姚紅娟，唐浩國(guó)*，郭介之，張艷梅

（河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 471023）

蘋果黃酮的分離純化及抗油脂氧化研究

姚紅娟，唐浩國(guó)*，郭介之，張艷梅

（河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 471023）

采用葡聚糖凝膠Sephadex LH-20柱對(duì)大孔樹脂分離后的黃酮進(jìn)行純化，不同體積分?jǐn)?shù)的甲醇溶液進(jìn)行洗脫，洗脫流速為0.8 mL/min，得到兩種化合物單體A和B。高效液相色譜法檢測(cè)（流動(dòng)相甲醇和水，DAD檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)280、358 nm），化合物A為綠原酸，B是黃酮類物質(zhì)，通過顏色反應(yīng)和紫外光譜進(jìn)行初步結(jié)構(gòu)鑒定，B為黃酮醇類物質(zhì)，在7位和4’ 位有鄰二酚結(jié)構(gòu)。以過氧化值為指標(biāo)，采用烘箱法對(duì)比化合物B、蘆丁、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（2,6-di-tert-butyl-4-methylphenol，BHT）的抗油脂氧化的能力，3 種物質(zhì)對(duì)芝麻油的自動(dòng)氧化影響不大，BHT與化合物B可以阻止豬油氧化酸敗，抗氧化效果BHT＞化合物B＞蘆丁。

蘋果；黃酮；分離；純化；油脂抗氧化

2010年中國(guó)蘋果年產(chǎn)量3326.52萬t，占世界總產(chǎn)量47.8%（聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織數(shù)據(jù)），且以每?jī)赡?00萬t的速度持續(xù)增加[1]，己基本滿足我國(guó)國(guó)民對(duì)蘋果鮮果的消費(fèi)需求[2]，蘋果市場(chǎng)依然停留在鮮果及初加工階段，為提高蘋果產(chǎn)業(yè)價(jià)值，必須在深加工領(lǐng)域?qū)で笸黄啤?/p>

蘋果中含有豐富的類黃酮物質(zhì)[3]對(duì)蘋果總抗氧化能力（total anti-oxidant capacity，TAC）的貢獻(xiàn)率可達(dá)45%～48%[4]。研究表明類黃酮可作為超氧陰離子自由基和羥自由基的清除劑在起始階段抑制脂質(zhì)過氧化[5]，有很強(qiáng)的抗活性氧自由基功能，同時(shí)對(duì)動(dòng)物的脂質(zhì)代謝有調(diào)節(jié)作用，可降血脂，降血壓，保護(hù)心腦血管，抗癌抗突變[6]，具有很強(qiáng)的保健功能。

本實(shí)驗(yàn)將提取蘋果中的黃酮進(jìn)行抗油脂氧化方面的研究，與傳統(tǒng)的有安全隱患的油脂抗氧化劑BHT[7-8]及黃酮代表物質(zhì)蘆丁抗油脂氧化能力做比較，為找到新型抗油脂氧化劑及提高蘋果附加價(jià)值提供可實(shí)際運(yùn)用的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

市售新鮮靈寶紅富士，洗凈，均勻切成5mm薄片，去核，在沸水中加熱10 s，以破壞多酚氧化酶，防止褐變；將蘋果片表面的水分用濾紙吸干，放入打漿機(jī)中打漿，用75%乙醇溶液在80 ℃條件下浸提兩次[9]，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，醇沉，取上清液，干燥得醇提物，過AB-8大孔樹脂[10]，得黃酮粗產(chǎn)物，干燥后在冰箱中冷藏備用；市售肥豬肉煉制的豬板油，市售石磨香油。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 上海晶純生化科技股份有限公司；2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（2,6-di-tert-butyl-4-methylphenol，BHT）標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)Sigma公司；二氫查爾酮標(biāo)準(zhǔn)品 上海晶純生化科技股份有限公司；Sephadex LH-20 鄭州勤實(shí)科技有限公司；高效液相色譜所用甲醇為色譜級(jí) 成都市科龍化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1260型高效液相色譜儀（Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）） 美國(guó)安捷倫公司；722S紫外分光光度計(jì) 上海精密儀器儀表有限公司；UV-2800型紫外-可見分光光度計(jì) 尤尼柯（上海）儀器有限公司；玻璃中壓分離凝膠層析柱（16 mm×300 mm）、蘭格蠕動(dòng)泵 保定蘭格恒流泵有限公司；BS-100自動(dòng)部分收集器 上海精科實(shí)業(yè)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蘋果黃酮的純化

