韋 偉，李正國，程嬋娟，楊德芳

（1.重慶師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，重慶 401331；2.重慶大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 基因工程研究中心，重慶 400045；3.重慶市第95中學(xué)，重慶 400084；4.重慶市巴蜀中學(xué)，重慶 400013）

海藻酸鈉-培養(yǎng)基-刃天青-硅藻土微球法快速檢測細(xì)菌總數(shù)

韋 偉1,2，李正國2，程嬋娟3，楊德芳4

（1.重慶師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，重慶 401331；2.重慶大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 基因工程研究中心，重慶 400045；3.重慶市第95中學(xué)，重慶 400084；4.重慶市巴蜀中學(xué)，重慶 400013）

通過制備海藻酸鈉-培養(yǎng)基-刃天青-硅藻土（alginate-medium-resazurin-diatomaceous silica，AMRD）微球，建立一種快速檢測細(xì)菌總數(shù)的新方法。結(jié)果表明：單倍培養(yǎng)基濃度下，海藻酸鈉∶硅藻土為1∶1.4（m/m）時，AMRD微球變色時間與細(xì)菌數(shù)量呈最佳線性關(guān)系，檢測限為2.02×102CFU/mL，檢測時間為2～16.5 h。AMRD微球?qū)Υ竽c桿菌和金黃色葡萄球菌的檢測靈敏度分別為1.62×103、2.03×103CFU/mL。微球?qū)?xì)菌的吸附符合Freundlich等溫吸附方程，參數(shù)1/n在0.5～1.0之間，屬于中等吸附，低濃度條件下受溫度影響不大，吸附飽和需要30～45 min。AMRD微球細(xì)菌計數(shù)法是一種快速而經(jīng)濟的細(xì)菌計數(shù)新方法，有望用于食品、飲用水以及環(huán)境檢測等領(lǐng)域細(xì)菌總數(shù)的定量檢測。

海藻酸鈉；硅藻土；刃天青；細(xì)菌計數(shù)；細(xì)菌吸附

細(xì)菌總數(shù)檢測（total bacterial number）是反映食品、飲用水等衛(wèi)生狀況的重要指標(biāo)。目前普遍采用的細(xì)菌總數(shù)檢測方法主要為傳統(tǒng)的平板菌落計數(shù)法、顯微鏡直接計數(shù)法和比濁法等[1]。平板菌落計數(shù)法耗時長、培養(yǎng)基消耗大且步驟繁瑣；而顯微鏡直接計數(shù)法和比濁法雖然簡便、耗時短，但往往無法區(qū)分死、活細(xì)胞。近年一些新的細(xì)菌計數(shù)方法研究時有報道，如ATP生物發(fā)光法[2]、NADH熒光法[3]、流式細(xì)胞計數(shù)[4-5]、硅殼包被熒光納米顆粒計數(shù)[6]、酶聯(lián)免疫法[7]和實時熒光定量PCR[8-9]法等。這些方法相比傳統(tǒng)方法而言精確度以及檢測速率方面有較大的提高，但是往往需要昂貴的設(shè)備或者試劑，使其應(yīng)用受到限制。因此，建立一種快速、節(jié)約、準(zhǔn)確的細(xì)菌檢測方法在實驗室研究與實際應(yīng)用中都是非常必要的。

刃天青（resazurin）是一種傳統(tǒng)的氧化還原染料，對細(xì)胞無毒。它可以被微生物的氧化還原酶作用，從藍(lán)色的刃天青被還原成粉紅色的試鹵靈，還可以進一步被還原為無色的二氫試鹵靈。當(dāng)加入含細(xì)菌樣品時，其顏色變化表現(xiàn)為青藍(lán)色-紫色-粉紅色-無色[10-11]。目前有一些研究通過檢測刃天青顏色變化進行細(xì)菌的半定量分析，如肉類變質(zhì)檢測[12]、口腔中變形鏈球菌的數(shù)量檢測[13]等。多將刃天青制成比色紙，加樣品培養(yǎng)后與標(biāo)準(zhǔn)比色板對照，采用0、1、2、3度的方式報告結(jié)果，難以進行比較準(zhǔn)確的細(xì)菌計數(shù)。田波等[14]針對牛奶中細(xì)菌數(shù)量的檢測設(shè)計了實驗方案、嘗試進行準(zhǔn)確計數(shù)，但結(jié)果表明計數(shù)結(jié)果受到氧氣濃度以及樣品中其他成分等的影響非常大。在后期的實驗中，向液體樣品中通入氮氣、去除氧氣，并通過圖像采集和圖像比對軟件對加入刃天青的樣品顏色變化進行分析，可計算樣品中的細(xì)菌數(shù)，但是對于樣品中其他成分的干擾缺乏排除機制，該法也主要只能使用在原料乳中細(xì)菌數(shù)量的檢測。

