林 凱，辛嘉英,2,*，王 艷，陳林林

（1.哈爾濱商業(yè)大學(xué) 黑龍江省高校食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150076；2.中國(guó)科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所 羰基合成與選擇氧化國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 甘肅 蘭州 730000）

非水相酶法催化長(zhǎng)鏈脂肪酸淀粉酯反應(yīng)研究進(jìn)展

林 凱1，辛嘉英1,2,*，王 艷1，陳林林1

（1.哈爾濱商業(yè)大學(xué) 黑龍江省高校食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150076；2.中國(guó)科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所 羰基合成與選擇氧化國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 甘肅 蘭州 730000）

長(zhǎng)鏈脂肪酸淀粉酯作為改性淀粉的一種重要類型具有廣泛的應(yīng)用前景。酶作為生物催化劑在非水相中可對(duì)淀粉和長(zhǎng)鏈脂肪酸進(jìn)行酯化，該反應(yīng)具有底物選擇性高、產(chǎn)物專一性強(qiáng)、條件溫和、產(chǎn)物可生物降解等優(yōu)點(diǎn)。本文從酶催化合成反應(yīng)的機(jī)理、酶法催化長(zhǎng)鏈脂肪酸淀粉酯的制備方法、取代度的測(cè)定方面進(jìn)行綜述。

長(zhǎng)鏈脂肪酸淀粉酯；酶催化反應(yīng)；非水相；取代度

淀粉是一種大量存在的、廉價(jià)的、可再生的并且能夠被生物完全降解的天然多聚糖[1]。由于天然淀粉的結(jié)構(gòu)導(dǎo)致其反應(yīng)活力和反應(yīng)效率偏低，所以需要通過物理或者化學(xué)等方法對(duì)天然淀粉進(jìn)行改性，以滿足特定的需求[2]。長(zhǎng)鏈脂肪酸淀粉酯作為改性淀粉的一種重要類型已廣泛用于塑料工業(yè)、食品工業(yè)和生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域 。由于淀粉中引入了長(zhǎng)鏈脂肪酸，使其具有不同于天然淀粉的特殊的熱塑性、乳化性、疏水性和抗拉伸等特性。但是通過物理或化學(xué)方法制備長(zhǎng)鏈脂肪酸淀粉酯的過程中，通常伴有副產(chǎn)物的產(chǎn)生，并且反應(yīng)條件苛刻。因此越來越多的研究者對(duì)非水相酶法催化長(zhǎng)鏈脂肪酸淀粉酯的合成進(jìn)行了研究。相比物理化學(xué)方法，非水相酶法催化對(duì)底物的選擇性強(qiáng)[3]、反應(yīng)條件溫和[4]，并且抑制了依賴于水的副反應(yīng)的發(fā)生[5]。鑒于研究的不斷深入，本文就非水相酶法催化長(zhǎng)鏈脂肪酸淀粉酯的合成機(jī)理、方法以及取代度的測(cè)定進(jìn)行系統(tǒng)的分析和綜述。

1 非水相酶法催化合成的反應(yīng)機(jī)理及其影響因素

用于脂肪酸淀粉酯合成的酶主要為脂肪酶，來自于南極假絲酵母（Candida antarctica）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、黑曲霉（Aspergillus niger）等[6]。在非水相中進(jìn)行的酶促反應(yīng)，酯水解反應(yīng)向著酯合成反應(yīng)方向進(jìn)行，從而使酶法催化合成長(zhǎng)鏈脂肪酸淀粉酯成為可能[7]。脂肪酶多用于長(zhǎng)鏈脂肪酸淀粉酯的合成，其反應(yīng)機(jī)理為：酶的活性中心含有親核基團(tuán)（如絲氨酸的羥基、半胱氨酸的巰基、組氨酸的咪唑基），這些基團(tuán)都有共用的電子對(duì)作為電子的供體，與脂肪酸中羧基的碳原子即親電子基團(tuán)以共價(jià)鍵的方式結(jié)合，形成酰化酶中間產(chǎn)物，接著?；鶑闹虚g產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到另一?；荏w淀粉分子中，形成脂肪酸淀粉酯。反應(yīng)歷程如下：

