朱艷梅，趙其陽，陳衛(wèi)軍，焦必寧,3,*，張耀海

（1.農(nóng)業(yè)部柑桔產(chǎn)品質(zhì)量安全風險評估實驗室（重慶），西南大學柑桔研究所，重慶 400712；2.西南大學食品科學學院，重慶 400715；3.國家柑桔工程技術研究中心，中國農(nóng)業(yè)科 學院柑桔研究所，重慶 400712）

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜結合QuEChERS方法快速檢測柑橘中的殘留苯丁錫

朱艷梅1,2，趙其陽1，陳衛(wèi)軍1，焦必寧1,2,3,*，張耀海1

（1.農(nóng)業(yè)部柑桔產(chǎn)品質(zhì)量安全風險評估實驗室（重慶），西南大學柑桔研究所，重慶 400712；2.西南大學食品科學學院，重慶 400715；3.國家柑桔工程技術研究中心，中國農(nóng)業(yè)科 學院柑桔研究所，重慶 400712）

采用改進的QuEChERS方法結合超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀，建立快速檢測柑 橘中殘留苯丁錫的方法。樣品經(jīng)乙腈提取、無水MgSO4和NaCl脫水鹽析、十八烷基硅膠鍵合相分散萃取凈化，采用BEH C18液相色譜柱分離（2.1 mm×50 mm），等度洗脫，在多反應監(jiān)測模式下測定，基質(zhì)匹配標準溶液外標法定量。結果表明：在0.001～1.0 mg/L范圍內(nèi)，苯丁錫含量與峰面積具有良好的線性關系，R2≥0.993 0；方法定量限為2.0 μg/kg；在方法線性范圍內(nèi)，柑橘果肉、果皮和全果中低、中、高3個添加水平的平均回收率為74.0%～97.7%，相對標準偏差為2.5%～6.9%。該方法操作簡單、快速、成本低、環(huán)境友好、安全、精確度高，能滿足柑橘中痕量苯丁錫殘留的快速確證和定量檢測要求。

QuEChERS；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；柑橘；苯丁錫

苯丁錫（fenbutatin oxide，分子式C60H78OSn2)是一種感溫型抑制神經(jīng)組織的有機錫殺螨劑，中等毒性[1]，對植物葉螨、癭螨和銹螨具有良好的防治效果，主要用于防治柑橘、蘋果、葡萄、茶樹和蔬菜等作物的植物食性螨，殘效期比較長。目前美國、歐盟、日本等均制定了苯丁錫在柑橘類水果中的最大殘留限量標準，我國規(guī)定柑橘中苯丁錫的最大殘留限量值為5 mg/kg[2]，但尚未制定柑橘類水果中殘留苯丁錫的標準檢測方法，加之果農(nóng)使用苯丁錫農(nóng)藥欠規(guī)范，可能導致柑橘鮮果中的殘留量過高而產(chǎn)生潛在的質(zhì)量安全風險，因此建立快速、準確、靈敏的柑橘中苯丁錫殘留確證檢測方法十分必要。

目前報道的苯丁錫殘留的檢測方法主要有氣相色譜法（gas chromatography，GC）[3-5]、氣相色譜-質(zhì)譜法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）[6-9]和液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC））[10-12]。這些方法主要針對環(huán)境和動物源性食品中殘留苯丁錫的分析，而植物源性食品，特別是柑橘類產(chǎn)品中殘留苯丁錫確證方法的報道較少。其中的GC和GC-MS法，樣品通常需經(jīng)過格林試劑[13-15]或濃鹽酸[16]等衍生、凈化才能檢測，操作步驟繁瑣且重復性差，不適合大批量樣品的快速檢測。Barnes等[17]建立了高效液相色譜串聯(lián)大氣壓化學電離源質(zhì)譜（high performance liquid chromatographic-atmospheric pressure chemical ionizationmass spectrometry，HPLC-APCI-MS）法檢測番茄、黃瓜、香蕉中苯丁錫殘留，樣品前處理雖不需衍生，但操作繁瑣，有機溶劑消耗量大，且檢測靈敏度不高。本研究針對復雜的柑橘類鮮果樣品基質(zhì)，采用改進的QuEChERS方法，樣品前處理無需衍生，首次建立了檢測柑橘類水果中痕量殘留苯丁錫的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultraperformance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS-MS）法。該方法低成本且環(huán)保、操作簡便快速，且方法靈敏度極高、重復性好、準確度高，適合大批量柑橘類鮮果樣品中苯丁錫殘留的快速確證和定量檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苯丁錫標準品（純度＞9 9%） 德國G r. Ehrenstorfer GmbH公司；十八烷基硅膠鍵合相（40～63 μm） 加拿大Silicycle公司；無水MgSO4（分析純，用前先在500 ℃馬弗爐內(nèi)烘干5 h） 江蘇強盛化工有限公司；NaCl（分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；乙腈、甲醇、二氯甲烷（均為色譜純）、甲酸、甲酸銨（均為分析純） 重慶川東化工有限公司。