1.3.1.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用鋁鹽絡(luò)合顯色法，通過文獻(xiàn)[11]方法操作，得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程：y=1.196x+0.005 98，式中：x為蘆丁質(zhì)量濃度/（mg/mL），y為吸光度A510nm，線性范圍為0～0.5 mg/mL，相關(guān)系數(shù)R2=0.999。

1.3.1.2 利用Sephadex LH-20純化分離蘋果黃酮

過葡聚凝膠柱的甲醇、水均要求通過0.45 μm的微孔濾膜過濾，上樣液過0.22 μm有機(jī)濾膜。

1）Sephadex LH-20的預(yù)處理

取23g干燥的Sephadex LH-20，用150 mL甲醇充分溶脹，濕法裝柱（中壓分離凝膠層析柱16 mm×300 mm），為防止溶解熱效應(yīng)，使葡聚糖凝膠柱產(chǎn)生氣泡，采用甲醇體積分?jǐn)?shù)逐漸降低的方式進(jìn)行柱平衡，最終達(dá)到20%甲醇平衡。

2）黃酮的分離純化

取151.2 mg粗黃酮，硝酸鋁法檢測(cè)黃酮純度[12]為93.29%，用20 mL甲醇溶解，過0.22 μm有機(jī)濾膜，取1 mL濾液注射到層析柱中，以0.8 mL/min的流速進(jìn)行梯度洗脫，用體積分?jǐn)?shù)為20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的甲醇溶液分別洗脫60 min，然后用純甲醇洗脫至高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）檢測(cè)為直線時(shí)停止，自動(dòng)部分收集器以每管10min的頻率收集。

3）繪制Sephadex LH-20動(dòng)態(tài)洗脫曲線

每管均用NaNO2→Al(NO2)3→NaOH法檢測(cè)總黃酮含量，獲得Sephadex LH-20的動(dòng)態(tài)洗脫曲線，根據(jù)其數(shù)據(jù)變化，選擇進(jìn)高效液相的樣品。

4）色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18分析柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）。流動(dòng)相：A為甲醇，B為去離子水，梯度洗脫，起始流動(dòng)相為純水，線性遞增10 min，使甲醇體積分?jǐn)?shù)從0增至100% A，后運(yùn)行5 min，使甲醇體積分?jǐn)?shù)由100%線性遞減至0。流速為1 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量20 μL，檢測(cè)器DAD，檢測(cè)波長(zhǎng)358 nm和280 nm。

5）用高效液相色譜檢測(cè)洗脫產(chǎn)物

根據(jù)洗脫曲線選擇吸光度變化處的洗脫液進(jìn)行HPLC檢測(cè)，觀察各個(gè)洗脫液的HPLC圖譜，若圖譜中有若干個(gè)較大的峰，說明此階段的洗脫液為混合物，各物質(zhì)沒有得到很好的分離；若HPLC圖譜中只有一個(gè)峰，說明所檢測(cè)的洗脫液中只有一種物質(zhì)，得到了單體化合物，可進(jìn)行接下來的結(jié)構(gòu)鑒定。本實(shí)驗(yàn)僅選用單體化合物的HPLC圖譜，化合物分離不成功的洗脫液HPLC圖譜不再展示。

