毛海燕，蔡 娜，陳亨莉，曹敏杰，蔡秋鳳，劉光明*

（集美大學生物工程學院，福建省高校水產(chǎn)科學技術與食品安全重點實驗室，福建 廈門 361021）

擬穴青蟹新型過敏原肌質鈣結合蛋白的純化、鑒定及分子克隆

毛海燕，蔡 娜，陳亨莉，曹敏杰，蔡秋鳳，劉光明*

（集美大學生物工程學院，福建省高校水產(chǎn)科學技術與食品安全重點實驗室，福建 廈門 361021）

為進一步認識蟹類的過敏原，采用免疫印跡方法，分析發(fā)現(xiàn)甲殼類過敏患者血清能與擬穴青蟹肌漿蛋白中分子質量約為21 kD的蛋白質產(chǎn)生特異的IgE結合反應，結果顯示該蛋白可能是蟹類新型過敏原。通過硫酸銨鹽析、陰離子交換和凝膠過濾柱層析等方法對21 kD-蛋白進行分離純化，采用Western blotting和基質輔助激光解析電離飛行時間質譜（matrix assisted laser desorption ionization-time of flight-mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）確認純化的21 kD-蛋白為肌質鈣結合蛋白（sarcoplasmic calcium binding protein，SCP）。采用SMART-RACE（Switchin g Mechanism At RNA Termini-Rapid Amplification of cDNA Ends）的方法獲得SCP的cDNA序列，該序列全長986 bp，開放閱讀框為579 bp，編碼193個氨基酸，其理論分子質量21.94 kD，等電點4.44。擬穴青蟹SCP與甲殼類動物SCP具有較高的同源性，與昆蟲SCP的同源性較差；三級結構模擬分析顯示，SCP含有5個螺旋-轉角-螺旋結構區(qū)，即EF-手型結構區(qū)，并在其中兩個手型結構區(qū)形成2個鈣離子結合位點；進一步預測得到SCP的4個線性抗原表位和3個構象性抗原表位。

擬穴青蟹；新型過敏原；肌質鈣結合蛋白；純化；質譜分析；分子克??；生物信息學分析

食物過敏是一類常見的變態(tài)反應疾病，近年來其發(fā)病率明顯上升。臨床癥狀主要有腹痛、腹瀉、嘔吐、皮疹、哮喘等，嚴重時會威脅人們的生命。甲殼類動物是聯(lián)合國糧食及農業(yè)組織公布的八大類過敏食物之一，其含有多種過敏原，如：原肌球蛋白（tropomyosin，TM）、精氨酸激酶（arginine kinase，AK）、肌球蛋白輕鏈、肌鈣蛋白C、磷酸丙糖異構酶和血藍蛋白[1-3]。

肌質鈣結合蛋白（sarcoplasmic calcium-binding protein，SCP）是存在于無脊椎動物肌肉和神經(jīng)組織中的EF-手型鈣離子結合蛋白，其功能與脊椎動物的小清蛋白（parvalbumin，PV）相似，主要參與肌肉的收縮[4]。Shiomi等[5]最先采用對蝦過敏患者血清鑒定斑節(jié)對蝦SCP（Pen m 4）為甲殼類的新型過敏原。Ayuso等[6]通過質譜鑒定了凡納濱對蝦中SCP是一種新型過敏原（Lit v4），并指出重組SCP能夠誘導兔嗜堿性粒細胞釋放β-氨基己糖苷酶。Bauermeister等[1]證實褐蝦中的SCP（Cra c 4）也是一種過敏原。近期，本研究室報道克氏原螯蝦SCP能夠與甲殼類過敏患者血清產(chǎn)生免疫反應，證實SCP為克氏原螯蝦的新型過敏原[7]。