本實驗提出利用海藻酸鈉包埋、固定含刃天青的培養(yǎng)基以形成微球，通過添加不同含量的硅藻土以調(diào)節(jié)微球的吸附性能，使檢測體系中的細(xì)菌在微球表面以及周圍聚集、生長，通過觀察微球的顏色變化時間對細(xì)菌進行計數(shù)。該方法相對平板計數(shù)法而言，可以縮短檢測時間、降低培養(yǎng)基消耗，避免樣品中其他成分對顏色變化觀察的影響，同時可最大程度降低氧氣對刃天青變色的影響。對微球制備條件、微球變色時間與細(xì)菌數(shù)量的關(guān)系等方面進行了摸索研究，并對微球的吸附性能作了深入分析，據(jù)此提出了提高本方法靈敏度與準(zhǔn)確度的研究方向。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試細(xì)菌菌株大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）由重慶師范大學(xué)微生物研究所提供。

刃天青（分析純） 美國Sigma公司；海藻酸鈉（化學(xué)純，黏度1%） 浙江東升化工試劑公司；硅藻土（化學(xué)純） 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

CR-21G型高速冷凍離心機 日本日立公司；HZP-150型全溫振蕩培養(yǎng)器 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；PB-10型酸度計 德國Sartorius公司；BT100-2J型精密蠕動泵 保定蘭格恒流泵有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的保藏、活化及菌懸液配制

4 ℃保藏的菌株于100 mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中、37 ℃、180 r/min條件下，恒溫振蕩培養(yǎng)12 h至對數(shù)生長期。吸取活化的菌液2 mL于200 mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，同樣條件下培養(yǎng)12 h。菌懸液配制以及平板菌落計數(shù)參照GB 4789.2—2010《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗：菌落總數(shù)測定》[1]。

1.3.2 微球的制備

海藻酸鈉-培養(yǎng)基-刃天青（alginate-mediumresazurin，AMR）微球：稱取2 g海藻酸鈉，加少量甘油潤濕分散均勻，以100 mL單倍牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基（1 000 mL培養(yǎng)基中含牛肉膏3.0 g、蛋白胨10.0 g、NaCl 5.0 g，pH 7.2）溶解，攪拌均勻，105 ℃滅菌15 min。待完全冷卻后，加入2 mL已經(jīng)過濾滅菌的0.05%（m/m）刃天青溶液，充分?jǐn)嚢韬?，靜置5 min，無菌條件下用蠕動泵以24 r/min將該溶液通過注射器針頭逐滴加入到100 mL 0.05 mol/L無菌CaCl2溶液（含2 mL刃天青溶液）中，固化45 min，用無菌水洗滌3次，無菌抽濾去掉水分，得到含有牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和刃天青的青色微球，直徑約為2 mm，4 ℃貯藏備用。

海藻酸鈉-培養(yǎng)基-刃天青-硅藻土（alginate-mediumresazurin-diatomaceous，AMRD）微球：在海藻酸鈉-單倍牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基溶液中加入2 g硅藻土后攪拌均勻，滅菌、制備微球方法同上。

海藻酸鈉-雙倍培養(yǎng)基-刃天青-硅藻土（alginatedouble-medium-resazurin-diatomaceous，ADMRD）微球：按照AMRD微球的制備方法，將單倍牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基替換為雙倍濃度培養(yǎng)基（1 000 mL培養(yǎng)基中含牛肉膏6.0 g、蛋白胨20.0 g、NaCl 10.0 g，pH 7.2）。

海藻酸鈉-三倍培養(yǎng)基-刃天青-硅藻土（alginatetriple-medium-resazurin-diatomaceous，ATMRD）微球：按照AMRD微球的制備方法，將單倍牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基替換為3倍濃度（1 000 mL培養(yǎng)基中含牛肉膏9.0 g、蛋白胨30.0 g、NaCl 15.0 g，pH 7.2）。

