邵海艷，吉宏武*

（廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室，廣東普通高等學(xué)校水產(chǎn)品深加工重點實驗室，廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東 湛江 524088）

總狀蕨藻多糖體外抗腫瘤作用

邵海艷，吉宏武*

（廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室，廣東普通高等學(xué)校水產(chǎn)品深加工重點實驗室，廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東 湛江 524088）

以總狀蕨藻為原料，采用熱水與蛋白酶酶解相結(jié)合浸提得到總狀蕨藻多糖提取液，經(jīng)Sevag法和透析法等步驟純化后得到總狀蕨藻粗多糖（Caulerpa racemosa polysaccharide，CRP）。紫外掃描結(jié)果表明CRP中含有少量蛋白質(zhì)。紅外光譜分析CRP有一般糖類物質(zhì)的特征吸收峰，含硫酸基團，是一種酸性多糖。采用噻唑藍（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）法研究了CRP對HeLa、K562、CNE-2z細胞的抑制作用，結(jié)果表明CRP對3 種腫瘤細胞都有一定的抑制作用，在24～72 h內(nèi)，隨著時間的延長，抑制率逐漸增強，在0.0625～4 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨著質(zhì)量濃度的增加，抑制率逐漸增強，對HeLa、K562和CNE-2z細胞的抑制率最大分別達到61.7%、85.9%和90.3%。

總狀蕨藻；多糖；體外抗腫瘤

總狀蕨藻（Caulerpa racemosa）是綠藻門，蕨藻屬的一種大型可食用綠藻，主要分布于熱帶與亞熱帶地區(qū)海域中，長可達1 m以上，直立枝條，具有兩列以上的小枝，小枝末端膨脹，形成棍棒狀或園球狀，具有明顯的柄部。在我國的海南、廣東、廣西、東沙、西沙群島、臺灣等地廣泛分布，《新華本草綱要》記載其有行氣止痛、鎮(zhèn)驚安神之功效。中國臺灣省蘭嶼居民常采取總狀蕨藻食用。目前國內(nèi)外對總狀蕨藻多糖（Caulerpa racemosa polysaccharide，CRP）的研究相對較少，Chattopadhyay等[1]為研究其多糖結(jié)構(gòu)和抗病毒之間的關(guān)系，對其多糖進行了純化并對其結(jié)構(gòu)進行了初步分析；Wang Hui等[2]報道從總狀蕨藻中提取的硫酸甘油糖脂（sulfoquinovosyl diacylglycerol，SQDG）對HSV2有良好的抑制活性；Ghosh等[3]從總狀蕨藻中提取得到的硫酸多糖HWE，硫酸基含量為9%，主要由半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖和木糖組成，在胞外具有抗皰疹活性；馬夏軍等[4]對其中的脂肪酸、甾醇進行了分析。本課題組前期對總狀蕨藻的基本營養(yǎng)成分[5]、其硫酸多糖提取工藝[6]、分離純化[7]、抗腫瘤與免疫活性[8]及其水溶性成分的抗氧化活性進行了初步的研究[9]，結(jié)果表明總狀蕨藻中含有豐富的硫酸多糖，對小鼠體內(nèi)S180和H22均有較好的抑制作用，能直接或協(xié)同有絲分裂原ConA促進小鼠脾淋巴細胞增殖，還能夠有效地促進小鼠腹腔巨噬細胞MФ吞噬中性紅和分泌NO的數(shù)量。

本實驗在以前工作基礎(chǔ)上通過光譜分析對CRP的結(jié)構(gòu)進行初步分析，并對其體外抗腫瘤活性進行進一步研究，以期為CRP的開發(fā)利用奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

總狀蕨藻（Caulerpa racemosa） 湛江徐聞縣瓊州海峽。

K562細胞（人白血病細胞株）、HeLa細胞（宮頸癌細胞株）、CNE-2Z細胞（人低分化鼻咽癌細胞株）廣東醫(yī)學(xué)院藥理實驗室惠贈。

胎牛血清 杭州四季青公司；DMEM和 RPMI 1640美國Gibco公司；噻唑藍（methylthiazolyldiphenyltetrazolium bromide，MTT）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecylsulfate，SDS） 美國Sigma公司；中性蛋白酶丹麥諾維信公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

