魏 微，齊丹萍，馬 榮，張 充，呂鳳霞，別小妹，陸兆新，趙海珍*

（南京農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，江蘇 南京 210095）

甘油半乳糖苷的分離純化及鑒定

魏 微，齊丹萍，馬 榮，張 充，呂鳳霞，別小妹，陸兆新，趙海珍*

（南京農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，江蘇 南京 210095）

以半乳糖和甘油為原料，β-半乳糖苷酶為催化劑，制備甘油半乳糖苷。采用活性炭吸附法對其分離純化，采用L9（34）正交試驗對分離純化的工藝條件進行優(yōu)化篩選，進一步用G-15色譜柱純化，以獲得高純度的甘油半乳糖苷。結(jié)果表明：活性炭吸附法分離純化甘油半乳糖苷的最佳工藝條件為反應液稀釋倍數(shù)20、活性炭用量2 g/mL、洗脫劑乙醇體積分數(shù)30%，甘油半乳糖苷的回收率和純度分別為62.53%和48.84%，分別比單因素試驗結(jié)果高4.52%和4.76%；經(jīng)G-15柱色譜進一步純化，甘油半乳糖苷的純度達到97.80%；經(jīng)質(zhì)譜鑒定合成產(chǎn)物為甘油單半乳糖苷。

甘油半乳糖苷；分離純化；正交試驗；活性炭吸附

甘油半乳糖苷是一種天然的糖苷，具有良好的保濕效果，可以提高細胞抗凍或耐熱作用，有研究報道其還具有抗腫瘤活性[1]。以甘油半乳 糖苷為中間體可以合成可生物降解的功能性物質(zhì)甘油糖酯[2]。甘油半乳糖苷及其酯在食品、化妝品、保健品甚至抗腫瘤藥物 中都有令人關(guān)注的用途[3-7]，一些研究還表明甘油糖酯具有抗菌活性[8-9]。最近幾年，有關(guān)半乳糖甘油糖酯的研究報道很多，但其分離提取獲得的樣品非常有限，純度也無法滿足研究需求，因此，人工合成甘油糖酯是必需的。然而，合成甘油糖酯需要以甘油糖苷作為中間體。我們在前期通過半乳糖苷酶催化的甘油與半乳糖的逆向水解合成了甘油半乳糖苷[10]，但在最終的合成反應體系中存在大量的甘油等副產(chǎn)物，如何有效除去這些副產(chǎn)物是獲得高純度甘油糖苷的關(guān)鍵。多元醇糖苷的提純主要有溶劑萃取法、分子蒸餾法、柱層析法和活性炭吸附法[11-13]。溶劑萃取法雖然可以去除其中的甘油，但去除效果比較差，且要用大量的有機溶劑。活性炭吸附法也可以去除產(chǎn)物中的甘油等，但不能實現(xiàn)完全分離。本實驗嘗試以活性炭法純化甘油半乳糖苷，采用正交試驗對其純化工藝進行優(yōu)化，并進一步通過柱層析分離純化，以獲得高純度的甘油半乳糖苷，為甘油半乳糖苷的制備及其酯類物質(zhì)的合成提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

β-半乳糖苷酶（來自Kluyveromyces lactis，20 U/μL酶液）美國Sigma-Aldrich公司；D-半乳糖（純度＞99%）阿拉丁試劑公司；甘油（純度＞99%）、活性炭、乙醇、正丁醇 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

恒溫水浴振蕩搖床 太倉市實驗設備廠；Heidolph旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海滬西分析儀器廠有限公司；收集器上海滬西公司；Ultimate-3000高效液相色譜 美國戴安公司；Shodex KS-801（8.0 mm ×300 mm）色譜柱和Shodex RI-101檢測器 日本Shodex公司。