海藻酸鈉-刃天青-硅藻土（alginate-resazurindiatomaceous，ARD）微球：按照AMRD微球的制備方法，用pH 7.2的無菌水替代培養(yǎng)基。

1.3.3 微球變色時間與細(xì)菌數(shù)量的關(guān)系

分別取0.5 mL用無菌水10倍梯度稀釋的8個不同濃度的E.coli與S.aureus菌懸液（10-8～10-1），加入含50粒AMR微球的無菌離心管中，37 ℃培養(yǎng)，每隔30 min觀察微球顏色變化，以50粒微球全部變成粉紅色為終點。以無菌水代替菌懸液作為空白對照，每個濃度做3個重復(fù)。菌懸液以平板菌落計數(shù)法計數(shù)。

1.3.4 微球中硅藻土含量對微球變色時間的影響

制作海藻酸鈉∶硅藻土（m/m）分別為1∶0.4、1∶0.6、1∶0.8、1∶1.0、1∶1.2、1∶1.4、1∶1.6、1∶1.8、1∶2.0的AMRD微球，各取50粒分別裝于1支無菌離心管中，同1.3.3節(jié)的方法進行實驗，每種微球做3個重復(fù)，并與AMR微球進行比較，研究微球中硅藻土含量對微球變色時間的影響。

1.3.5 微球中培養(yǎng)基濃度對微球變色時間的影響

制作AMRD、ADMRD與ATMRD 3種分別含單倍、雙倍和3倍培養(yǎng)基的微球，各取50粒分別裝于1支無菌離心管中，同1.3.3節(jié)的方法進行實驗，研究微球中培養(yǎng)基濃度對微球變色時間的影響。每種微球做3個重復(fù)。

1.3.6 檢測靈敏度

分別取0.5 mL 10種不同濃度的E.coli與S.aureus菌懸液（無菌水單倍梯度稀釋，1×10-7～1×10-6），加入含50粒AMRD微球（海藻酸鈉∶硅藻土為1∶1.4）的無菌離心管中。同1.3.3節(jié)的方法進行實驗，每個濃度做3個重復(fù)，檢測實驗方法的靈敏度。

1.3.7 微球的吸附平衡

考慮到排除吸附過程中細(xì)菌繁殖帶來的影響，以無培養(yǎng)基的ARD微球替代AMRD微球進行實驗。

參考朱晨華等[15]的設(shè)計方法，分別取5 mL 8個不同濃度的的E.coli與S.aureus菌懸液（無菌水10倍梯度稀釋，10-1～10-8），加入含100粒ARD微球的20 mL無菌離心管中，37 ℃、200 r/min振蕩吸附2 h后，取0.5 mL上清液稀釋到適當(dāng)濃度后進行平板計數(shù)，每個濃度做2個重復(fù)。以相同濃度不加微球的菌懸液作為空白對照組，根據(jù)吸附殘液中菌體的濃度變化計算平衡吸附量。

取5 m L濃度分別為2.0 2×1 04C F U/m L與4.05×104CFU/mL的E.coli與S.aureus菌懸液，加入含100粒ARD微球的離心管中，分別于5、10、20、30 ℃和40 ℃條件下，200 r/min振蕩吸附2 h后，取0.5 mL上清液稀釋到適當(dāng)濃度后進行平板計數(shù)，每個溫度做3個重復(fù)。以相同濃度不加微球的菌懸液作為空白對照組。根據(jù)吸附殘液中菌體的濃度變化計算吸附量，考察溫度對微球吸附的影響。

1.3.8 吸附動力學(xué)

取5 mL濃度分別為2.02×104CFU/mL與4.05×104CFU/mL的E.coli與S.aureus菌懸液，分別加入含100粒ARD微球的20 mL離心管中，37 ℃、200 r/min振蕩吸附，在15、30、45、60、120 min和240 min時各取1支，分別檢測上清液與微球中所含菌體的數(shù)量，每個時間點做3個重復(fù)。以相同濃度不加微球的菌懸液作為空白對照組，計算不同時刻的吸附量。