1.2 儀器與設備

Quatrro-Premier XE超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜、Acquity UPLC BEH C18柱 美國Waters公司；Milli-Q A10超純水器 美國Millipore公司；CL31/CL31R多用途離心機 美國Thermo Fisher公司；KS260搖床 德國IKA公司；0.22 μm有機濾膜 北京捷盛依科科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品預處理

取大約1.0 kg柑橘鮮果樣品，用干凈紗布將樣品表面附著物擦去，以四分法分別取全果、果肉和果皮等樣品部位進行勻漿。

1.3.2 標準溶液的配制

標準貯備液：準確稱取10.0 mg（精確到0.1 mg）苯丁錫標準品，用二氯甲烷溶解并定容至100 mL，得到100 mg/L苯丁錫母液，于－50℃條件下保存。

標準工作液：準確移取一定體積的苯丁錫母液，分別用乙腈稀釋成0.01、0.1、1、5 mg/L和10 mg/L的苯丁錫標準工作液，于－4℃條件下保存。

基質(zhì)空白標準工作溶液：將不含苯丁錫的柑橘果皮、果肉和全果樣品按1.3.1節(jié)方法進行前處理，得到基質(zhì)空白溶液。用基質(zhì)空白溶液將苯丁錫標準工作液按相同比例稀釋至0.001、0.01、0.1、0.5 mg/L和1.0 mg/L，得到柑橘果皮、果肉和全果基質(zhì)空白標準工作溶液。

1.3.3 樣品提取和凈化

準確稱取5.00 g（精確至0.01g）已勻漿的樣品于20 mL離心管中，加10.00 mL乙腈，300 r/min振蕩30 min；加入1.5 g無水MgSO4和0.5 g NaCl，劇烈振蕩1 min，4 000 r/min離心5 min；取上清液2 mL，加20 mg十八烷基硅膠鍵合相（C18），渦旋1 min，3 000 r/min離心5 min；取適量上清液過0.22 μm有機濾膜，待測。

1.3.4 色譜條件

色譜柱：A c q u i t y U P L C B E H C18柱（2.1 mm×50 mm，1.7 ?m）；柱溫30 ℃；進樣量3 ?L；流速0.3 mL/min；流動相為0.1%甲酸水溶液（5 mmol/L甲酸銨）-甲醇（體積比為10∶90）；等度洗脫5 min。

1.3.5 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源；正離子模式；電離電壓3.20 kV；離子源溫度120 ℃；錐孔反吹氣流量50 L/h；脫溶劑氣溫度380 ℃；脫溶劑氣流量800 L/h；碰撞氣流量為0.18 L/min；多反應監(jiān)測模式；苯丁錫監(jiān)測離子及碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 苯丁錫監(jiān)測離子、駐留時間、錐孔電壓及碰撞電壓Table 1 Detection ions, dwell time, cone voltage and collision energy of fenbutatin oxxiiddee

2 結果與分析

2.1 QuEChERS方法的改進

2.1.1 樣品量的選擇

采用QuEChERS方法作為檢測農(nóng)藥殘留的前處理技術時，樣品量通常選用10.0 g[18-21]，本實驗比較了3個稱樣水平，樣品量分別為1.0、5.0、10.0 g，每個水平重復3次。樣品量為1.0 g時，精密度、重復性差；樣品量選擇5.0 g和10.0 g時，回收率分別為75.8%～110.2%和72.5%～102.3%，相對標準偏差均小于10%，實驗穩(wěn)定性好，均能滿足農(nóng)殘檢測分析的要求。但是樣品量的增加會使提取劑乙腈的用量增加，這樣不僅成本增加，而且污染環(huán)境，綜合考慮，本方法的樣品量定為5.0 g。

2.1.2 除水劑用量的選擇

傳統(tǒng)的前處理過程通常采用無水Na2SO4作為除水劑，QuEChERS方法改用吸水性更好的無水MgSO4作為除水劑，并結合NaCl的鹽析作用，使苯丁錫充分溶解在有機相中。本實驗以全果為基質(zhì)，優(yōu)化了無水MgSO4的用量，發(fā)現(xiàn)當無水MgSO4的用量在0.5～1.5 g時，苯丁錫的回收率隨用量的增加而呈上升趨勢；在1.5～3 g范圍內(nèi)時，苯丁錫的回收率隨用量的增加呈降低趨勢（圖1），所以本方法選擇1.5 g無水MgSO4作為除水劑。