1.3.2 蘋果黃酮的結(jié)構(gòu)鑒定

1.3.2.1 顏色鑒定

取適量的樣品溶液，分別與濃硫酸、醋酸鎂、三氯化鋁、三氯化鐵、鹽酸-鋅粉、氫氧化鈉和硼氫化鈉溶液反應(yīng)，觀察顏色變化，并照射紫外燈，觀察熒光反應(yīng)。

1.3.2.2 紫外光譜掃描

取適量樣液，加入位移劑：甲醇鈉、乙酸鈉、乙酸鈉和硼酸、三氯化鋁和三氯化鋁與鹽酸，在200～450nm區(qū)間進(jìn)行掃描。

1.3.3 蘋果黃酮的抗油脂氧化性實(shí)驗(yàn)

抗油脂氧化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)兩組，一組為動(dòng)物油新煉制豬油，一組為植物油芝麻油。準(zhǔn)確稱取50.0g油脂數(shù)份，置于100mL的燒杯中，分別以油質(zhì)量0.02%的量添加黃酮樣品、蘆丁、BHT，并設(shè)置空白對(duì)照。放置在（60±1）℃烘箱中，每12h振蕩1次，并交換在烘箱中的位置。定期測(cè)定過氧化值（peroxide value，POV），測(cè)定方法采用GB/T 5538—2005/ISO 3960：2001《動(dòng)植物油脂過氧化值測(cè)定》。

2 結(jié)果與分析

2.1 Sephadex LH-20葡聚糖凝膠柱純化

由圖1可知，主要出峰點(diǎn)集中30%甲醇部分（6～13管）和洗脫體積分?jǐn)?shù)從60%變化至100%的部分（27～54管），根據(jù)其吸光度A510nm的變化，選擇第5、8、13、15、17、20、23、29、33、36、39、42、45、49、53、57、61、65、70、72管進(jìn)高效液相，檢測(cè)分離情況。

圖1 Sephadex LH-20的動(dòng)態(tài)洗脫曲線Fig.1 Dynamic elution curves on Sephadex LH-20

2.2 HPLC檢測(cè)結(jié)果

圖2 標(biāo)準(zhǔn)樣品的HPLC色譜Fig.2 HPLC chromatogram of standard samples at 280 and 358 nm

圖2 是蘆丁標(biāo)品和二氫查爾酮標(biāo)品的色譜圖，通過掃描得到蘆丁的最大吸收峰在256 nm和358 nm，二氫查爾酮的最大吸收峰在280 nm，因此選擇280 nm和358 nm為HPLC的檢測(cè)波長(zhǎng)。二氫查爾酮的保留時(shí)間為8.982 min，上樣液的高效液相色譜圖顯示粗黃酮中僅含有微量的二氫查爾酮；蘆丁標(biāo)品的保留時(shí)間是8.335 min，上樣液HPLC色譜圖（圖3）顯示在保留時(shí)間8.333 min處有蘆丁的吸收峰，說明蘋果粗黃酮中含有一定量的蘆丁。

圖3 上樣液在檢測(cè)波長(zhǎng)280nm（a）和358nm（b）的HPLC色譜Fig.3 HPLC chromatogram of flavonoid extract at 280 (a) and 358 nm (b)

圖4 洗脫產(chǎn)物A在檢測(cè)波長(zhǎng)280nm（a）和358nm（b）的HPLC色譜Fig.4 HPLC chromatogram of flavonoid extract A at 280 (a) and 358 nm (b)

根據(jù)Sephadex LH-20的動(dòng)態(tài)洗脫曲線的篩選結(jié)果進(jìn)行HPLC檢測(cè)，成功分離兩種單品，化合物A（保留時(shí)間5.033min，圖4）與化合物B（保留時(shí)間7.890min，圖5）。結(jié)合圖1可知，化合物A主要集中在8～13管，化合物B集中在33～36管。本實(shí)驗(yàn)采用的是甲醇-水體系，進(jìn)行反相洗脫，利用Sephadex LH-20葡聚糖凝膠的反相分配作用[13]，根據(jù)極性大小對(duì)混合物進(jìn)行分離，極性越小洗脫下來的時(shí)間越長(zhǎng)，化合物A在Sephadex LH-20葡聚糖凝膠柱中保留性弱最先被洗脫出來，以此可推測(cè)化合物A的極性更大。