式中：X為RCOO、OR、Cl、OH。

在非水相中，酶的催化活性受到很多因素的影響，包括有機(jī)溶劑、反應(yīng)體系中水含量、利用酶的方式等[8]。在水相體系中，酶表面極性帶電荷的氨基酸側(cè)鏈能與水分子相互作用，使酶分子有較大的催化表面積，而在疏水性有機(jī)溶液中，這些氨基酸側(cè)鏈會(huì)轉(zhuǎn)向酶分子內(nèi)部，在酶分子表面高度包裹，減少酶分子的可溶表面積，降低酶催化的柔韌性，從而抑制了酶的催化活性[9]。在非水相酶催化反應(yīng)中水含量也是影響酶催化活性的重要因素，正是由于在微觀上酶分子表面這層微觀水的存在，才使得宏觀上非水相體系中酶具有催化活性。水分子的存在可以通過氫鍵、疏水鍵等作用力維持酶分子的催化構(gòu)象[10]。對(duì)于親水性的有機(jī)溶劑，會(huì)吸附酶分子表面的必須水，使得酶分子變?yōu)閯傂誀顟B(tài)，失去酶催化構(gòu)象的柔韌性[11]。因此反應(yīng)體系中適當(dāng)?shù)乃渴潜仨毜摹Ｍ瑫r(shí)，酶的利用形式也會(huì)影響其催化活性及耐受性。酶在非水相中的利用方式主要有3種方式：酶的化學(xué)修飾、酶的固定化以及酶的定點(diǎn)突變。酶的化學(xué)修飾是 利用戊二醛或聚乙二醇與酶進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)，得到交聯(lián)酶晶體，提高酶分子在有機(jī)相中的溶解性和穩(wěn)定性，同時(shí)能提高反應(yīng)活性[12]；酶的固定化是用載體將酶固定在特定的區(qū)域，使得酶仍具有催化活性，并且可以重復(fù)利用。研究發(fā)現(xiàn)，除了具有普通酶的性質(zhì)外，酶的固定化使其在有機(jī)溶劑中的穩(wěn)定性提高[13]；酶的定點(diǎn)突變是用分子生物學(xué)的方法定向改造酶分子的結(jié)構(gòu)，并通過高通量篩選出有機(jī)溶劑耐受性酶，提高酶在非水溶劑中活性和催化能力[14]。

2 非水相酶法催化長(zhǎng)鏈脂肪酸淀粉酯的合成方法

脂肪酶催化長(zhǎng)鏈脂肪酸與淀粉發(fā)生酯化是一個(gè)復(fù)雜的反應(yīng)體系，該反應(yīng)體系應(yīng)考慮長(zhǎng)鏈脂肪酸的疏水性、淀粉的親水性、酶在反應(yīng)體系中的催化活性這三方面因素。長(zhǎng)鏈脂肪酸、淀粉和脂肪酶在反應(yīng)體系中的狀態(tài)決定了酯化反應(yīng)能否發(fā)生。下面將以不同體系下非水相酶法催化長(zhǎng)鏈脂肪酸淀粉酯的合成分別加以論述。

