，溶液的沉淀量呈現(xiàn)增加趨勢。當茶多酚質量濃度從400 mg/L增加到1 600 mg/L時，沉淀量隨著質量濃度的增加而增大。茶多酚1 600 mg/L、咖啡堿400 mg/L，得到最大的沉淀量為244 mg/L。茶多酚400 mg/L、咖啡堿50 mg/L，得到最小的沉淀量為8 mg/L。二者相差達30 倍，說明不同茶多酚和咖啡堿質量濃度對沉淀量影響很大。茶多酚1 600 mg/L、咖啡堿400 mg/L，二者的比例為4∶1，其沉淀量為244 mg/L；相同比例條件下，茶多酚400 mg/L、咖啡堿100 mg/L時，其沉淀量僅為18 mg/L，說明二者的比例對沉淀量的影響與其質量濃度大小有關。因此，要控制茶乳酪的生成量，咖啡堿質量濃度要低于200 mg/L，茶多酚質量濃度要低于1 200 mg/L。

通過對實驗結果進行Pearson分析，得出沉淀量與茶多酚質量濃度相關系數為0.851，呈現(xiàn)顯著正相關；與咖啡堿質量濃度相關系數為0.345，沒有相關性，即茶多酚質量濃度越高，沉淀量生成的越多。

2.4 不同質量濃度茶多酚-咖啡堿混合液兒茶素各組分和咖啡堿含量的變化

梁月榮等[19]研究指出，咖啡堿、兒茶素GC和EGCG組分是綠茶茶乳酪的主要成分。圖5和表2為不同質量濃度茶多酚與咖啡堿溶液體系中兒茶素和咖啡堿各組分的變化情況。結果顯示，EGCG占總兒茶素含量的58%，其次是GCG、ECG、EGC、EC，而C含量只有1%左右。除組分C外，EGC、EGCG、EC、GCG、ECG都參與沉淀的形成，推測可能是因為茶多酚原料中C含量少的緣故。由圖5可知，隨著茶多酚的質量濃度的增加，咖啡堿含量顯著減少，說明其參與沉淀的形成。當茶多酚質量濃度為400 mg/L時，EGC參與沉淀形成的比例最大，達到43%以上，EGCG參與形成的比例達33%以上，C、GCG沒有參與沉淀的形成。當茶多酚質量濃度為800 mg/L時，EGCG參與沉淀形成的比例最大，達到21%以上，EGC、EC和ECG分別達到15%、20%、12%，C、GCG沒有參與沉淀的形成。當茶多酚質量濃度為1 200 mg/L時，只有EC和 EGCG參與沉淀形成，EGC、C、GCG和ECG都沒有參與沉淀的形成。當茶多酚質量濃度為1 600 mg/L時，EGC、GCG和EGCG參與沉淀形成；尤其是咖啡堿質量濃度為400 mg/L時，EGC、EGCG含量顯著降低，這與前面沉淀量增大相吻合。EC、C和ECG沒有參與沉淀的形成。

當咖啡堿質量濃度為50 mg/L時，隨著茶多酚含量的增加，參與沉淀形成的咖啡堿含量呈現(xiàn)波動，在茶多酚為400 mg/L和1 200 mg/L時咖啡堿質量濃度顯著降低。當咖啡堿400 mg/L、茶多酚1 600 mg/L時，咖啡堿質量濃度降至348 mg/L，有13%的咖啡堿參與沉淀形成。

圖5 不同質量濃度茶多酚咖啡堿混合液咖啡堿含量的變化Fig.5 Changes in caffeine concentration after being mixed with different concentrations of teapolyphenols

表2 不同質量濃度茶多酚-咖啡堿混合液兒茶素組分含量變化Table 2 Changes in catechin contents after mixing tea polyphenols with caffeineat different concentrationsmg/L

兒茶素是茶葉中的主要功能成分，也是參與沉淀形成的主要化學成分，分別已在紅茶[20]和半發(fā)酵茶[21]中得到證實，特別是EGCG，其所含的沒食子酸帶有更多的羥基，更容易與咖啡堿結合[22]，導致茶乳酪的形成。