圖5 洗脫產(chǎn)物B在檢測(cè)波長(zhǎng)280nm（a）和358nm（b）的HPLC色譜Fig.5 HPLC chromatogram of extract B at 280 nm (a) and 358nm(b)

圖6 化合物A的紫外光譜Fig.6 UV spectrum of compound A

分析圖6化合物A的紫外光譜圖可知化合物A有兩個(gè)較強(qiáng)吸收峰，其中一個(gè)出現(xiàn)在210～220 nm，一個(gè)出現(xiàn)在330 nm，在250 nm和300 nm有兩個(gè)肩峰，與黃酮的特征吸收峰不符，但與綠原酸[14]紫外光譜圖完全相同，可基本判斷化合物A為綠原酸，屬于酚類物質(zhì)，不屬于黃酮類物質(zhì)，接下來將不在對(duì)化合物A做具體的結(jié)構(gòu)分析與抗氧化實(shí)驗(yàn)。

圖7為化合物B的紫外光譜圖，化合物B的紫外圖譜在250 nm和360 nm處有強(qiáng)吸收峰，是黃酮類化合物圖譜的特點(diǎn)[15]，可以基本判定化合物B為黃酮類化合物。重復(fù)1.3.2.1節(jié)操作，收集33～36 管洗脫液，進(jìn)行HPLC檢測(cè)，減壓濃縮，冷凍干燥，得23.6 mg黃酮類化合物B，利用高效液相面積歸一法測(cè)其純度為88.448%。

圖7 化合物B的紫外光譜Fig.7 UV spectrum of compound B

Sephadex LH-20的動(dòng)態(tài)洗脫曲線顯示在5～15管，用硝酸鋁法檢測(cè)黃酮含量很高，HPLC檢測(cè)結(jié)果卻表明5～15管中含有的主要物質(zhì)不是黃酮而是多酚類物質(zhì)綠原酸。硝酸鋁法檢測(cè)黃酮的原理：在堿性條件下，Al3+與黃酮母核中無取代的鄰二酚羥基發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)。但綠原酸為多酚酸含有鄰二酚羥基，亦可與Al3+形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)；本實(shí)驗(yàn)硝酸鋁法測(cè)黃酮選用的標(biāo)準(zhǔn)品為蘆丁，其相對(duì)分子質(zhì)量為610.52，綠原酸的相對(duì)分子質(zhì)量354.31，即同樣質(zhì)量的兩種物質(zhì)，綠原酸提供鄰二酚羥基的量幾乎是蘆丁的1.72倍，綠原酸對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生大于50%的正性干擾[16]。粗黃酮的檢測(cè)純度高達(dá)93.29%也是由于綠原酸的干擾。在應(yīng)用硝酸鋁法測(cè)黃酮時(shí)必須排除鄰二酚羥基化合物對(duì)結(jié)果的影響。

2.3 化合物B結(jié)構(gòu)鑒定

2.3.1 顏色鑒定

表1 顏色反應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table1 Results of color reaction