圖1 MgSO4用量對苯丁錫加標回收率的影響（加標水平0.2 mg/kg）Fig.1 Effect of MgSO4dose on fenbutatin oxide recovery (spiked concentration 0.2 mg/kg)

2.1.3 凈化劑的選擇

圖2 不同用量苯丁錫加標回收率的影響（加標水平0.2 mg/kg）Fig.2 Effect of C18dose on fenbutatin oxide recovery (spiked concentration 0.2 mg/kg)

Q u E C h E R S選用的凈化劑主要有石墨炭黑（graphitized carbon blacks，GCB）、N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）、十八烷基硅膠鍵合相（octadecylsilyl silica gel，C18）等。本實驗以全果為基質(zhì)，對這3種吸附劑及其不同組合的凈化效果作了比較，發(fā)現(xiàn)GCB對苯丁錫的吸附性極強，可能是因為苯丁錫為極性分子，帶有芳香環(huán)，并且結構非常對稱。PSA和C18凈化后，苯丁錫回收率均能滿足農(nóng)殘檢測要求。但空白基質(zhì)加標實驗發(fā)現(xiàn)，以PSA為凈化劑時，基質(zhì)標液苯丁錫的離子響應信號值明顯強于溶劑標液的響應值，即PSA凈化樣品時存在較強的基質(zhì)效應，而C18凈化樣品基質(zhì)效應明顯小于PSA的。所以本方法選定凈化劑為C18，并對C18用量做了進一步優(yōu)化，圖2為C18的用量為10～80 mg時對應的苯丁錫加標回收率，C18用量為20 mg時，苯丁錫加標回收率最佳。

2.2 液相色譜和質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.2.1 流動相及洗脫條件的優(yōu)化

由于甲醇比乙腈更適合于正離子監(jiān)測模式，所以本實驗比較了水-甲醇、甲酸溶液-甲醇、甲酸＋甲酸銨溶液-甲醇3種流動相體系。研究發(fā)現(xiàn)流動相中加入少量甲酸后，可抑制苯丁錫峰拖尾，增強離子信號強度值；而加入少量甲酸銨后，苯丁錫峰形可得到明顯改善。因此本方法選用甲酸＋甲酸銨溶液-甲醇流動相體系，并進一步優(yōu)化了甲酸和甲酸銨的加入量。發(fā)現(xiàn)當甲酸和甲酸銨加入量分別達到0.1%和5 mmol/L時，峰形不再隨甲酸和甲酸銨含量的增加而明顯改變，所以采用0.1%甲酸溶液＋5 mmol/L甲酸銨-甲醇作為流動相。實驗發(fā)現(xiàn)，苯丁錫在流動相比例發(fā)生變化時會出峰，檢測信號值有一定波動，所以本實驗采用等度洗脫。通過比較流動相中有機相和水相的不同比例，發(fā)現(xiàn)V（0.1%甲酸溶液＋5 mmol/L甲酸銨）∶V（甲醇）為10∶90時分離度和峰形較好，因此將0.1%甲酸溶液＋5 mmol/L甲酸銨-甲醇作為本方法的流動相體系，體積比為10∶90，苯丁錫的出峰時間在2 min左右。

2.2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

圖3 苯丁錫離子質(zhì)譜圖Fig.3 Mass spectra of fenbutatin oxide

采用流動注射泵連續(xù)進樣方式進行質(zhì)譜條件的優(yōu)化。在電噴霧離子源正離子模式下進行全掃描，確定苯丁錫的母離子為m/z 517.3。隨后優(yōu)化毛細管電壓、錐孔電壓、脫溶劑溫度、碰撞能量、碰撞壓力等質(zhì)譜參數(shù)，產(chǎn)生了m/z 194.8、m/z 349.1、m/z 461等子離子（圖3）。根據(jù)文 獻[22]，選擇2對離子進行多反應監(jiān)測即可滿足要求，因此選取了離子豐度較強、干擾較小的m/z 517.3＞461和m/z 517.3＞194.8離子對作為監(jiān)測離子對，以豐度最強的子離子m/z 194.8作為定量離子。

2.3 方法的評價

2.3.1 標準曲線及定量限

本實驗采用基質(zhì)匹配標準溶液外標法定量，為降低基質(zhì)效應對定量測定的影響，本方法選擇了空白基質(zhì)標準溶液工作曲線進行定量。按照UPLC-MS-MS條件從低到高依次測定空白基質(zhì)標準溶液，以基質(zhì)標準溶液質(zhì)量濃度/（mg/L）為橫坐標，MS-MS定量離子色譜峰峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，進行線性回歸分析。結果表明，苯丁錫在0.001～1.0 mg/L范圍內(nèi)具有良好的線性關系，R2≥0.993 0（表2），方法定量限為2.0 μg/kg。

