李 鈺，吳 衛(wèi)*，蘇 華，易 斌

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，四川 成都 611130）

響應(yīng)面法優(yōu)化紫蘇籽粕超聲輔助提取原花青素工藝

李 鈺，吳 衛(wèi)*，蘇 華，易 斌

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，四川 成都 611130）

為充分利用紫蘇資源，優(yōu)化其籽粕原花青素提取工藝，考察了料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲功率、溫度、時(shí)間對原花青素得率的影響，并根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上選擇主要影響因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。響應(yīng)面優(yōu)化后提取工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、浸提時(shí)間0.5 h、浸提溫度70 ℃、超聲功率100 W、料液比1∶15。在此條件下原花青素得率理論值為0.232%，實(shí)測值為0.229%。

紫蘇；籽粒；原花青素；響應(yīng)面法

紫蘇（Perilla frutescent）是傳統(tǒng)的藥食同源植物。蘇葉能發(fā)散風(fēng)寒、行氣和胃；蘇?？衫須獍蔡?、止痛；蘇子有化痰平喘、潤腑等作用[1-5]。同時(shí)該屬植物葉富含氨基酸、微量元素、揮發(fā)油以及紫蘇苷等多種色素成分，其嫩葉可作蔬菜和菜肴著色劑、配菜、調(diào)料等，在日本、韓國等地甚為流行；其種子油不飽和脂肪酸含量高，尤以亞麻酸含量最高，可達(dá)80%以上，是一種難得的特種食用油源[6]。眾所周知，亞麻酸在人體代謝可生成二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）和二十碳五烯酸（eicosapntemacnioc acid，EPA），被稱為“植物腦黃金”。研究表明，食用紫蘇籽油能提高視網(wǎng)膜反射能力、 增強(qiáng)視力，同時(shí)能降低膽固醇含量、降低血脂、抗血栓、抑制腫瘤、延緩衰老等多種功效。紫蘇原產(chǎn)中國，現(xiàn)今主要分布于印度、緬甸、中國、日本等國家，在俄羅斯、日本、韓國、美國、加拿大等均有大量的商業(yè)性栽種[7]。我國是紫蘇出口大國，紫蘇籽產(chǎn)量大概5萬～6萬t，對外出口大部分是以油的形式出口，提油剩下的粕利用較少[8-9]。

原花青素（oligomeric proanthocyanidin，OPC）在結(jié)構(gòu)上是由不同數(shù)量的兒茶素或表兒茶素結(jié)合形成，具有很強(qiáng)的抗氧化、清除自由基、誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡、改善 人體微循環(huán)、改善骨的形成、促進(jìn)傷口愈合和組織修復(fù)活性、改善實(shí)驗(yàn)小鼠肥胖、改善腸道菌群等多種生物活性等作用[10-12]。有研究表明OPC在許多植物的果實(shí)、花、葉、莖及根中均可能含有，且一般在植物果實(shí)中含量相對較高[13]。本著充分深度開發(fā)利用紫蘇資源，提高其藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)效益，本實(shí)驗(yàn)擬利用超聲波輔助提取脫脂后的紫蘇籽OPC，通過單因素試驗(yàn)確定各單因素最佳值，再利用單變量多因素方差分析選定3個(gè)對提取率影響最為顯著的3個(gè)因素，最后通過Box-Behnken設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化分析確定超聲輔助提取紫蘇籽粕OPC的最優(yōu)條件組合。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫蘇籽：2010年采收的種植于遂寧的P06-4號紫蘇品系。該品系為課題組經(jīng)多年選育而成的紫蘇新品系，后經(jīng)四川省農(nóng)作物品種審定委員會(huì)審定為“川紫1號”紫蘇新品種。陰干除雜后過60目篩得紫蘇籽粉末。

兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品 成都曼 斯特生物試劑有限公司；香蘭素、甲醇、無水乙醇、濃鹽酸均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2450型紫外分光光度計(jì) 日本島津公司；RE-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；HH-4恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；高速中藥HK-04B粉碎機(jī) 廣州華凱機(jī)械設(shè)備有限公司；電子分析天平 沈陽龍騰電子有限公司；SHZ-D（III）循環(huán)水式多用真空泵 鞏義市英峪予華儀器廠；HF-5.0B超聲循環(huán)水式真空泵 北京弘祥隆生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 提取紫蘇籽OPC工藝流程