由表1可以初步判定化合物B為黃酮醇類化合物[17]。

2.3.2 紫外光譜鑒定

分析表2化合物B加入位移劑的紫外掃描結(jié)果，可知化合物B在甲醇中的紫外光譜吸收峰為351 nm和273 nm，屬于黃酮醇的典型吸收峰；甲醇鈉屬于強(qiáng)堿，可以使黃酮類化合物母核上所有的羥基均離子化，帶Ⅰ紅移51 nm，吸收帶隨時(shí)間延長(zhǎng)沒有發(fā)生變化，應(yīng)有4’-OH或7-OH；乙酸鈉為弱堿性，只有較強(qiáng)的酚羥基會(huì)被離子化[18]，帶Ⅱ紅移5 nm，應(yīng)含有7-OH；乙酸鈉-硼酸使帶Ⅰ紅移10 nm，可推測(cè)B環(huán)上有鄰二酚羥基，帶Ⅱ紅移5 nm，應(yīng)有6,7-2OH或7,8-2OH；氯化鋁可與黃酮母核上的羥基形成不穩(wěn)定的絡(luò)合物，使帶Ⅰ紅移49 nm，加鹽酸后解離，紅移消失，則說明A、B環(huán)上同時(shí)有鄰二酚羥基[19]。綜合以上分析，化合物B為黃酮醇，確定在黃酮母核的3位置上有羥基取代，圍繞4’和7位置有鄰二酚羥基。

表2 化合物B的紫外掃描結(jié)果Table2 UV-Visible spectral data of compound B

2.4 化合物B油脂抗氧化性

在豬油和芝麻油中按油質(zhì)量的0.02%添加各種各種抗氧化劑（蘆丁、BHT、化合物B），混合均勻后按GB/T 5538—2005《動(dòng)植物油脂過氧化值測(cè)定》測(cè)定油脂的過氧化值，空白組、蘆丁組和BHT組設(shè)有3組平行實(shí)驗(yàn)，化合物B由于提取的含量極少，只有一組數(shù)據(jù)，未設(shè)平行組，結(jié)果見圖8。

圖8 不同抗氧化劑對(duì)油脂抗氧化活性的比較Fig.8 Comparison of inhibitory activity of different antioxidants on lipid oxidation

由圖8可知，對(duì)于豬油組，各抗氧化劑表現(xiàn)出不同的抗氧化活性，BHT干擾游離基反應(yīng)，可以有效清除自由基[20]，對(duì)豬油的氧化酸敗有強(qiáng)烈的抑制作用，25d時(shí)過氧化值基本保持不變；黃酮類化合物是作為金屬離子絡(luò)合物來抑制油脂的自動(dòng)氧化，蘆丁不能與金屬離子絡(luò)合，因此并不能抑制豬油的氧化酸敗，在油脂氧化酸敗的誘導(dǎo)期，與空白組差別不大，到傳播期，過氧化值迅速增加，超過空白組；從蘋果中提取的黃酮單體化合物B對(duì)豬油的氧化酸敗有明顯的抑制作用但效果不如BHT，化合物B與油脂中的金屬離子結(jié)合，降低了油脂中過氧化物的產(chǎn)生速率。對(duì)于芝麻油組，抗氧化劑與空白對(duì)照組的POV值差別很小，體現(xiàn)出的抗氧化作用BHT＞化合物B＞蘆丁。在相同的條件下芝麻油的氧化酸敗速率明顯低于豬油油脂，在芝麻油中添加油脂抗氧化劑沒有實(shí)際意義，這應(yīng)與芝麻油中含有較多天然抗氧化劑VE、芝麻酚、芝麻素[21]有關(guān)。

從蘋果中提取的黃酮單體化合物B與蘆丁的抗油脂氧化性有顯著的差異，從結(jié)構(gòu)上分析，兩者在B環(huán)上均有一個(gè)鄰二酚結(jié)構(gòu)，但蘆丁的A環(huán)為間二酚結(jié)構(gòu)，化合物B為鄰二酚結(jié)構(gòu)。在羥基數(shù)相同的情況下，鄰二酚結(jié)構(gòu)的抗氧化能力強(qiáng)于間二酚結(jié)構(gòu)[22]，且A環(huán)鄰二酚羥基結(jié)構(gòu)可以降低C環(huán)對(duì)A環(huán)的鈍化作用，使得化合物B僅就A環(huán)的抗氧化能力高于蘆??；同時(shí)C環(huán)蘆丁的3-OH被蕓香糖取代，黃酮類化合物在阻止油脂自動(dòng)氧化時(shí)，3-OH起決定性作用[23]，可聯(lián)合4位羧基與金屬離子形成穩(wěn)定的螯合物，蘆丁沒有3-OH結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)出較差的抗油脂氧化能力?；衔顱作為黃酮醇類物質(zhì)，3-OH與油脂中的金屬離子形成穩(wěn)定的絡(luò)合物，使金屬離子失去對(duì)油脂氧化的催化作用，但不能消耗自由基，可以延長(zhǎng)油脂自動(dòng)氧化的誘導(dǎo)期，并不能有效抑制油脂氧化。