表2 苯丁錫的線性范圍、線性方程、相關系數(shù)（n=6）Table 2 Liner range, linear equation and correlation coefficient of fenbutation oxid ( = 6)

2.3.2 加標回收率及精密度

分別稱取柑橘果肉、果皮、全果5.0 g，添加0.01、0.1、0.2 mg/kg 3個苯丁錫水平，每個水平設置6個重復，按照1.3.3節(jié)進行提純凈化，然后用選定的UPLC-MSMS條件測定苯丁錫含量。結果表明（表3），果肉、果皮、全果中苯丁錫的平均添加回收率分別為81.6%、87.8%、81.3%，相對標準偏差為2.5%～6.9%，方法的準確度和精密度都符合農(nóng)殘檢測的要求。

表3 加標回收率及精密度測試結果（n=6）Table 3 Results of recovery and precision tests (n =6)

2.3.3 實際樣品的檢測

圖4 柑橘實際樣品中苯丁錫的色譜圖Fig.4 Chromatogram of fenbutatin oxide in real citrus samples

本實驗實際樣品來自苯丁錫田間殘留實驗樣品，從中隨機抽取若干份，采用QuEChERS-UPLC-MS-MS快速分析各樣品中苯丁錫殘留（圖4）。結果顯示，果皮中苯丁錫檢出含量為1.264～3.084 mg/kg；果肉的苯丁錫檢出含量為0～0.029 mg/kg；全果的苯丁錫檢出含量為0.166～0.366 mg/kg。可以看出，苯丁錫主要分布在柑橘果皮上，難以通過果皮進入內(nèi)部的果肉組織。

3 結 論

本研究采用改進的QuEChERS方法建立了UPLC-MSMS檢測柑橘中苯丁錫的方法，方法精密度、靈敏度、回收率和定量限均能很好地滿足農(nóng)藥殘留分析的要求。與傳統(tǒng)的苯丁錫殘留檢測方法比，前處理無需衍生，簡便、快速、低成本、準確、靈敏度高，僅需5 min即可完成全部檢測，適合大批量快速確證和定量檢測柑橘樣品中痕量殘留的苯丁錫，有較高的應用推廣價值。

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Ultra High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Combined with QuEChERS for the Quick Detection of Fenbutatin Oxide Residue in Citrus

ZHU Yan-mei1,2, ZHAO Qi-yang1, CHEN Wei-jun1, JIAO Bi-ning1,2,3,*, ZHANG Yao-hai1
(1. Laboratory of Quality and Safety Risk Assessment for Citrus Products (Chongqing), Ministry of Agriculture, Citrus Research Institut e, Southwest University, Chongqing 400712, China; 2. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China; 3. National Citrus Engineering Research Center, Citrus Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Chongqing 400712, China)

The fenbutatin oxide residue in citrus fruits was detected by optimized QuEChERS combined with ultraperformance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS-MS). Fenbutatin oxide was extracted from the samples with acetonitrile, salted out with anhydrous MgSO4and NaCl, cleaned up with octadecyl bonded phase silica gel and then analyzed by UPLC-MS-MS in multiple reaction monitoring (MRM) mode. The separation of the target pesticide residue was performed on an BEH C18column (2.1 mm×50 mm) using a mobile phase consisting of 0.1% formic acidmethanol by isocratic elution and the matrix-matched external standard calibration was used for quantitation. There was a linear relation between fenbutatin oxide content and peak area in the range of 0.001–1.0 mg/L (R2≥ 0.993 0), and the limit of quantitation was 2.0 μg/kg. The average recoveries in different matrices (citrus pulp, peel and whole fruits) at three spiked concentration levels ranged from 74.0% to 97.7% with relative standard deviations (RSDs) of 2.5%–6.9%. This method was simple, quick, cheap, environmentally friendly and safe. The accuracy and precision could meet the requirements for quick confirmation and quantitative determi nation of trace fenbutatin oxide residue in citrus fruits.

QuEChERS; ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; citrus; fenbutatin oxide

TS207.3

A

1002-6630（2014）04-0111-05

10.7506/spkx1002-6630-201404023

2013-04-30

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（柑橘）產(chǎn)業(yè)技術體系建設專項（CARS-27）；農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所殘留項目（2012P303）

朱艷梅（1986—），女，碩士研究生，研究方向為食品安全與質(zhì)量控制。E-mail：zhuyanmei0828@163.com

*通信作者：焦必寧（1964—），男，研究員，本科，研究方向為果蔬質(zhì)量安全及檢測技術。E-mail：bljiao@tom.com