蟹類是甲殼類動物的常見代表，其種類繁多，在我國就有600多種，包括梭子蟹、青蟹、雪蟹等。我國是世界上蟹類的生產(chǎn)與消費大國，2011年蟹類產(chǎn)量已達80萬t[8]。但相對于蝦而言，國內外對蟹類過敏原的研究較少。目前，已確定的蟹類過敏原是TM和AK[9-10]。趙綺華等[11]鑒定梭子蟹中主要致敏組分是74 kD 和48 kD的蛋白，次要致敏組分的分子質量為89、33 kD 和29 kD的蛋白，但未鑒定出這些組分是哪種蛋白。宋益銀等[12]指出鋸緣青蟹中14.3 kD的過敏原為血藍蛋白亞基[12]。然而，國內外幾乎沒有蟹類SCP及其致敏性的研究報道。

本研究以擬穴青蟹為研究對象，采用甲殼類過敏患者血清，分析其肌漿蛋白中新型過敏原，并對新型過敏原進行分離純化和鑒定。通過分子克隆得到擬穴青蟹新型過敏原的cDNA全序列，并與其他甲殼類動物的序列進行比較， 為分析擬穴青蟹新型過敏原抗原表位及結構特征等提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活的擬穴青蟹（Scylla paramamosain）購自廈門集美市場，去殼取肉，立即用于實驗或置于－80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。甲殼類過敏患者血清2份，編號依次為3295和3666，患者均自述對甲殼類水產(chǎn)品過敏且在采血前出現(xiàn)過敏癥狀；健康人血清2份，編號依次為9857和6246。以上血清來源于集美大學醫(yī)療中心，按等體積分裝后于－30 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

Q-Sepharose、Sephacryl S-200 瑞典Amersham公司；電泳用標準蛋白 立陶宛Fermentas公司；預染標準蛋白 英國New England公司；硝酸纖維素膜 美國Bio-Rad公司；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二次抗體 美國Pierce公司；辣根過氧化物酶標記的鼠抗人IgE二次抗體 英國Southern Biotech公司；兔抗克氏原螯蝦SCP多克隆抗體 本實驗室制備。

總RNA提取試劑盒 美國 Roche公司；TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒、Taq DNA聚合酶、DNA純化回收試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；SMART RACE Amplification Kit 美國Clontech公司；pGEM-T載體 美國Promega公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

Avanti J-25高速冷凍離心機 美國Beckman公司；PT-2100組織搗碎機 瑞士 Kinematica公司；Lamda 35紫外分光光度計 美國Perkin Elmer公司；Biologic LP蛋白質柱層析系統(tǒng)、電泳槽及電轉移裝置 美國Bio-Rad公司；G:BOX 凝膠成像儀 英國Syngene公司；4800 Plus串聯(lián)飛行時間質譜儀（MALDI TOF/TOF Analyzer）美國ABI公司。

1.3 肌漿蛋白的制備及免疫印跡分析

肌漿蛋白的制備方法參照Yu等[13]的方案并略做修改。取蟹肉100 g，切碎后置于4倍體積冰冷的緩沖液A （20 mmol/L Tris-HCl、10 mmol/L β-巰基乙醇、0.5 mmol/L 乙二胺四乙酸鈉、20 mmol/L苯甲基磺酰氟，pH 8.0）。用組織搗碎機搗碎。將懸浮液于15 000×g，4 ℃離心20 min，上清液經(jīng)絹布過濾后所得溶液即為肌漿蛋白。對肌漿蛋白進行SDS-PAGE分析[14]，并以甲殼類動物過敏患者血清的免疫印跡分析肌漿蛋白的IgE結合活性[6]。