3 結(jié) 論

粗黃酮提取物中含有一定量的綠原酸，用硝酸鋁法測(cè)其黃酮純度并不準(zhǔn)確，利用Sephadex LH-20可以成功的把綠原酸與蘋果黃酮分離，并得到一個(gè)黃酮單體。利用不同濃度的甲醇溶液進(jìn)行梯度洗脫的方法，不能將提取物中所有的黃酮單體都進(jìn)行分離，如果要得到更多種類的黃酮單體，必須調(diào)整洗脫條件，利用不同的洗脫劑，做進(jìn)一步的探索。

通過6個(gè)黃酮顏色鑒定反應(yīng)，初步確定得到的黃酮單體為黃酮醇，利用5種位移劑對(duì)黃酮單體紫外光譜圖的影響，推測(cè)化合物B為黃酮醇，確定在黃酮母核的3位置上有羥基取代，圍繞4’和7位置有鄰二酚羥基。

從蘋果黃酮中分離得到的單體化合物B抗油脂氧化能力遠(yuǎn)不如BHT，提取成本高，但安全性高，對(duì)人體也有一定的保健功能，在沒有改善提純工藝時(shí)并不適宜作普通油脂的抗氧化劑，可考慮在某些特殊保健品中添加；粗提物中含有較多綠原酸，綠原酸的抗油脂氧化能力強(qiáng)于BHT，可考慮利用蘋果黃酮的粗提物，進(jìn)行油脂天然抗氧化劑的研究。

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Purification and Antioxidant Activities of Flavonoids from Apple

YAO Hong-juan, TANG Hao-guo*, GUO Jie-zhi, ZHANG Yan-mei
(College of Food and Bioengineering, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471023, China)

Two monomer compounds, namely A and B, respectively, were purified on Sephadex LH-20 column by gradient elution with aqueous methanol at a flow rate of 0.8 mL/min from crude flavonoids extracted from apple and chromatographed on a macroporous resin column. High performance liquid chromatograph (HPLC) was employed to identify the monomers with a mobile phase consisting of methanol-water using diode array detector. The detection wavelengths were 280 and 358 nm. The results showed that compound A was chlorogenic acid and compound B was another flavonoid. The structure of compound B was identified by color reaction and UV spectroscopy as a flavonol with 7-bit and 4’o-diphenol structure. Based on peroxide value (POV), the antioxidant capacity of compound B, rutin and BHT were measured by oven-storage method. The effects of these three substances on sesame oil auto-oxidation were not obvious. The oxidative rancidity of lard could be prevented in the presence of either butylated hydroxy toluene or compound B. The decreasing order of the antioxidant capacit y of these three substances was BHT ＞ compound B ＞ rutin.

apple; flavonoids; isolation; purification; inhibition of lipid oxidation

TS201.2

A

1002-6630（2014）11-0083-06

10.7506/spkx1002-6 630-201411017

2013-10-30

姚紅娟（1988—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。E-mail：347513986@qq.com

*通信作者：唐浩國(guó)（1968—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)與營(yíng)養(yǎng)學(xué)、食品生物技術(shù)和天然產(chǎn)物開發(fā)等。E-mail：tanghaoguo@126.com