紫蘇籽粉末→石油醚浸泡脫脂→過濾→殘?jiān)鶕?jù)料液比加入溶劑→提?。刂七m當(dāng)條件）→抽濾→收集濾液→測定OPC含量→計(jì)算得率[14-15]

1.3.2 OPC含量測定方法的選擇和得率計(jì)算

目前國際上還沒有統(tǒng)一的OPC含量檢測方法，主要的測定方法包括正丁醇鹽酸法和香草醛法。正丁醇-鹽酸法對OPC化學(xué)結(jié)構(gòu)的依賴性較大，選擇性高，OPC與兒茶素單體不發(fā)生顯色反應(yīng)，因此對于低聚合度OPC的測定并不適宜[16]。而香草醛法較正丁醇鹽酸法而言更靈敏、更專一、更簡潔可行[17]。但在香草醛-硫酸法中，硫酸引起反應(yīng)體系放熱，且加諸其強(qiáng)氧化作用將共同導(dǎo)致OPC氧化分解，使測定結(jié)果偏低[18]。本實(shí)驗(yàn)采用香草醛-鹽酸法，其原理是利用A環(huán)為間苯三酚型的黃烷醇OPC在以鹽酸作為催化劑的條件下會(huì)與香草醛發(fā)生酚醛縮合反應(yīng)，生成紅色產(chǎn)物，并在500 nm波長處有最大吸光度，用分光光度法測定OPC含量[19-20]。

測定以兒茶素[21]為對照品，得到OPC質(zhì)量濃度（ρ）與吸光度（y）的曲線回歸方程：y=0.3842ρ＋0.0044，r2=0.9992。

OPC得率/%=（ρV/m）×10-3×100

式中：ρ為提取液中OPC質(zhì)量濃度/（mg/mL）；V為提取液的體積/mL；m為紫蘇籽干質(zhì)量/g。

1.3.3 紫蘇籽OPC提取的單因素試驗(yàn)

稱取脫脂紫蘇籽粉末2.0 g，按料液比1∶15加入體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇溶液，50 ℃、300 W超聲提取0.5 h。固定其他條件，分別考察不同料液比（1∶8、1∶10、1∶15、1∶20、1∶30)、浸提溫度（30、40、50、60、70 ℃）、超聲功率（100、200、300、400、500 W）、浸提時(shí)間（10、20、30、40、50 min）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（50%、60%、65%、70%、75%）對OPC提取效果的影響。

1.3.4 響應(yīng)面分析

基于單因素試驗(yàn)，選擇對OPC得率影響較大的料液比、浸提溫度和超聲功率3個(gè)因素，利用Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取5個(gè)中心點(diǎn)進(jìn)行17個(gè)試驗(yàn)，試驗(yàn)因素水平見表1。

表1 紫蘇籽OPC提取響應(yīng)面分析試驗(yàn)因素水平表Table 1 Experimental factors and levels used in response surface analysis

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

由圖1A可見，隨著溫度的升高，OPC得率先升高后降低，到50 ℃和60 ℃時(shí)得率增加達(dá)到極顯著水平，70 ℃又顯著降低。這是由于溫度升高分子運(yùn)動(dòng)加速，進(jìn)而滲透和擴(kuò)散速度加快，提取率增加。但溫度過高OPC結(jié)構(gòu)易破壞，導(dǎo)致得率降低。故選擇60 ℃左右是OPC提取的最佳溫度。

通常溶劑用量越大，OPC得率越大。由圖1B可見，隨著提取液用量的增加，OPC得率增加，并且在料液比1∶15之前，隨溶劑增加，OPC得率增加極顯著，而在料液比1∶15之后，得率增加趨于平緩，此時(shí)紫蘇籽中OPC已基本全部溶出?？紤]過高的提取液用量不僅收益小，而且會(huì)增加后序加工的能耗，增加生產(chǎn)成本，所以選擇料液比為1∶15左右為宜。