CO2培養(yǎng)箱 美國Shellab公司；倒置顯微鏡 日本Olympus公司；DG-5031型酶聯(lián)免疫檢測儀 國營華東電子管廠；超凈工作臺 北京昌平長城凈化公司；UV-2102PC型紫外-可見分光光度計 尤尼柯（上海）儀器有限公司；96 孔細胞培養(yǎng)板 美國Gibco公司。

1.3 方法

1.3.1 CRP的制備[6]

稱取一定量的總狀蕨藻粉末按固液比l∶10（m/V）添加蒸餾水，并按136.5 U/g加入中性蛋白酶，60 ℃提取2.5 h后，再將固液比調(diào)至1∶20，將溫度升至95 ℃，再繼續(xù)提取2.5 h，冷卻后，提取液用紗布過濾。提取液經(jīng)粗濾后上清液在80 ℃條件下真空濃縮至1/4體積，濃縮液離心，取上清液。多糖提取液經(jīng)Sevag試劑去蛋白質(zhì)后通過10 000 D透析袋透析，加入3 倍體積的95%乙醇，離心收集沉淀，所得沉淀冷凍干燥，即得CRP，其得率為6.7%。

1.3.2 CRP的理化性質(zhì)檢測

1.3.2.1 定性實驗

溶解實驗：取少量CRP分別加入水、95%乙醇、乙醚、丙酮、乙酸乙酯等溶劑，觀察CRP在這些溶劑中的溶解情況；Molish反應(yīng)[10]；Fehling試劑反應(yīng)[10]；硫酸基定性實驗[11]；雙縮脲反應(yīng)[10]。

1.3.2.2 定量實驗

總糖含量測定[12]：采用苯酚-硫酸比色法；硫酸基含量測定[11]：采用硫酸鋇比濁法；蛋白質(zhì)含量測定[10]：采用考馬斯亮藍法；糖醛酸含量測定[10]：采用硫酸-咔唑法。

1.3.3 紫外掃描光譜分析

稱取一定量CRP配制成一定質(zhì)量濃度的多糖溶液，在波長200～400 nm區(qū)間掃描，觀察其在該波長范圍內(nèi)的吸收情況。

1.3.4 紅外光譜分析

取適量CRP經(jīng)KBr壓片，4000～400 cm－1紅外波數(shù)范圍內(nèi)掃描。

1.3.5 CRP的體外抗腫瘤活性

1.3.5.1 細胞培養(yǎng)

在37℃、體積分數(shù)為5%的CO2孵箱中對HeLa、K562和CNE-2Z腫瘤細胞在含10 g/100 mL滅活胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的培養(yǎng)液（HeLa在DMEM培養(yǎng)液中，K562和CNE-2Z分別用RPMI 1640 培養(yǎng)）中常規(guī)培養(yǎng)，隔天傳代，調(diào)整細胞生長狀態(tài)，取對數(shù)生長期、生長良好的細胞，再調(diào)整細胞密度為1×106個/mL進行實驗。

1.3.5.2 多糖溶液的配制

稱取CRP 24 mg，加入6 mL細胞培養(yǎng)液溶解配成4 mg/mL的多糖溶液，過濾除菌，然后用培養(yǎng)液分別稀釋成不同質(zhì)量濃度梯度的多糖溶液。

1.3.5.3 CRP體外對腫瘤細胞的抑制作用

采用MTT比色法，收集對數(shù)期生長的K562、HeLa和CNE-2Z細胞接種于96 孔培養(yǎng)板，每孔90 ?L細胞懸液（含1.0×104個細胞）培養(yǎng)24 h，加入不同質(zhì)量濃度的CRP溶液10 ?L，對照組（0 mg/mL CRP溶液）加入同等體積相應(yīng)的細胞培養(yǎng)液，每組設(shè)3 個平行孔，充分混勻后，繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h和72 h。每孔加入MTT 20 ?L（5 g/L磷酸鹽緩沖溶液），再培養(yǎng)5 h，每孔加入1 g/100 mL SDS-5%異丁醇-0.012 mol/L HCl的三聯(lián)液100 ?L，37 ℃放置過夜后，用酶標(biāo)儀測定各孔OD570nm值，調(diào)零孔則用細胞培養(yǎng)液代替細胞懸液和藥液。按下式計算抑制率，從而計算半數(shù)抑制濃度IC50。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果與分析