2 結(jié)果與分析

2.1 微球的制備與物理特征

制得的AMR、AMRD、ARD等系列微球為青色球體，球形比較規(guī)整，直徑約1～2 mm，無黏連（圖1A）。加入細(xì)菌樣品培養(yǎng)后微球變?yōu)榉奂t色（圖1B顯示為褐色）。制作的微球直接于錐形瓶中密封，4 ℃可至少保藏5周不變色。冷凍干燥的微球可在4 ℃長期貯藏不變色。

圖1 由海藻酸鈉、培養(yǎng)基、刃天青和硅藻土制備的微球（A）及加入細(xì)菌前后顏色變化（BB）Fig.1 Microspheres prepared with sodium alginate, medium, resazurin and diatomaceous silica (A) and distinct color change before and after addition of bacteria (B)

2.2 微球變色時間與細(xì)菌數(shù)量的關(guān)系

分別以不同濃度的革蘭氏陽性菌S.aureus與革蘭氏陰性菌E.coli菌懸液為樣品，以其所含細(xì)菌數(shù)量的對數(shù)作為縱坐標(biāo)，變色時間為橫坐標(biāo)，對實驗數(shù)據(jù)進行線性回歸分析（圖2）。

圖2 微球變色時間細(xì)菌數(shù)量的關(guān)系Fig.2 Correlation between the discoloration time of microcapsules and bacterial number

由圖2可知，對于測試的2種細(xì)菌而言，AMR微球的變色時間與樣品所含細(xì)菌數(shù)量之間均表現(xiàn)出很好的線性關(guān)系（E.coli：R2=0.911 0，S.aureu：R2=0.937 2）。使用海藻酸鈉多糖固化培養(yǎng)基與刃天青染料，直接觀察微球顏色變化，可以基本排除樣品中其他成分對顏色變化的干擾并減弱氧氣濃度對結(jié)果的影響，使得檢測結(jié)果相關(guān)系數(shù)與直接使用刃天青還原法（R2=0.79）[10]相比有了較大的提高。

對于高菌濃度（≥105CFU/mL）樣品，AMR微球的變色時間與樣品所含細(xì)菌數(shù)量之間的線性關(guān)系非常好，檢測時間分別只需要2～11 h（E.coli）與1～7 h（S.aureu）。這一檢測時間比平板菌落計數(shù)法所需的24～48 h有較大的提高。但是對于細(xì)菌濃度低于105CFU/mL的樣品，AMR微球的變色時間則主要集中在13～16 h，且各濃度的變色時間無明顯的差異。這可能是由于當(dāng)樣品中細(xì)菌數(shù)量少時，需要在整個體系中經(jīng)過較長的生長時間才能使微球變色，同時由于細(xì)菌二分裂的繁殖方式以及迅速的繁殖速率使初始細(xì)菌基數(shù)間的差別在一定程度上被弱化。

2.3 微球中硅藻土含量對微球變色時間的影響

由于微球變色的原理是通過其周圍微生物的代謝使微球中刃天青被還原變成粉紅色，微球?qū)?xì)菌的吸附能力必然會極大的影響其變色速率與檢測效果。因此，考察在微球中添加硅藻土以提高其吸附能力對低菌濃度的檢測效果。

表1顯示了加入不同比例硅藻土后2種菌數(shù)量與變色時間的線性回歸方程（Y=kX＋b）參數(shù)以及相關(guān)系數(shù)R2。

表1 不同硅藻土含量條件下細(xì)菌數(shù)量與微球變色時間的線性回歸參數(shù)Table 1 Linear regression parameters for discoloration time of microcapsules against the numbers of E. coli and S. aureus with different diatomite content

由表1可知，與未添加硅藻土的AMR微球相比，AMRD微球變色時間與細(xì)菌數(shù)量表現(xiàn)出更高的相關(guān)性。隨著硅藻土比例的上升，相關(guān)系數(shù)呈現(xiàn)增大的趨勢。當(dāng)硅藻土添加比例達到1.4時，AMRD微球變色時間與2種菌都表現(xiàn)出最高的相關(guān)系數(shù)（E.coli：R2=0.963 2，S.aureu：R2=0.986 4），隨后出現(xiàn)較明顯的降低。因此選擇相關(guān)系數(shù)最高的海藻酸鈉∶硅藻土（m/m）為1∶1.4的AMRD微球與未添加硅藻土的AMR微球的線性回歸結(jié)果進行比較（圖3）。