1.4 21 kD-蛋白的純化及免疫印跡分析

將制備好的肌漿蛋白進行70%～90%飽和度的(NH4)2SO4鹽析，于12000×g、4 ℃離心20 min；所得沉淀用緩沖液B（10 mmol/L Tris-HCl、10 mmol/L β-巰基乙醇、0.1 mmol/L乙二胺四乙酸鈉，pH 8.0）溶解，再用不含β-巰基乙醇的緩沖液B充分透析，離心取上清。然后上樣于已用緩沖液B平衡好的Q-sepharose柱。洗脫未吸附部分，分別用含0～0.15 mol/L和0.15～0.5 mol/L NaCl的緩沖液B進行線性洗脫，收集吸附部分。將洗脫部分的蛋白進行SDS-PAGE分析，合并含目的蛋白的溶液進行超濾濃縮后上樣于已平衡好的Sephacryl S-200，用緩沖液B洗脫，收集洗脫液并進行SDS-PAGE分析。采用兔抗克氏原螯蝦SCP多克隆抗體的Western blotting分析驗證純化的21 kD-蛋白是否為SCP，甲殼類動物過敏患者血清池的Dot blotting分析純化的21 kD-蛋白是否具有IgE結合反應[7]，血清池的構建是將甲殼類過敏患者血清等體積混合后用1%脫脂奶（pH 7.5磷酸緩沖液）進行1∶10稀釋 。

1.5 21 kD-蛋白的質譜分析

1.5.1 樣品制備

將純化的21 kD-蛋白進行SDS-PAGE分析，考馬斯亮藍G-250染色，并脫色至出現(xiàn)清晰的蛋白條帶，然后，將目的蛋白條帶切下，凍干，加入5 μL 5 ng/μL的測序級胰蛋白酶溶液（酶與分析樣品的質量比為1∶100），37 ℃反應20 min，然后吸出酶液，加入100 μL 60%乙腈和0.1%三氟乙酸的混合液，超聲15 min；最后混合液與之前吸出的酶液合并，凍干[15]。

1.5.2 質譜分析

將凍干的樣品與5 mg/mL α-氰基-4-羥基肉桂酸基質以1∶1的比例混合，用串聯(lián)飛行時間質譜儀進行分析，激光源為Nd∶YAG激光器，波長355 nm，加速電壓為2 kV，采用正離子模式和自動獲取數(shù)據(jù)模式對數(shù)據(jù)進行采集。肽指紋圖譜（peptide mass fi ngerprinting，PMF） 的質量掃描范圍為800～4 000 D，選取一級質譜（mass spectrometry，MS）結果中信噪比大于50的母離子進行二級質譜（mass spectrometry mass spectrometry，MS-MS）分析。

使用Mascot搜索引擎，將質譜所得所有肽段的質量數(shù)及其圖譜在NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索，搜索的參數(shù)設置如下：切割酶為Trypsin，允許最大漏切位點數(shù)（missed cleavage）為1，固定修飾為carbamidom-ethyl，可變修飾為oxidation，MS的誤差10 010-6g/L，MS/MS的誤差為0.6。

1.6 擬穴青蟹SCP的基因克隆

1.6.1 總RNA的提取和cDNA第一鏈的合成

取擬穴青蟹腿部肌肉，在液氮中迅速研磨后，約取50 mg研碎的組織至1.5 mL離心管中，加入1 mL Trizol，充分組織勻漿后室溫放置5 min，加入200 μL三氯甲烷，劇烈振蕩15 s，靜置3 min，4 ℃、12 000×g離心15 min，將上層水相轉入新的離心管中，加入等體積的異丙醇，充分混勻，室溫放置30 min，4 ℃、12 000×g離心10 min，棄上清，用1 mL 75%乙醇洗滌沉淀，室溫干燥5 min。加入20 μL DEPC水溶解, 測定RNA純度及濃度。利用TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒合成cDNA，－20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.2 引物設計與合成

根據(jù)已報道的甲殼類S C P的基因序列（GenBank登錄號：AEG79568、ACR43475、ACM89179、BAL72725）設計擴增引物（3R1：5’-AACCAGAAGATCATGTCCAACCTC-3’, 5F1：5’-GCGTTGGCGGACTCGTCGGGGTTG-3’）并由Invitrogen公司合成。