1.3 方法

1.3.1 甘油半乳糖苷的合成

在50 mL錐形瓶中加入1.8 g半乳糖和4.5 g甘油（二者濃度比為1∶10），加入4 mL含有0.01 mol/L MgCl2的磷酸鹽緩沖液（pH 6.5），密封。將三角瓶放入恒溫搖床中預熱30 min（40 ℃），加入150 μL（3 000 U）半乳糖苷酶，在40 ℃、180 r/min的水浴中反應40 h。反應結(jié)束后，沸水浴3 min使酶失活，反應液過0.22 μm濾膜，濾液進行高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）檢測，外標法計算甘油半乳糖苷的含量。

1.3.2 甘油半乳糖苷的分離純化

1.3.2.1 有機溶劑萃取法[14]

取甘油半乳糖苷反應液10 g，加入15 mL去離子水進行稀釋，然后用飽和NaOH溶液中和至pH值在7～8之間，在甘油半乳糖苷反應液中加入一定比例的正丁醇和環(huán)己烷，混合均勻，靜置分層，取下層液體，旋蒸濃縮，再用1 mL去離子水復溶，經(jīng)過0.22 μm濾膜過濾，進行液相檢測，計算甘油半乳糖苷回收率。

考察不同配比正丁醇、環(huán)己烷、水體混合液（體積比3∶1∶1、2∶2∶1、1∶3∶1）對甘油半乳糖苷回收率的影響。

1.3.2.2 活性炭吸附法

取甘油半乳糖苷反應液于錐形瓶中，加入一定量的去離子水進行稀釋，按一定的比例加入活性炭，密封振蕩30 min后進行真空抽濾，棄去上清液，將吸附樣品的活性炭用一定濃度的乙醇洗脫劑進行洗脫，密封振蕩30 min，再進行真空抽濾，取上清液旋蒸濃縮，后用1 mL去離子水進行復溶，經(jīng)過0.22 μm的濾膜過濾，進行液相檢測，計算甘油半乳糖苷回收率。

活性炭用量為1 g/mL、洗脫劑乙醇體積分數(shù)為50%的條件下，考察不同反應液稀釋倍數(shù)（10、15、20、25、30）對甘油半乳糖苷回收率的影響；洗脫劑乙醇體積分數(shù)為50%、反應液稀釋倍數(shù)為20的條件下，考察活性炭用量（按反應液體積的比例添加，0.5、1.0、1.5、2.0、 2.5 g/mL）對甘油半乳糖苷回收率的影響；反應液稀釋倍數(shù)為20、活性炭用量為1.5 g/mL的條件下，考察洗脫劑乙醇體積分數(shù)（30%、40%、50%、60%、70%）對甘油半乳糖苷回收率的影響。

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，確定L9（34）正交試驗表，以反應液稀釋倍（A）、活性炭用量（B）和洗脫劑乙醇體積分數(shù)（C）作為3 個考察因素，選取3個水平進行試驗。

1.3.3 葡聚糖G-15柱層析分離

將經(jīng)過活性炭吸附法分離純化后的甘油半乳糖苷，采用葡聚糖G-15層析柱（100 cm×1.6 cm）進一步純化，以去離子水作為流動相，流速為0.6 mL/min，每管收集2 mL，上樣量為2 mL，棄去前60 mL后開始收集，共收集60 管。將收集到的樣品合并后用高效液相色譜檢測，并進一步進行質(zhì)譜分析。

1.3.4 液相檢測

HPLC系統(tǒng)（美國Dionex公司）配備RI檢測器，色譜柱為Shodex SUGAR系列KS-801色譜柱（8 mm×300 mm），RI檢測器槽溫保持在35 ℃，以去離子水作為流動相，流速保持在0.75 mL/min，洗脫過程約15 min。

1.3.5 質(zhì)譜分析

質(zhì)譜條件：質(zhì)譜儀器TSQ Quantum Discovery MAX（美國Thermo Finnigan公司）。離子方式為ESI－和ESI＋，毛細管電壓為4.4 kV，錐孔電壓40 V，離子源溫度 100 ℃，脫溶劑氣溫度250 ℃，光電倍增器電壓700 V，氣流量為400 L/h，掃描范圍為100～1 500 m/z。