2.1 無溶劑體系

若脂肪酸在室溫或在低溫加熱狀態(tài)下為液體，以脂肪酸為溶劑體系，脂肪酶可直接催化酯化反應(yīng)的發(fā)生。由于底物濃度高，該方法提高了反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率。Horchania等[15]以CaCO3為載體對(duì)Staphylococcus aureus脂肪酶（SAL3）進(jìn)行固定化，以微波加熱的方式，通過液態(tài)酯化的方式合成油酸淀粉酯，并通過響應(yīng)面法對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化。在淀粉/油酸質(zhì)量比為0.18，固定化脂肪酶單位為386 U條件下，44℃反應(yīng)4 h，制得取代度為2.86的油酸淀粉酯。經(jīng)α-淀粉水解酶實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，通過疏水化修飾后，油酸淀粉酯降解性降低。因?yàn)榈矸垲w粒由結(jié)晶區(qū)和無定形區(qū)組成，結(jié)晶區(qū)結(jié)構(gòu)致密，限制酶分子向淀粉內(nèi)部的滲透，導(dǎo)致其取代度和反應(yīng)效率降低。因此可以使用物理、化學(xué)和生物降解的方法對(duì)淀粉進(jìn)行預(yù)處理，破壞淀粉的結(jié)晶結(jié)構(gòu)，從而提高反應(yīng)效率[2]。Xin Jiaying等[16]用NaOH/尿素對(duì)玉米淀粉進(jìn)行預(yù)處理，通過電鏡分析，與原淀粉相比，處理后的淀粉顆粒體積更小，表面粗糙并且疏松多孔。通過紅外光譜進(jìn)一步分析，原淀粉經(jīng)預(yù)處理后，在1 661～1 623 cm-1之間出現(xiàn)C＝O的特征吸收峰，這是由于淀粉分子鏈的斷 裂從而導(dǎo)致羰基增多。同時(shí)在992 cm-1附近，D-吡喃葡萄糖環(huán)中C－O－C基團(tuán)上的C－O伸縮振動(dòng)峰發(fā)生紅移，這將會(huì)減輕淀粉分子間氫鍵的相互作用，使得淀粉鏈節(jié)發(fā)生斷裂[17]。淀粉分子結(jié)構(gòu)的變化使得酶分子與酯化劑更容易接近淀粉分子，從而提高催化效率。實(shí)驗(yàn)證明，在無溶劑體系下，以固定化脂肪酶Novozym 435為催化劑，以棕櫚酸和預(yù)處理淀粉為原料，合成了棕櫚酸玉米淀粉酯，通過氣相色譜（gas chromatography，GC）法測(cè)定其取代度為1.04。王艷等[18]也用NaOH/尿素對(duì)玉米淀粉進(jìn)行預(yù)處理，在無溶劑體系下制得了取代度為0.201的油酸淀粉酯。但采用無溶劑體系催化反應(yīng)合成時(shí)應(yīng)該考慮各反應(yīng)底物的含水量，防止該反應(yīng)體系向水解反應(yīng)方向進(jìn)行。同時(shí)淀粉不易溶于非極性溶劑，所以淀粉在該反應(yīng)體系中的擴(kuò)散及溶解程度也是影響催化效率的重要因素。由于無溶劑體系法沒有添加任何有機(jī)溶劑，反應(yīng)制得的產(chǎn)品可直接用于食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域。

2.2 反膠束體系

反膠束體系是表面活性劑溶解于非極性溶液中，形成非極性環(huán)境圍繞極性核的反應(yīng)體系，即油包水型（W/O）微乳液[5]。該方法是在脂肪酶表面吸附少量的表面活性劑，表面活性劑的用量不應(yīng)將酶的表面全部覆蓋，形成脂肪酶-表面活性劑離子對(duì)，增加了脂肪酶在以 有機(jī)溶劑為反應(yīng)體系中的溶解性，形成反膠束，催化酯化反應(yīng)的發(fā)生。Bruno等[19]在以異戊烷為有機(jī)溶劑的反應(yīng)體系中，加入通過相轉(zhuǎn)移法制成的枯草蛋白酶-2-乙基己基琥珀酸酯磺酸鈉（bis（2-ethylhexyl）sulfosuccinate sodium salt，AOT）離子對(duì)，催化葵酸乙酯與淀粉的轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)。通過熱重量分析法測(cè)定，制得的葵酸淀粉酯的取代度為0.15～0.32。通過光電子能譜發(fā)現(xiàn)，酯化反應(yīng)優(yōu)先發(fā)生在淀粉顆粒的表面。研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，使用未經(jīng)預(yù)處理的酶直接加入到該反應(yīng)體系時(shí)，并沒有發(fā)生酯化反應(yīng)。Alissandrato等[20]利用脂肪酶-表面活性劑離子對(duì)在異戊烷有機(jī)相中，催化合成了末端帶有三鍵的己炔酸淀粉酯，并且通過末端的三鍵與帶有熒光的疊氮化物進(jìn)行環(huán)加成反應(yīng)，生成具有熒光性的淀粉酯。通過熒光顯微鏡觀察到該熒光物質(zhì)，進(jìn)一步證明了己炔酸淀粉酯的生成。Chakraborty等[21]將淀粉制成平均粒徑在40 μm的納米淀粉顆粒，并與?；w形成AOT-微乳液，以固定化脂肪酶Novozym 435為催化劑，在40℃條件下反應(yīng)48 h，制得取代度為0.8的硬脂酸淀粉酯。通過同位素比質(zhì)譜儀發(fā)現(xiàn)，盡管固定化脂肪酶存在于大孔樹脂的內(nèi)部，但是納米淀粉顆粒還是與脂肪酶發(fā)生接觸，并成功催化了反應(yīng)的發(fā)生。