圖3 AMR、AMRD微球?qū)z測時間與細(xì)菌數(shù)量的線性回歸模型比較Fig.3 Comparison of the linear regression models of total bacterial number against detection time for AMR and AMRD microspheres

從圖3可以看出，在高菌濃度條件下（≥105CFU/mL），AMRD與AMR 2種微球仍然保持最佳的線性關(guān)系（R2＞0.95）。然而在低濃度樣品（101～104CFU/mL）的檢測結(jié)果中二者表現(xiàn)出明顯的區(qū)別。在使用AMR微球檢測E.coli菌懸液細(xì)菌數(shù)量時，低濃度樣品（101～104CFU/mL）使微球的變色時間均在16 h左右，難以區(qū)分；而在AMRD微球的實驗結(jié)果中，變色時間分布于14.5～17 h之間，每個濃度之間約有45 min的時間差，相鄰濃度之間的變色時間得以較明顯的區(qū)分（圖3A）。對于S.aureu，添加硅藻土同樣使低濃度樣品的檢測時間與細(xì)菌數(shù)量的相關(guān)系數(shù)增加（圖3B）。結(jié)果也表明，在低濃度樣品的檢測方面，添加硅藻土的AMRD微球比AMR對照微球有了明顯的提升，與預(yù)期相符?？赡苁怯捎贏MRD微球中硅藻土的吸附作用，使得低濃度菌懸液中的一部分細(xì)菌更加集中在微球表面或者周圍，其代謝活動對微球的影響更加直接與集中。同時，加入硅藻土后微球本身的孔徑以及內(nèi)部結(jié)構(gòu)可能更為疏松，使微球內(nèi)所含的培養(yǎng)基更容易通過直接接觸或滲透作用提供給細(xì)菌，而刃天青與細(xì)菌之間的相互作用也同樣更加容易。

2.4 微球中培養(yǎng)基濃度對微球變色時間的影響

考慮微生物生長與營養(yǎng)之間的密切關(guān)系，考察了海藻酸鈉∶硅藻土為1∶1.4的AMRD微球中不同培養(yǎng)基濃度對其變色時間的影響，結(jié)果見表2及圖4。

表2 不同培養(yǎng)基濃度條件下細(xì)菌數(shù)量與微球變色時間的線性回歸參數(shù)Table 2 Linear regression parameters for microcapsule discoloration time against the numbers ofE. coollii aanndd S. aurreeuuss with different medium concentrations

圖4 培養(yǎng)基濃度對微球變色時間的影響Fig.4 Influence of medium concentration on the discoloration time of microcapsules

由表2可知，隨著培養(yǎng)基濃度的增加，微球變色時間與菌數(shù)之間的相關(guān)系數(shù)略有降低。同時，由圖4可以看出，培養(yǎng)基濃度對于高菌濃度樣品（＞105CFU/mL）使微球的變色時間影響不大。而對低菌濃度樣品（＜105CFU/mL）有較明顯的影響，表現(xiàn)為培養(yǎng)基濃度越高，其變色時間越短。含3倍培養(yǎng)基的ATMRD微球的變色時間比單倍培養(yǎng)基的AMRD微球要快約1～3 h，而2倍培養(yǎng)基的ADMRD微球比AMRD微球要快約0.5～2 h。

雖然高濃度培養(yǎng)基的微球可以縮短檢測時間，但是從相鄰菌濃度之間變色時間差的角度來看，2倍與3倍濃度培養(yǎng)基微球所測的各個相鄰菌濃度樣品之間的變色時間相隔很短，往往小于15 min。尤其在E.coli檢測中，菌濃度為101～104CFU/mL的樣品變色時間集中在14～15 h之間，幾乎同時變色，難以準(zhǔn)確的判斷并計數(shù)。根據(jù)細(xì)菌生長規(guī)律，在培養(yǎng)基濃度較低時，微生物的生長隨培養(yǎng)基濃度的增加而加快。在檢測的過程中，微球中的培養(yǎng)基會向微球外的液體環(huán)境擴散，如果微球中的培養(yǎng)基濃度高，則會導(dǎo)致球外的培養(yǎng)基濃度升高，細(xì)菌在球外的活動增強，使刃天青迅速變色；同時由于細(xì)菌特殊的二分裂繁殖方式，高培養(yǎng)基濃度高而帶來的繁殖代時的縮短會使低濃度的樣品也能在較短時間內(nèi)通過快速的分裂達到可以使微球變色的細(xì)菌濃度水平，從而減小了不同起始菌濃度的樣品對微球變色時間長短的差異，導(dǎo)致準(zhǔn)確度降低。