2 結(jié)果與分析

2.1 有機溶劑萃取法與活性炭吸附法比較

圖1 溶劑萃取法和活性炭吸附法對甘油半乳糖苷分離純化的影響Fig.1 Effects of solvent extraction and activated carbon absorption on the purification of glycerol galactoside

由圖1可知，隨著環(huán)己烷體積比例的減少，正丁醇體積比例的增加，甘油半乳糖苷的回收率逐漸增加，但增加的幅度不顯著，整體的回收率很低，不到15%，萃取效果低可能是因為正丁醇、環(huán)己烷在萃取水中甘油的同時，將部分甘油半乳糖苷也萃取了，所以甘油半乳糖苷的回收率很低。將實驗結(jié)果與盧炳環(huán)[14]的實驗結(jié)果（乙二醇殘留量17.4%）進行對比，發(fā)現(xiàn)其甘油半乳糖苷的純度也不高，其原因可能是甘油的極性比乙二醇強，正丁醇、環(huán)己烷不能將水中的甘油完全萃取出來。

由于活性炭具有成本低、分離效果好、樣品處理量大等特性，也常用于單糖、二糖及多糖的分離純化[15-21]。實驗表明，在活性炭吸附法中，當反應液稀釋倍數(shù)為10，活性炭用量1 g/mL，洗脫劑乙醇體積分數(shù)為50%時，甘油半乳糖苷的回收率為42.58%。而有機溶劑萃取法得到甘油半乳糖苷回收率最高為13.87%，可見活性炭吸附法分離純化甘油半乳糖苷的效果更好，故后續(xù)實驗采用活性炭吸附法分離純化甘油半乳糖苷，并對其工藝進一步優(yōu)化。

2.2 活性炭吸附法優(yōu)化單因素試驗

2.2.1 反應液稀釋倍數(shù)的影響

活性炭吸附是指目標物質(zhì)在活性炭表面吸附或濃縮的過程。依靠分子間和分子內(nèi)鍵與鍵之間作用的范德華力吸附過程稱為物理吸附，吸附質(zhì)在活性炭表面的極化率決定了物理吸附差異性。而樣品濃度會一定程度上影響目標產(chǎn)物與活性炭接觸之間的物理吸附作用[16]。

圖2 反應液稀釋倍數(shù)對甘油半乳糖苷純化的影響Fig.2 Effect of dilution ratio of the reaction product on the purification of glycerol galactoside

由圖2可知，隨著反應液稀釋倍數(shù)的增加，甘油半乳糖苷的回收率先增大后減少，說明稀釋倍數(shù)過高或過低時，甘油半乳糖苷的回收率都會降低，原因是當稀釋倍數(shù)過低時，反應液過于濃稠，活性炭不能充分的吸附甘油半乳糖苷，而且當活性炭吸附達到平衡后，受到活性炭孔徑限制以及目標產(chǎn)物之間的靜電排斥也會造成吸附量降低，造成部分甘油半乳糖苷隨濾液流失；當稀釋倍數(shù)過高時，即體系中存在過多的水，而活性炭為非極性吸附劑，其在水溶液中吸附性最強，因此對甘油半乳糖苷的吸附性強，這使得后續(xù)的乙醇洗脫過程活性炭上的殘留量加大，反而造成產(chǎn)物回收率的降低[17]。當反應液稀釋倍數(shù)為20 時，回收率最高。

2.2.2 活性炭用量的影響

由圖3可知，隨著活性炭用量的增大，甘油半乳糖苷的回收率先升高后降低，說明當活性炭的量過少或過多時，甘油半乳糖苷的回收率都會降低。因為當活性炭的用量過少時，不能將甘油半乳糖苷完全吸附，使得部分甘油半乳糖苷存在于抽濾后的濾液中隨著濾液流失，從而降低了甘油半乳糖苷的回收率；當活性炭的量過多時，活性炭總的表面積增大，而溶液中目標產(chǎn)物的濃度是一定的，達到吸附平衡后，雖然甘油半乳糖苷能夠被完全吸附，但在洗脫時并不是所有的甘油糖苷都能洗脫下來，故而殘留在活性炭中的甘油半乳糖苷量增加，使得甘油半乳糖苷的回收率降低[19]?；钚蕴坑昧繛?.5 g/mL時，回收率達到最大值。