2.1 CRP的性狀

CRP呈淺褐色粉末狀，有一定黏度，溶于熱水，不溶于95%的乙醇、乙醚、丙酮、乙酸乙酯等有機溶劑。CRP的Molish反應(yīng)為陽性，F(xiàn)ehling試劑反應(yīng)為陰性，經(jīng)2 mol/L硫酸加熱水解后，水解液Fehling試劑反應(yīng)為陽性，表明產(chǎn)品為非還原性多糖，經(jīng)酸水解后，有還原性糖類存在。硫酸基定性實驗為陽性，說明產(chǎn)品中有硫酸基團存在。雙縮脲反應(yīng)為陽性，說明產(chǎn)品中有蛋白質(zhì)存在。

2.2 CRP紫外掃描光譜分析

圖1 CRP紫外掃描圖譜Fig.1 UV Spectrum of CRP

由圖1可知，CRP溶液在波長200 nm左右具有典型的多糖吸收峰，并且在280 nm波長處有少許蛋白質(zhì)吸收峰。

2.3 CRP紅外光譜分析

圖2 CRP紅外掃描圖譜Fig.2 Infrared spectrum of CRP

由圖2可知，3 400 cm-1處的吸收峰是—OH的伸縮振動吸收峰，表明多糖存在分子間或分子內(nèi)氫鍵；在3 000～2 800 cm-1區(qū)域內(nèi)的吸收峰是糖類的特征峰，CRP在2 923 cm-1處的吸收峰是C—H的伸縮振動引起的；1 651 cm-1處的峰是多糖中乙酰氨基（—NHCOCH3）的C=O伸縮振動，證明蛋白質(zhì)官能團的存在；1 380 cm-1處吸收峰是羧基（C—O）伸縮振動引起的，表明CRP是一種酸性多糖；1 258 cm-1處是硫酸基（—O—SO2－）中S=O的伸縮振動引起的吸收峰，表明CRP是一種硫酸多糖。

2.4 CRP基本組成

表1 CRP基本組成含量測定結(jié)果Table1 Chemical composition of CRP

由表1可知，CRP盡管經(jīng)過反復(fù)除蛋白，但還含有一定量蛋白質(zhì)，此蛋白可能與多糖通過糖肽鏈以聚合物形式存在；CRP中含有的硫酸基含量高達27.6%，暗示其可能具有較高的生物活性。

2.5 CRP對腫瘤細胞生長的抑制作用

2.5.1 對HeLa細胞生長的抑制作用

表2 CRP對HeLa細胞生長的抑制作用Table2 Inhibitory effect of CRP on the growth HeLa cells

由表2可知，CRP對HeLa細胞的生長有一定抑制作用，在24～72 h內(nèi)，隨著時間的延長，抑制率逐漸增強，在0.0625～4 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨著質(zhì)量濃度的增加，抑制率逐漸增強。CRP對HeLa細胞作用24、48 h和72 h的IC50值分別為2.94、2.59 mg/mL和1.26mg/mL。

2.5.2 對K562細胞生長的抑制作用

表3 CRP對K562細胞生長的抑制作用Table3 Inhibitory effect of CRP on the growth K562 cells

由表3可知，CRP對K562細胞的生長有一定的抑制作用。不同質(zhì)量濃度的CRP對K562細胞作用24 h時，在0.0625～2 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，CRP對K562細胞的抑制作用不顯著，但達到4 mg/mL時，抑制效果顯著增強；CRP對K562細胞生長的抑制作用隨著時間的延長，抑制率也逐漸增強，4 mg/mL CRP作用72 h時，抑制率達到85.9%。CRP對K562細胞作用24、48 h和72 h的IC50分別為2.64、1.26 mg/mL和0.21 mg/mL。