3 討 論

當茶多酚和咖啡堿的質量濃度較小時，聚合后產物的濁度較?。浑S茶多酚和咖啡堿質量濃度的增加，聚合后產物的濁度增大，其聚合后溶液的透光率降低，通過相關性分析發(fā)現(xiàn)茶多酚質量濃度比咖啡堿質量濃度對透光率影響更大一些。隨茶多酚和咖啡堿質量濃度的增加，其聚合后溶液的粒徑也增加，并且變化趨勢是固定咖啡堿或茶多酚的質量濃度，隨茶多酚或咖啡堿質量濃度的增加，溶液的粒徑都呈現(xiàn)增加趨勢，通過相關性分析發(fā)現(xiàn)咖啡堿質量濃度比茶多酚質量濃度對透光率影響更大一些。隨茶多酚和咖啡堿質量濃度的增加，其聚合后溶液的沉淀量也增加。隨著茶多酚的加入，咖啡堿含量顯著減少，說明其參與沉淀的形成。從兒茶素各組分的分析來看，除組分C外，其余各組分均參與沉淀形成，其中，EGCG參與的最多。此外，在高濃度茶多酚咖啡堿混合液中，EGCG更容易與咖啡堿結合。

日常生產的綠茶中茶多酚含量約占500～2 000 mg/L，若要保持飲料比較澄清，需選擇低于質量濃度1 200 mg/L的茶多酚綠茶原料；而日常飲料咖啡堿含量約為60～250 mg/L，其含量沒有超過400 mg/L，考慮到咖啡堿的興奮功能，可在保持茶多酚含量的基礎上盡量選擇咖啡堿含量越低的綠茶原料。

除本實驗已研究的茶多酚-咖啡堿模型對茶乳酪形成的影響外，實驗室正在構建茶多酚-蛋白質、咖啡堿-蛋白質、茶多酚-咖啡堿-蛋白質理論模型，體系化研究綠茶飲料茶乳酪的形成機理，在未來茶飲料開發(fā)中，根據已有的實驗結果和研究體系，提出一套完善的內含量的濃度和配比依據；并研究各種物質對茶乳酪形成的影響，提出降低綠茶飲料茶乳酪形成的方法。

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Effects of Different Concentrations of Caffeine and Tea Polyphenolic Compounds on the Formation of Tea Cream

MA Meng-jun1, LUO Li-yong1,2, LI Shuang1, ZENG Liang1,2,*
(1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China; 2. Tea Research Institute, Southwest University, Chongqing 400715, China)

A model system consisting of tea polyphenols and caffeine was set up for studying the formation mechanism of green tea cream. The transmittance, particle size, amount of tea cream, caffeine and catechins contents of the solution were investigated to study the effects of different concentrations of polyphenols and caffeine compounds on the formation of tea cream. The results showed that the transmittance of the solution was decreased from 95.5% to 24.7%, the particle size was increased from 198 to 475 nm and the amount of precipitate was increased from 8 to 244 mg/L with increasing addition of polyphenols and caffeine. These changing trends were more pronounced with increasing concentration of one of the two components at a constant level of the other. High performance liquid chromatography analysis of the contents of caffeine and catechins showed that caffeine and EGCG were the main compounds of tea cream. Based on our results, green tea infusion was relatively more stable when polyphenols concentration was lower than 1 200 mg/L and caffeine concentration lower than 200 mg/L.

tea polyphenols; caffeine; tea cream; concentration

TS272

A

1002-6630（2014）13-0015-05

10.7506/spkx1002-6630-201413003

2014-03-08

國家自然科學基金青年科學基金項目（31100500）；重慶市科委自然科學基金計劃項目（CSTC，2013jcyjA80021）；中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項資金項目（XDJK2013B036）

馬夢君（1990—），女，碩士研究生，主要從事茶飲料研究。E-mail：164021307@qq.com

*通信作者：曾亮（1980—），女，副教授，博士，主要從事茶資源綜合利用研究。E-mail：zengliangbaby@126.com