圖3 活性炭用量對甘油半乳糖苷回收率的影響Fig.3 Effect of activated carbon dosage on the purification of glycerol galactoside

2.2.3 洗脫劑乙醇體積分數(shù)對甘油半乳糖苷純化的影響

圖4 洗脫劑乙醇體積分數(shù)對甘油半乳糖苷回收率的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on the purification of glycerol galactoside

由圖4可知，隨著洗脫劑中乙醇體積分數(shù)的增大，甘油半乳糖苷的回收率先升高后降低，說明當洗脫劑中乙醇體積分數(shù)過大或過小時，甘油半乳糖苷的回收率都會降低，其原因可能是活性炭為非極性吸附劑，其在水溶液中的吸附性最強，故水的洗脫效果最弱，而有機溶劑的洗脫效果較好，同時其對大分子甘油半乳糖苷的吸附力大于半乳糖、甘油等小分子。因此，隨著乙醇體積分數(shù)的增加，洗脫效果也提高，但乙醇體積分數(shù)提高的同時，合成過程中產(chǎn)生的少量半乳糖基甘油二糖、甘油三糖以及低聚糖等雜質(zhì)被洗脫下來的量也增加，導致目標產(chǎn)物的洗脫效果（純度）降低[15]。當乙醇體積分數(shù)為50%時，甘油半乳糖苷的回收率達到最大值。

2.3 活性炭吸附法分離純化甘油半乳糖苷工藝條件的優(yōu)化

在單因素試驗的基礎上，采用L9（34）正交表進行正交優(yōu)化試驗，試驗設計及結(jié)果分析見表1。

表1 L9（334）正交試驗設計和結(jié)果Table1 Design and results of L9((334) orthogonal arrraayy

表2 正交試驗結(jié)果方差分析Table2 ANOVA analysis

因素極差越大，說明因素的水平改變對試驗結(jié)果影響也越大，該試驗中影響因素主次順序為：A＞B＞C。由表2可知，在95%置信水平下，反應液稀釋倍數(shù)和活性炭用量具有顯著性，與直觀分析的結(jié)果具有一致性。根據(jù)極差分析結(jié)果，理論上的最佳工藝組合為A2B3C3，即反應液稀釋倍數(shù)為20、活性炭用量2 g/mL、洗脫劑乙醇體積分數(shù)70%。

根據(jù)正交試驗結(jié)果，最佳工藝組合為A2B3C1，即反應液稀釋倍數(shù)為20、活性炭用量2 g/mL、洗脫劑乙醇體積分數(shù)30%。根據(jù)單因素試驗結(jié)果，推測出甘油半乳糖苷最佳分離純化工藝條件是：A2B2C2，即反應液稀釋倍數(shù)為20、活性炭用量為1.5 g/mL、洗脫劑乙醇體積分數(shù)為50%。

表3 最佳工藝組合驗證結(jié)果Table3 Verification of three optimal conditions for the purification of glycerol galactoside

對上述3 個工藝組合進行驗證，結(jié)果見表3。A2B3C3工藝組合中甘油半乳糖苷的回收率最高（64.79%），而A2B3C1工藝組合中甘油半乳糖苷的純度最高（48.84%），綜合考慮甘油半乳糖苷的回收率和純度，選擇A2B3C1為最佳工藝條件，即稀釋倍數(shù)為20、活性炭用量為2 g/mL、洗脫劑乙醇體積分數(shù)為30%。在此條件下，甘油半乳糖苷回收率和純度分別為62.53%和48.84%，比單因素試驗結(jié)果分別高4.52%和4.76%。