2.3 有機(jī)溶劑體系

淀粉不溶于絕大多數(shù)的液體，但是可溶于二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、N,N-二甲基乙酰胺（N,N-dimethylacetamide，DMAc）和吡啶等強(qiáng)極性有機(jī)溶劑中。與淀粉的糊化作用不同，淀粉顆粒在DMSO中并未發(fā)生膨脹。淀粉鏈節(jié)的斷裂主要是由于DMSO是一種極強(qiáng)的氫鍵受體，能使淀粉分子內(nèi)部的氫鍵發(fā)生斷裂。但DMSO也會(huì)對(duì)酶分子的天然構(gòu)象產(chǎn)生不利影響，使得酶分子內(nèi)部的氫鍵發(fā)生斷裂，破壞其二級(jí)結(jié)構(gòu)，使酶分子失去催化活性。同時(shí)，DMSO也有較強(qiáng)的吸濕性，在反應(yīng)過程中應(yīng)控制體系中適當(dāng)?shù)乃疃?，維持酶分子具有催化活性所必需的構(gòu)象。在極性溶劑中可對(duì)酶進(jìn)行修飾，提高酶催化的穩(wěn)定性[22]。Ge Jun等[23]認(rèn)為在催化反應(yīng)的過程中酶分子應(yīng)受到保護(hù)。他們將脂肪酶包裹在聚丙烯酰胺納米凝膠中。通過分子仿真技術(shù)和結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)：在DMSO溶劑中，聚丙烯酰胺納米凝膠有效地防止了酶分子中必需水的滲出，保持了酶分子的天然構(gòu)象。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步通過電子熒光顯微鏡證實(shí)，脂肪酶-納米凝膠在DMSO中也具有良好的分散性。Rajan等[24]在DMSO/DMF有機(jī)溶劑的反應(yīng)體系中，70℃反應(yīng)4 h，以脂肪酶為催化劑催化了木薯淀粉 和棕櫚酸的合成反應(yīng)，通過皂化法測(cè)得取代度為1.05，并根據(jù)紅外光譜的測(cè)定證實(shí)了酯化反應(yīng)的發(fā)生。通過熱接重量實(shí)驗(yàn)分析和黏度的測(cè)定，隨著長(zhǎng)鏈棕櫚酸的引入，熱穩(wěn)定性和黏度與原淀粉相比增大。同時(shí)棕櫚酸的引入使得棕櫚酸淀粉酯具有熱塑性，可以廣泛地應(yīng)用于塑料工業(yè)。

2.4 離子液體系

與DMSO相似，離子液作為一種有機(jī)溶劑的替代品應(yīng)用廣泛。離子液在室溫下呈現(xiàn)液態(tài)的熔鹽，蒸汽壓低，不易揮發(fā)。在催化多糖類物質(zhì)如淀粉的酯化方面表現(xiàn)較高的活性[25]。Liu Qingbin等[26]研究發(fā)現(xiàn)：脂肪酶在離子液中可保持催化活力，可以催化酯化反應(yīng)的發(fā)生，但是淀粉僅微溶于離子液，在實(shí)驗(yàn)中并沒有發(fā)生預(yù)想的反應(yīng)。同時(shí)由于離子液在室溫下呈現(xiàn)液態(tài)的熔融鹽，揮發(fā)性低，不利于產(chǎn)物的分離。為了克服離子液的這些缺點(diǎn)，Lee等[27]研究了含有氯離子的離子混合液，由于這種離子混合液有極強(qiáng)的親水性，淀粉的溶解性增強(qiáng)，卻抑制了酶的催化活性。因此使用新型離子液時(shí)應(yīng)考慮到淀粉的溶解性和酶的催化活力兩方面因素。離子液作為溶劑體系還有待于進(jìn)一步研究。

3 取代度的測(cè)定

長(zhǎng)鏈脂肪酸淀粉酯的理化性質(zhì)取決于取代度、脂肪鏈飽和度與碳鏈長(zhǎng)度及直鏈/支鏈淀粉酯的含量等。其中取代度的大小是長(zhǎng)鏈脂肪酸淀粉酯的理化性質(zhì)的主要因素。傳統(tǒng)測(cè)定取代度的方法是皂化-反滴定法，這種方法首先是由Genung等[28]提出的，滴定法的基本原理是：當(dāng)酯化改性淀粉在一定量的熱氫氧化鈉溶液中發(fā)生皂化反應(yīng)時(shí)，酯鍵發(fā)生斷裂生成游離的?；?，游離的酰基與鈉離子形成?；c。當(dāng)用標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液對(duì)皂化反應(yīng)物進(jìn)行反滴定時(shí)，通過計(jì)算皂化反應(yīng)消耗的氫氧化鈉的量推導(dǎo)出發(fā)生酯化反應(yīng)的酰基的量?，F(xiàn)在這種方法仍被廣泛的應(yīng)用[29-33]。