因此，從線性回歸相關(guān)系數(shù)、檢測準(zhǔn)確性以及降低培養(yǎng)基消耗的經(jīng)濟角度考慮，確定含單倍培養(yǎng)基濃度、海藻酸鈉∶硅藻土為1∶1.4的AMRD微球作為該細(xì)菌計數(shù)法的微球（以下直接使用AMRD微球表示）。

2.5 檢測靈敏度與檢測限

在微球變色時間與細(xì)菌數(shù)量關(guān)系的實驗中，當(dāng)樣品之間所含菌數(shù)差異較大（10倍梯度）時，獲得了較好的檢測計數(shù)結(jié)果。按1.3.6節(jié)方法繼續(xù)深入研究在樣品所含菌數(shù)差異更小（單倍梯度）情況下的實驗效果，以細(xì)菌數(shù)量為橫坐標(biāo)、變色時間為縱坐標(biāo)，結(jié)果如圖5所示。

圖5 不同細(xì)菌濃度下AMRD微球變色靈敏度Fig.5 Detection sensitivity for the discoloration time of microspheres at different bacterial concentrations

從圖5 A可以看出，在菌懸液濃度為2.02×102～1.62×103CFU/mL（即1.0×10-7～8.0×10-7稀釋度）的8個E.coli樣品之間，微球變色時間沒有顯著差別，顏色變化時間的顯著性差異出現(xiàn)在菌懸液濃度超過1.82×103CFU/mL（9.0×10-7稀釋度）之后，相差約0.5～1h，表明只有當(dāng)2個樣品之間細(xì)菌數(shù)量差超過8倍稀釋度時，微球在變色時間上才會出現(xiàn)明顯差異。結(jié)合稀釋度與圖5A中各稀釋度所對應(yīng)的細(xì)菌數(shù)量可以得出，在進行E.coli計數(shù)中，測量靈敏度約為1.62×103CFU/mL。對于S.aureu（圖5B），在菌懸液濃度為4.05×102～2.03×103CFU/mL（即1.0×10-7～5.0×1 0-7稀釋度）的5個樣品之間，微球變色時間沒有顯著差別，而在隨后的菌懸液濃度為2.43×103～4.05×103CFU/mL（即6.0×10-7～10×10-7稀釋度）的5個樣品之間，微球顏色變化時間也沒有顯著差別。明顯的時間差異出現(xiàn)在5.0×10-7～6.0×10-7稀釋度之間，相差約1 h。由此推算，在S.aureu計數(shù)中測量靈敏度為5倍稀釋度，約2.03×103CFU/mL。

另外，當(dāng)菌液樣品稀釋梯度過大，其中細(xì)菌數(shù)量低于2.02×102CFU/mL時，微球變色時間超過19 h并且各濃度之間變色時間無明顯區(qū)別，表明該方法對樣品中細(xì)菌數(shù)量的最低檢測限為2.02×102CFU/mL。

2.6 微球吸附平衡與吸附動力學(xué)

微球的吸附能力是影響變色時間與檢測結(jié)果的關(guān)鍵因素，因此對微球的吸附特征做了進一步研究。

使用無培養(yǎng)基的ARD微球?qū)?種細(xì)菌進行吸附平衡實驗。采用考察固-液界面吸附模式常用的Langmuir等溫式[15]和Freundlich等溫式[16]對吸附平衡線進行分析，發(fā)現(xiàn)實驗數(shù)據(jù)可以用Freundlich方程進行擬合，即：

式中：qe為平衡吸附量/（CFU/100 微球）；ce為平衡濃度/（CFU/mL）；k和1/n為Freundlich常數(shù)。

利用Freundlich等溫吸附方程對等溫吸附曲線進行擬合，實驗結(jié)果及擬合曲線如圖6所示。

圖6 ARD微球的Freundlich等溫吸附線（37℃）Fig.6 Freundlich isotherms on ARD microspheres (37 ℃)