1.6.3 中間片段擴增

以上述cDNA為模板，進行PCR擴增，反應體系25 μL。擴增條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s、52 ℃復性45 s、72 ℃延伸1 min、30個循環(huán)，72℃延伸7 min，4 ℃保存。目的產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后采用DNA回收試劑盒純化，與T載體連接并轉化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，在含5 μL異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（200 g/L）、40 μL X-gal （20 g/L）及100 mg/L氨芐青霉素的LB平板上挑選白色菌落，37 ℃培養(yǎng)過夜，提取質粒，陽性克隆送上海英駿生物技術有限公司測序。

1.6.4 cDNA末端快速克隆

根據(jù)上述過程得到的cDNA中間序列以及接頭引物Primer Mix（UPM）和Nested Universal Primer（NUP）序列，設計并合成基因特異性引物（5F2：5’-CTTGTCCTCATCAGTAGCGAGCTTG-3’，3R2：5’-CAAGACTGTCATTGGTCGCCTGTTC-3’）。使用SMART RACE Amplification Kit分別進行擬穴青蟹SCP cDNA 3’和5’端的克隆。

1.7 序列分析

應用DNA STAR軟件推導出擬穴青蟹SCP的氨基酸序列。利用ExPAsy-SIB生物信息學資源數(shù)據(jù)庫（http:// www.expasy.org/tools/）所提供的分析工具，分析擬穴青蟹SCP的基本性質，如：分子質量、等電點、鈣離子結合位點。分別應用DNA STAR protean[16]和DiscoTope 2.0 Server[17]預測其可能的線性表位和構象性表位。通過BLAST （http://blast.ncbi.nlm.nih.gov）工具進行核酸相似性檢索后，使用MEGA 5.0構建基于SCP氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹。通過Phyre 2.0 Server[18]模擬SCP的三級結構，利用PyMol軟件對模型進行相關分析。

2 結果與分析

2.1 擬穴青蟹肌漿蛋白的制備及免疫印跡分析

圖1 擬穴青蟹肌漿蛋白的SDS-PAGE分析（A）及其與甲殼類過敏患者血清的IgE免疫印跡分析（BB）Fig.1 SDS-PAGE (A) and IgE immunoblotting analysis (B) of myosinogen from Scylla paramamosain

通過組織勻漿及離心等步驟得到擬穴青蟹的肌漿蛋白，結果見圖1A，采用甲殼類過敏患者血清對其進行免疫印跡分析，結果見圖1B。在擬穴青蟹肌漿蛋白中分子質量約為21 kD的蛋白質能與甲殼類過敏患者血清發(fā)生特異的IgE結合反應，而不與健康人血清反應。

2.2 21 kD-蛋白的純化及免疫印跡分析

將得到的肌漿蛋白，經(jīng)過7 0%～9 0%的飽和(NH4)2SO4鹽析，陰離子交換柱層析和凝膠柱層析后，目的蛋白得到了純化，結果見圖2A，采用兔抗克氏原螯蝦SCP多克隆抗體對純化的21 kD-蛋白進行Western blotting分析，結果見圖2B。該蛋白能夠與兔抗克氏原螯蝦SCP多克隆抗體產(chǎn)生明顯的雜交反應，因此初步判定純化的21 kD-蛋白可能為擬穴青蟹SCP。將純化的蛋白與甲殼類動物患者血清池反應，結果見圖2C，發(fā)現(xiàn)純化的21 kD-蛋白具有IgE結合活性。

圖2 純化的擬穴青蟹21 kD-蛋白的SDS-PAGE圖譜(A）、Westernblotting (B）及Dot blotting分析(C）Fig.2 SDS-PAGE (A), Western blotting (B) and Dot blotting (C) analysis of the isolated 21 kD-protein from Scylla paramamosain

2.3 21 kD-蛋白的質譜分析

將擬穴青蟹21 kD-蛋白經(jīng)胰蛋白酶酶切后，進行基質輔助激光解析電離飛行時間質譜（matrix assisted laser desorption ionization-time of flight-mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）分析，從一級質譜圖中選擇強度較高的肽段進行串聯(lián)質譜分析，將分析結果經(jīng)Mascot搜索引擎在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行檢索。根據(jù)Mascot的評分標準（P＜0.05），將得分排在前3位的蛋白信息列于表1，它們分別是變色小長臂對蝦（Palaemonetes varians）、褐蝦（Crangon crangon）、克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）的SCP。質譜分析結果再次證實，擬穴青蟹中分子質量位于21 kD過敏原確實為SCP。