2.5.3 對CNE-2z細胞生長的抑制作用

表4 CRP對CNE-2z細胞生長的抑制作用Table4 Inhibitory effect of CRP on the growth CNE-2z cells

由表4可知，CRP對CNE-2z細胞的生長有一定的抑制作用。不同質(zhì)量濃度的CRP對CNE-2z細胞作用24 h時，在0.0625～2 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，CRP對CNE-2z細胞的抑制作用不顯著，但達到4 mg/mL時，抑制效果顯著增強；CRP對CNE-2z細胞生長的抑制作用隨著時間的延長，抑制率也逐漸增強，4 mg/mL CRP作用72 h時，抑制率達到90.3%。CRP對CNE-2z細胞作用24、48 h和72 h的IC50分別為1.55、0.75 mg/mL和0.49 mg/mL。

3 討 論

通過比較CRP對3 種腫瘤細胞的IC50發(fā)現(xiàn)，分別作用24 h和48 h時，HeLa細胞的IC50最大，其次是K562細胞，CNE2z細胞的IC50最小。然而作用72 h后，K562細胞的IC50最小，HeLa細胞的IC50依然最大?？梢姡琀eLa細胞對CRP最不敏感。近些年來國內(nèi)外有關(guān)海洋生物多糖抗腫瘤機制表現(xiàn)在以下幾個方面[13]：1）海洋多糖抑制細胞周期及相關(guān)蛋白質(zhì)合成，進而抑制腫瘤細胞增殖[13-15]；2）海洋多糖通過抗細胞氧化、清除自由基作用抑制腫瘤細胞增殖[16]；3）海洋多糖通過抗突變、抗遺傳損傷作用抑制腫瘤細胞增殖[17]；4）海洋多糖通過促進腫瘤細胞凋亡作用抑制腫瘤細胞生長[18-19]；5）海洋多糖對腫瘤細胞的直接殺傷作用[20]。此外，還有部分海洋多糖通過較為特別的作用機制發(fā)揮其抗腫瘤活性，如鯊魚軟骨素可以抑制腫瘤細胞周圍血管的生長，進而達到抗腫瘤的作用[21]。微藻中的半乳聚糖硫酸酯可以通過抑制拓撲異構(gòu)酶l和2的雙重作用阻礙腫瘤細胞的生長等[22]。至于總狀蕨藻粗多糖CRP是通過何種機制抑制腫瘤細胞的生長還需下一步研究進一步探討。

4 結(jié) 論

CRP對3 種腫瘤細胞都有一定的抑制作用，在24～72 h內(nèi)，隨著時間的延長，抑制率逐漸增強，在0.0625～4 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨著質(zhì)量濃度的增加，抑制率逐漸增強，對HeLa、K562和CNE-2z細胞的抑制率最大分別達到61.7%、85.9%和90.3%。

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Antitumor Activity in vitro of a Polysaccharide from Caulerpa racemosa

SHAO Hai-yan, JI Hong-wu*
(Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Products Processing and Safety, Key Laboratory of Advanced Processing of Aquatic Products of Guangdong Higher Educat ion Institution, College of Food Science and Technology, Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524088, China)

A crude polysaccharide fraction from Caulerpa racemosa (CRP) was obtained through hot water extraction coupled with enzymatic proteolysis, deproteinization by Sevag method and dialysis. Ultraviolet spectroscopy showed CRP to contain a little amount of protein. Infrared spectroscopy revealed that CRP had characteristic polysaccharide absorption peaks and was an acidic polysaccharide containing sulfate groups. The polysaccharide exhibited an antitumor activity against HeLa, K562 and CNE-2z cells, with maximum inhibitory rates of 61.7%, 85.9% and 90.3%, respectively, as determined by MTT assay. This antitumor effect was positively dependent on both exposure time in the range of 24 to 72 h and concentration in the range of 0.062 5 to 4 mg/mL.

Caulerpa racemosa; polysaccharide; antitumor activity in vitro

R73-36

A

1002-6630（2014）11-0251-04

10.7506/spkx1002-6630-201411050

2013-06-17

廣東省自然科學(xué)基金項目（039213）；廣東省科技計劃項目（2006B20401018）

邵海艷（1976—），女，講師，碩士，主要從事南海低值水產(chǎn)資源化學(xué)成分及其高值化應(yīng)用研究。E-mail：shaohaiyan76103@163.com

*通信作者：吉宏武（1962—），男，教授，博士，主要從事南海低值水產(chǎn)資源化學(xué)成分及其高值化應(yīng)用研究。E-mail：jihw62318@163.com