由圖6可以看出，對于2種菌而言，lgqe與lgce呈線性關(guān)系（E.coli：R2=0.934 1，S.aureu：R2=0.955 4）。E.coli和S.aureu的等溫吸附線可以用分別用lgqe=0.971 9 lgce－0.511 1（n=1.029，k=0.308，T=37 ℃）與lgqe=0.736 lgce＋1.393 7（n=1.359，k=24.757，T=37 ℃）來表示。隨著細(xì)菌濃度的增加，微球?qū)?xì)菌的吸附容量也隨之增加。由實驗數(shù)據(jù)與Freundlich等溫吸附方程的擬合情況看，參數(shù)1/n在0.5～1.0之間，表示微球?qū)儆谥械任絒17]。

圖7 微球吸附動力學(xué)Fig.7 Adsorption kinetics of E.coli and S.aureus on ARD microspheres

在反應(yīng)溫度為37℃時，測定不同反應(yīng)時間條件下細(xì)菌的平衡濃度并計算微球?qū)?xì)菌的吸附量，結(jié)果如圖7所示。

由圖7可知，AMRD微球?qū).coli與S.aureu 2種細(xì)菌在37 ℃條件下吸附時間曲線在吸附前期呈現(xiàn)相同的趨勢，隨著時間的延長吸附量逐漸增加，在30 min后吸附量均達到最高點。當(dāng)E.coli與S.aureu 2種菌的起始濃度分別為2.02×104CFU/mL與4.05×104CFU/mL時，吸附30 min后其最大吸附量分別為3.0×102、2.4×103CFU/100微球。隨后E.coli的吸附量保持平衡，而S.aureu的吸附量出現(xiàn)略微下降后在45 min時達到平衡（平衡吸附量為1.60×103CFU/100微球）。這一吸附量要低于陸愛霞等[16]采用膠原纖維固化鐵吸附材料以及蔣代華等[18]采用的高嶺土材料對E.coli與S.aureu 2種細(xì)菌的吸附量。從吸附速率來看，AMRD微球?qū).coli與S.aureu的吸附比較迅速，在30～45 min內(nèi)達到平衡?？梢該?jù)此推測該微球?qū)?xì)菌的吸附以單層表面吸附為主[15-17,19]，而實驗之初假設(shè)的微球中小孔對細(xì)菌的吸附在本實驗中未能得到明顯的表現(xiàn)與證實。

圖8 溫度對微球吸附的影響Fig.8 Influence of temperature on adsorption of E.coli and S.aureu on ARD microspheres

同時考察了在相同濃度下，溫度對2種菌的吸附影響，結(jié)果見圖8。由圖8可以看出，在低菌濃度（E.coli 2.02×104CFU/mL，S.aureu 4.05×104CFU/mL）條件下，溫度變化對微球的吸附量無明顯影響。

微球與細(xì)菌之間的吸附受到來自與多方面因素的影響。靜電吸引力、范德華力、疏水作用力、比表面積等都可能影響細(xì)菌的吸附[20-22]，其中靜電吸引力與比表面積都可能有很大的影響[16,23]。絕大多數(shù)細(xì)菌表面帶有負(fù)電荷，而海藻酸鈉本身也是荷負(fù)電的物質(zhì)，雖然加入硅藻土之后能夠提升吸附能力，但由于電荷的排斥作用，可能對細(xì)菌的吸附起到了一定的阻礙作用。另一方面，本研究中所制作的微球直徑約為1～2 mm，其比表面積比較小，這也可能是微球?qū)?xì)菌的吸附能力不夠強的原因。但硅藻土含量與海藻酸鈉質(zhì)量比超過1.4∶1之后，相關(guān)系數(shù)的降低（表1）也同時表明對于細(xì)菌計數(shù)而言并非單層表面吸附能力越強越好。這為今后提高微球計數(shù)準(zhǔn)確性方面的研究提供了方向：1）改進微球的制作工藝，尋求使微球表面荷正電的方法并使細(xì)菌可以進入微球中的孔隙[24]；2）盡量減小微球的體積，提高其比表面積。