2.4 甘油半乳糖苷葡聚糖凝膠G-15柱層析純化

圖5 甘油半乳糖苷葡聚糖凝膠G-15層析圖Fig.5 G-15 chromatogram of glycerol galactoside

由圖5可知，甘油半乳糖苷主要集中在第10～40管，即洗脫體積為19～80 mL，第40管以后無甘油半乳糖苷，主要為甘油和半乳糖，合并10～40 管的收集物，經(jīng)HPLC檢測（圖6），產(chǎn)物的純度為97.80%。

圖6 純化甘油半乳糖苷HPLC圖譜Fig.6 HPLC chromatogram of purified glycerol galactoside

2.5 質(zhì)譜確認純化后的產(chǎn)物

圖7 甘油半乳糖苷質(zhì)譜圖Fig.7 Mass spectrum of glycerol galactoside

將G-15柱分離后的產(chǎn)物用質(zhì)譜儀進行鑒定，分析結(jié)果如圖7所示。255：[M＋H]＋；277： [M＋Na]＋；293：[M＋K]＋；163：[半乳糖基碎片＋H]＋。由此可以推斷出甘油半乳糖苷的相對分子質(zhì)量是254，表明產(chǎn)物為甘油單半乳糖苷[22]。

3 結(jié) 論

活性炭吸附法分離純化甘油半乳糖苷的效果優(yōu)于溶劑萃取法。正交試驗結(jié)果表明，各因素對甘油半乳糖苷回收率影響的作用大小順序為：反應液稀釋倍數(shù)＞活性炭用量＞洗脫劑乙醇體積分數(shù)。分離純化的最佳工藝參數(shù)為：反應液稀釋倍數(shù)20、活性炭用量2 g/mL、洗脫劑乙醇體積分數(shù)為30%，在此工藝條件下，甘油半乳糖苷回收率和純度分別為62.53%和48.84%，比單因素結(jié)果分別高4.52%和4.76%。經(jīng)活性炭純化的甘油半乳糖苷經(jīng)葡聚糖凝膠G-15柱層析進一步純化，其純度可達97.80%。產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)譜鑒定為甘油單半乳糖苷。

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Separation, Purification and Characterization of Synthetic Glycerol Galactoside

WEI Wei, QI Dan-ping, MA Rong, ZHANG Chong, Lü Feng-xia, BIE Xiao-mei, LU Zhao-xin, ZHAO Hai-zhen*
(College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

Glycerol galactoside was synthesized from glycerol and galactose under the catalysis of β-galactosidase. Activated carbon adsorption method was used to separate and purify the product. An L9(34) orthogonal design based on singlefactor experiments were employed to optimize the purification process. The obtained pr oduct was further purified by G-15 chromatography column. The optimized purification conditions were established as follows: 20-fold dilution of the reaction product, activate carbon addition at a ratio of 2 g/mL and desorption with 30% ethanol. Under these conditions, the recovery rate and purity of glycerol galactoside were 62.53% and 48.84%, respectively, which showed an increase of 4.52% and 4.76%, respectively, over those obtained from single-factor experiments. The glycerol galactoside obtained from activated carbon adsorption was further purified through Sephadex G-15 chromatography column, and its purity was increased to 97.80%. The product was identified as glycerol monogalactoside by mass spectrometry (MS).

glycerol galactoside; separation and purification; orthogonal array experiments; activated carbon absorption

TS202

A

1002-6630（2014）11-0001-05

10.7506/spkx1002-6630-201411001

2013-07-22

國家自然科學基金青年科學基金項目（31301558）；中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項資金項目（KJQN201427）；江蘇省自然科學基金項目（BK2010456）

魏微（1989—），女，碩士研究生，研究方向為食品生物技術(shù)。E-mail：2011108055@njau.edu.cn

*通信作者：趙海珍（1975—），女，副教授，博士，研究方向為食品生物技術(shù)。E-mail：zhaohz@njau.edu.cn