隨著現(xiàn)代儀器分析的發(fā)展，測(cè)定取代度準(zhǔn)確度也進(jìn)一步提升。目前，測(cè)定取代度的方法有氣相色譜法、核磁共振法和元素分析法。Alissandratos等[34]先將制得的脂肪酸淀粉酯溶于DMSO，然后加入甲醇鈉-甲醇溶液，冷凝回流，通過轉(zhuǎn)酯反應(yīng)生成脂肪酸甲酯，然后加入內(nèi)標(biāo)物，進(jìn)行GC分析。研究發(fā)現(xiàn)，通過重復(fù)實(shí)驗(yàn)，這種方法實(shí)驗(yàn)偏差低于3%，其中測(cè)定的一種脂肪酸淀粉酯的取代度可達(dá)到0.004 2±0.000 1。相比于傳統(tǒng)方法，GC法提供了一種重現(xiàn)性更好、準(zhǔn)確度更高、分析速度更快的方法。同時(shí)研究者還發(fā)現(xiàn)，這種方法更適合測(cè)定中長(zhǎng)鏈的脂肪酸淀粉酯。核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）法是通過測(cè)定脂肪鏈中－CH3上H和葡萄糖上質(zhì)子H在1H NMR圖譜上峰面積的特定比值從而確定脂肪酸淀粉酯的取代度。Elomaa等[35]在用NMR法測(cè)定時(shí)發(fā)現(xiàn)，這種方法適用于取代度大于2的脂肪酸淀粉酯的測(cè)定。Forrest等[36]利用傅氏轉(zhuǎn)換紅外線光譜分析儀（fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）測(cè)定了羥丙基淀粉的取代度，研究發(fā)現(xiàn)采用紅外光譜法測(cè)定取代度，樣品可以直接測(cè)定，提高準(zhǔn)確度，同時(shí)該方法對(duì)其他多糖類物質(zhì)的測(cè)定也適用。

4 展 望

近年來，長(zhǎng)鏈脂肪酸淀粉酯作為脂肪替代品、緩釋藥物載體和具有良好熱塑性的生物降解材料在各領(lǐng)域已有廣泛應(yīng)用。隨著研究的不斷深入，權(quán)衡淀粉、酶和長(zhǎng)鏈脂肪酸這三者的關(guān)系，找到一個(gè)適合的反應(yīng)條件，以及提高酶法催化長(zhǎng)鏈脂肪酸淀粉酯取代度問題都將成為未來的研究熱點(diǎn)，并且隨著可利用的酶的種類增多，會(huì)使酶法催化長(zhǎng)鏈脂肪酸淀粉酯有更廣闊的發(fā)展空間。

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Recent Progress in Lipase-Catalyzed Synthesis of Long-Chain Fatty Acid Starch Esters in Non-Aqueous Phase

LIN Kai1, XIN Jia-ying1,2,*, WANG Yan1, CHEN Lin-lin1
(1. Key Laboratory of Food Science and Engineering, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China; 2. State Key Laboratory of Oxo Synthesis and Selective Oxidation, Lanzhou Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Sciences, Lanzhou 730000, China)

Long-chain fatty acid starch esters, an important kind of modified starch products, have attractive application prospects. It is well known that the application of non-aqueous enzymatic catalysis in esterification of starch with long-chain fatty acids has the advantages of higher substrate selectivity, suppression of unwanted water-dependent side reactions, mild reaction conditions and biodegradability. In this review, the reaction mechanism and the currently available methods for lipase-catalyzed synthesis of starch esters with long-chain fatty acids in non-aqueous phase and the recent progress in the determination of degree of substitution are discussed.

long-chain fatty acid starch esters; enzymatic catalysis; non-aqueous phase; degree of substitution

TS231

A

1002-6630（2014）03-0276-04

10.7506/spkx1002-6630-201403054

2013-02-27

黑龍江省杰出青年基金項(xiàng)目（jc201106）；黑龍江省教育廳科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)計(jì)劃項(xiàng)目（2010td04）

林凱（1989—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)樯锎呋-mail：glklkk@126.com

*通信作者：辛嘉英（1966—），男，教授，博士，研究方向?yàn)樯锎呋?。E-mail：xinjiayingvip@163.com