隨超聲功率的增加，OPC得率提高，由圖1C可見，當(dāng)功率達(dá)到200 W時(shí)，再增加功率，提取率增高不顯著，且在300 W后逐漸降低。實(shí)質(zhì)上，隨著功率的增加，超聲波的空化效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)能量不斷增加，加強(qiáng)了細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的擴(kuò)散及溶解，使OPC更易轉(zhuǎn)移至提取液中，OPC得率明顯提高。試驗(yàn)結(jié)果還表明，當(dāng)超聲功率超過300 W后，得率降低，此時(shí)超聲功率早已經(jīng)滿足了使目標(biāo)產(chǎn)物完全析出的能量，再增加超聲功率則會(huì)產(chǎn)生大量無用氣泡，增加了散射衰減，降低了空化強(qiáng)度[22]。因此為節(jié)約能量，選擇超聲功率為200 W。

由圖1D可知，提取時(shí)間較短OPC來不及溶出。但提取時(shí)間過長，OPC又會(huì)因?yàn)殚L時(shí)間受熱而發(fā)生結(jié)構(gòu)改變，因此確定提取時(shí)間為30 min。

圖1 不同提取條件對紫蘇籽粕OPC得率的影響Fig.1 Effects of process conditions on extraction yield of procyanidins from defatted seed meal of Perilla frutescens

試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)低體積分?jǐn)?shù)的乙醇提取液很難過濾，而在分級時(shí)溶劑界面上出現(xiàn)懸浮的絮狀物，這可能是因?yàn)镺PC在植物體內(nèi)、分子間通常與蛋白質(zhì)、多糖等通過氫鍵和疏水鍵形成穩(wěn)定的復(fù)合物，且大量水溶性雜質(zhì)如多糖、果膠、蛋白質(zhì)、色素等成分隨之溶出，影響OPC的溶出。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)太大，則會(huì)產(chǎn)生很大的滲透壓，醇溶性雜質(zhì)、色素和親脂性強(qiáng)的成分溶出增多，這些成分會(huì)與OPC競爭乙醇-水分子，使得OPC溶出減少，進(jìn)而導(dǎo)致OPC提取率下降[23]。由圖1E可見，各乙醇體積分?jǐn)?shù)提取間，OPC得率無顯著差異，為方便過濾操作，選擇70%的乙醇體積分?jǐn)?shù)。

2.2 OPC提取的響應(yīng)面分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表2 紫蘇籽OPC提取響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Scheme and experimental results of response surface Box-Behnken dessiiggnn

根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[24]，綜合單因素影響試驗(yàn)結(jié)果，選擇溫度（X1）、料液比（X2）、超聲功率（X3）對OPC提取影響顯著的3個(gè)因素，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上采用三因素三水平的響應(yīng)面分析法。單因素試驗(yàn)結(jié)果顯示：在提取溫度60 ℃、料液比1∶15、功率200 W時(shí)，紫蘇籽中的OPC有最大得率。超聲法提取紫蘇籽中OPC的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與試驗(yàn)結(jié)果見表2。

2.2.2 模型的建立及顯著性檢驗(yàn)

利用Design-Expert V8.0.6.統(tǒng)計(jì)軟件對表2所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)合表3進(jìn)行多元回歸擬合分析，剔除不顯著項(xiàng)，得到OPC得率（Y）對溫度（X1）、料液比（X2）、超聲功率（X3）的多元二次回歸方程模型為：

由表3分析結(jié)果可以看出，因素X1（溫度）對OPC得率呈極顯著（P＜0.01）影響，X3（超聲功率）對OPC得率呈顯著影響，因素X1X3和X2X3對響應(yīng)值的曲面效應(yīng)也呈顯著影響，由此可以得出結(jié)論：溫度和超聲功率是紫蘇籽OPC提取工藝中重要的影響因素，根據(jù)F值的大小，確定該3個(gè)因素對OPC提取率的影響大小為：X1（溫度）＞X3（超聲功率）＞X2（料液比）。

對多元回歸方程進(jìn)行方差分析，雖然失擬項(xiàng)顯著，但其中二次響應(yīng)面回歸模型的F值為12.99，響應(yīng)值變異系數(shù)（CV）為12.58%，模型回歸關(guān)系達(dá)到高度的極顯著水平（P=0.0014），且R2=0.9435，調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.8709，RSN為16.219，遠(yuǎn)大于5，說明該模型能解釋87.09%響應(yīng)值的變化，能在一定程度下對不同提取條件下的OPC得率進(jìn)行預(yù)測。

表3 回歸方程各項(xiàng)的方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance for each term in the response surface regression mooddeell