表1 Mascot檢索結果Table 1 Mascot search results

2.4 擬穴青蟹SCP的基因克隆及序列分析

通過SMART-RACE的方法擴增擬穴青蟹SCP cDNA基因序列，結果見圖3。其全長為986 bp，開放閱讀框長579 bp，編碼193個氨基酸，推導分子質量為21.94 kD，等電點為4.44，具有兩個鈣離子結合位點。DNA star protean軟件分析表明，擬穴青蟹SCP具有4個線性抗原表位，它們分別位于AA 53～57、AA 72～76、AA 90～92、AA 140～159?？寺〉玫降男蛄幸烟峤恢罣eneBank，登錄號為JQ860424。

圖3 擬穴青蟹SCP cDNA序列及氨基酸序列Fig.3 The cDNA and deduced a mino acids sequence of SCP from Scylla paramamosain

將擬穴青蟹SCP與其他物種SCP的氨基酸序列進行比對，由圖4可知，克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）SCP的同源性為85%（164/193），與褐蝦（Crangon crangon）SCP的同源性為82%（157/192），與南美白對蝦（Litopenaeus vannamei）的同源性為80% （154/193），與斑節(jié)對蝦（Penaeus monodon）SCP的同源性為79%（152/193），與日本對蝦（Marsupenaeus japonicas）SCP的同源性為78%（150/193），與黑腹果蠅（Drospphila melanogaster）SCP的同源性為23% （44/192）、與蠅蛹金小蜂（Nasonia vitripennis）SCP的同源性為22%（43/192）。

圖4 擬穴青蟹與部分無脊椎動物SCP的序列比較Fig.4 Multiple sequence alignment of SCP between Scylla paramamosain and selected invetebrate

2.5 擬穴青蟹SCP的系統(tǒng)進化關系分析

使用MEGA 5.0軟件對擬穴青蟹SCP與其他7種甲殼類物種SCP序列構建系統(tǒng)進化樹，結果如圖5所示。昆蟲類SCP聚為一簇，甲殼類SCP聚為一簇，其中擬穴青蟹SCP與克氏原螯蝦SCP、褐蝦SCP具有更近的親緣性。

圖5 SCP的系統(tǒng)進化樹Fig.5 Phylogenetic tree of SCP from different organisms

2.6 擬穴青蟹SCP三級結構預測及其構象性表位分析

圖6 擬穴青蟹SCP三級結構模型(A)及其構象性表位區(qū)域示意圖(B)Fig.6 The simulated three-dimensional structure of SCP from Scylla paramamosain (A) and schematic diagram of its conformational epitope regions (B)

以擬穴青蟹SCP氨基酸序列為模板，通過Phyre 2.0 server對其進行同源建模，利用PyMol軟件對模型進行分析，結果如圖6A所示：SCP包含9個α螺旋，形成5個螺旋-轉角-螺旋結構區(qū)，并折疊成緊密的球狀。DiscoTope 2.0 Server預測顯示SCP具有3個構象性抗原表位，其分布情況如圖6B（1～3）所示。

3 結 論

蟹類味道鮮美、營養(yǎng)豐富備受消費者喜愛，但因食用蟹類而導致的食物過敏事件時有發(fā)生[19]。本研究通過甲殼類過敏患者血清與擬穴青蟹肌漿蛋白之間的免疫反應，確定其分子質量為21 kD的蛋白為擬穴青蟹新型過敏原。并對其進行分離純化，純化的蛋白具有IgE結合活性。值得一提的是在進行陰離子交換柱層析的過程中過敏原AK首先得到了純化，而含有雜蛋白的目的條帶則是在其后被洗脫下來的，然后經(jīng)凝膠過濾柱層析得到純化。Western-blotting和質譜分析技術均證實該過敏原為SCP。