3 結(jié) 論

利用設(shè)計組裝的微球制備系統(tǒng)，制備了AMRD微球。該微球能夠?qū)σ后w樣品中的細(xì)菌進行吸附，并且能夠提供營養(yǎng)成分供細(xì)菌生長；同時細(xì)菌的活動可導(dǎo)致微球中刃天青顏色變化，通過微球的顏色變化情況判斷樣品中細(xì)菌的數(shù)量。實驗結(jié)果表明，其顏色變化時間與細(xì)菌的數(shù)量存在線性關(guān)系，這一關(guān)系受到小球中硅藻土與培養(yǎng)基含量的影響。當(dāng)海藻酸鈉∶硅藻土為1∶1.4（m/m）時，微球變色時間與細(xì)菌數(shù)量之間的線性關(guān)系最佳，并且在低濃度的環(huán)境中表現(xiàn)出較好的檢測靈敏度。當(dāng)微球中培養(yǎng)基濃度較高時，微球變色速率加快，但是在低濃度情況下的檢測靈敏度降低。

本實驗的微球計數(shù)法檢測限約為2.02×102CFU/mL。對E.coli與S.aureu的檢測靈敏度分別為1.62×103、2.03×103CFU/mL。檢出時間約為2～16.5 h，比平板菌落計數(shù)方法所需的20～48 h有較大的縮短。

微球?qū)?xì)菌的吸附符合Freundlich等溫吸附方程，屬于單層表面吸附，在低濃度下受溫度影響不大，1/n在0.5～1.0之間，屬于中等吸附，吸附飽和大約需要30～45 min。

AMRD微球細(xì)菌計數(shù)法采用事先制備并分裝的微球小管，使用時無需對樣品稀釋，直接加樣并培養(yǎng)即可，是一種簡單易操作、靈敏度高且快速經(jīng)濟的細(xì)菌計數(shù)新方法，使用的培養(yǎng)基相對平板菌落計數(shù)法而言大大減少，在食品、水源、環(huán)境檢測等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景。

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Rapid Detection of Total Bacterial Number Using Alginate-Medium-Resazurin-Diatomaceous Silica Microspheres Method

WEI Wei1,2, LI Zheng-guo2, CHENG Chan-juan3, YANG De-fang4
(1. College of Life Science, Chongqing Normal University, Chongqing 400047, China; 2. Genetic Engineering Research Center, College of Bio-Engineering, Chongqing University, Chongqing 400045, China; 3. Chongqing No. 95 Middle School, Chongqing 400084, China; 4. Chongqing Bashu Middle School, Chongqing 400013, China)

Alginate-medium-resazurin-diatomaceous silica microspheres (AMRD microspheres) were prepared to establish a rapid method for counting the number of bacterial cells. The results suggested that the positive optimum linear correlation between the concentration of bacterial cells and discoloration time of AMRD microcapsules was achieved at a ratio of alginate to diatomaceous silica of 1:1.4 with single medium concentration. The limit of detection (LOD) of the method was 2.02×102CFU/mL. The detection time was 2–16.5 h. The detection sensitivities for Escherichia coli and Staphylococcus aureus were 1.62 × 103CFU/mL and 2.03 × 103CFU/mL, respectively. The adsorption isotherms could be described by the Freundlich equation and the coefficient of adsorption (1/n) was 0.5–1.0, which was thus considered as moderate adsorption. No significant change in the adsorption capacity was observed at varying temperatures at a low bacterial cell concentration and the time needed to reach the maximum bacterial adsorption balance was 30–45 min. In conclusion, AMRD microcapsules is a new rapid and economical bacterial cell counting method, which can be applied in the fields of food, water source and environmental monitoring.

alginate; diatomaceous silica; resazurin; bacterial cell counting; adsorption for bacteria

Q93.332

A

1002-6630（2014）04-0179-07

10.7506/spkx1002-6630-201404037

2013-05-08

重慶師范大學(xué)精品課程項目（重師教發(fā)[2010]No.138）；重慶師范大學(xué)校級青年基金項目（12XWQ15）；重慶師范大學(xué)“活性物質(zhì)生物技術(shù)教育部工程研究中心”建設(shè)項目（GCZX2012-4）

韋偉（1980—），男，講師，博士研究生，研究方向為微生物學(xué)。E-mail：weiwei_cqnu@163.com