2.2.3 響應(yīng)面分析

響應(yīng)曲面分析法優(yōu)化圖形為響應(yīng)值Y與對應(yīng)的因素間構(gòu)成的三維圖及在二維平面上的等高圖，綜合直觀地反映各因素對響應(yīng)值的影響，每個(gè)響應(yīng)面對其中兩個(gè)因素進(jìn)行分析，另外一個(gè)因素固定在零水平上。回歸優(yōu)化響應(yīng)面圖分別見圖2。比較2組圖并結(jié)合表3中P值可知：模型的一次項(xiàng)X1極顯著，X2不顯著，X3顯著，X1X3、X2X3交互項(xiàng)顯著，X1X2交互項(xiàng)不顯著。二次項(xiàng)X12極顯著，X22顯著，表明這兩個(gè)影響因素對得率不是簡單的線性關(guān)系。由圖2可知，等高線的形狀可反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，溫度對得率影響最為顯著，表現(xiàn)為曲面比較陡；其次是超聲功率，再是料液比，表現(xiàn)為曲面比較平滑。

圖2 各因素交互作用響應(yīng)面圖和等高線Fig.2 Response surface and contour plots showing the pairwise interaction effects of various hydrolysis conditions on the extraction yield of procyanidins

2.2.4 最佳工藝條件驗(yàn)證

軟件分析得到最大的響應(yīng)值為0.231 687%，即OPC得率預(yù)測值最高為0.231 687%，與之對應(yīng)的預(yù)測工藝條件為：浸提溫度70 ℃、超聲功率100 W、料液比1∶15.55（g/mL）。根據(jù)實(shí)際操作，對工藝條件進(jìn)行簡單處理，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%、浸提時(shí)間為0.5 h、浸提溫度70 ℃、超聲功率100 W、料液比1∶15.5（g/mL）的條件下進(jìn)行2次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，OPC得率的實(shí)測值為0.229%，與預(yù)測的理論值相接近，驗(yàn)證了此模型的有效性。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化紫蘇籽OPC的提取工藝，在溫度、料液比、超聲功率3個(gè)因素中，溫度對紫蘇籽OPC的得率的影響達(dá)到了極顯著水平，超聲功率達(dá)到顯著水平，而料液比對紫蘇籽OPC得率的影響不顯著，3個(gè)因素的主次關(guān)系為：溫度＞超聲功率＞料液比。利用Design-Expert V8.0.6.軟件對BBD試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，紫蘇籽OPC超聲輔助最佳提取條件為浸提溫度70 ℃、超聲功率100 W、料液比1∶15.55（g/mL），OPC得率理論預(yù)測值為0.232%，實(shí)測值為0.229%。為紫蘇中OPC開發(fā)與利用提供一定的參考價(jià)值和理論基礎(chǔ)。

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Optimization of Ultrasound-Assisted Extraction of Proanthocyanidins from Perilla frutescens Using Response Surface Methodology

LI Yu, WU Wei*, SU Hua, YI Bin
(College of Agronomy, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China)

The ultrasound-assisted extrac tion of proanthocyanidi ns from defatted seed meal of Perilla frutescens was optimized in the present work. The effects of solid-to-liquid ratio, ethanol concentration, ultrasound power, temperature and extraction time on the extraction yield of proanthocyanidins were evaluated. Main inf uencing factors were selected based on the results of single factor experiments and optimized using response surface methodology according to the principle of Box-Behnken design. The optimal extraction conditions were determined as follows: extraction with a 15-fold volume of 70% aqueous ethanol solution at 70 ℃ with an ultrasound power of 100 W for 0.5 h. Under these conditions, the theoretically predicted yield of procyanidins was 0.232%, and the actually measured value was 0.229%.

Perilla frutescent; seed meal; procyanidins; response surface analysis

TS224.4

A

1002-6630（2014）04-0050-05

10.7506/spkx1002-6630-201404011

2013-06-14

四川農(nóng)業(yè)大學(xué)科技成果轉(zhuǎn)化項(xiàng)目（3523519）

李鈺（1988—），女，碩士，研究方向?yàn)樗幱弥参飳W(xué) 。E-mail：lookingforbluemoon@qq.com

*通信作者：吳衛(wèi)（1970—），女，教授，博士，研究方向?yàn)樗幱弥参飳W(xué)。E-mail：ewuwei@gmail.com