分子克隆結果表明，擬穴青蟹SCP的理論分子質量21.94 kD，等電點4.44，該結果與已報道的蝦類SCP相近，例如：褐蝦SCP的分子質量22.08 kD，等電點4.55[1]；斑節(jié)對蝦SCP分子質量為22.12 kD，等電點為4.64[5]；南美白對蝦SCP的分子質量22.06 kD，等電點4.58[6]；克氏原螯蝦SCP的分子質量21.77 kD，等電點4.54[7]。序列比對結果顯示其與其他甲殼類動物SCP具有較高的同源性，而與昆蟲相比卻存在較大的差異。

擬穴青蟹SCP的三級結構是由9個α螺旋形成的5個螺旋-轉角-螺旋結構區(qū)構成，且具有2個鈣離子結合位點。Morii等[20]證實通過添加金屬離子螯合劑EGTA能夠使斑節(jié)對蝦SCP的IgE結合活性下降，同時他們通過全序列合成肽的方法對斑節(jié)對蝦SCP的IgE抗原表位進行研究發(fā)現(xiàn)，其不含線性的IgE抗原表位，因此推測斑節(jié)對蝦SCP的抗原表位為構象性。有研究表明無脊椎動物的SCP與脊椎動物的PV都是EF-手型鈣離子結合蛋白，且具有相似功能[21]。阮密密等[22]曾報道鱖魚PV的三級結構是由6個α螺旋，形成3個螺旋-轉角-螺旋結構區(qū)構成。也有研究[23]指出PV是存在于魚類和蛙類中的過敏原，添加金屬離子螯合劑EGTA能夠使小清蛋白IgE結合活性下降。從以上研究，可以推測SCP與PV相似，其IgE結合活性與Ca2+密切相關。

通過生物信息學的方法得到擬穴青蟹SCP的4個線性抗原表位和3個構象性抗原表位，結果發(fā)現(xiàn)：構象性表位2（71～73AA）與線性表位2（72～76AA）具有兩個相同的氨基酸，且其本身的氨基酸序列是連續(xù)的；構象性表位3（157AA）只含有1個氨基酸，包含在線性表位4（140～159AA）中；構象性表位1與線性表位沒有重疊或相鄰的氨基酸。該結果說明，擬穴青蟹SCP中可能同時存在線性和構象性的抗原表位。這一結論需要在以后的實驗中利用更多的甲殼類過敏患者血清加以證實。本實驗證實SCP為擬穴青蟹新型過敏原，對其進行分離純化、質譜鑒定和分子克隆，并對獲得的序列進行同源比對、進化關系分析、三級結構建模和抗原表位預測等研究，系統(tǒng)地分析了擬穴青蟹的分子結構特征，為研究蟹類SCP的過敏原性及構象關系打下了基礎。

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Purification, Identification and Cloning of a Novel Crab Allergen, Sarcoplasmic Calcium Binding Protein, from Scylla paramamosain

MAO Hai-yan, CAI Na, CHEN Heng-li, CAO Min-jie, CAI Qiu-feng, LIU Guang-ming*
(Key Laboratory of Science and Technology for Aquaculture and Food Safety, College of Biological Engineering, Jimei University, Xiamen 361021, China)

For acquiring more information about crab allergens, a 21 kD protein was purified from Scylla paramamosain by ammonium sulfate fractionation, anion exchange chromatography and gel filtration column chromatography. The protein was identified as a novel allergen having IgE binding activity with serum from shellfish-allergic patients. According to the results of Western blotting and matrix assi sted laser desorption ionization-time of flight-mass spectrometry (MALDI-TOF/ TOF-MS) studies, the protein was confirmed as a sarcoplasmic calcium binding protein (SCP). The method of switching mechanism at RNA termi ni-rapid amplification of cDNA ends (SMART-RACE) was applied to clone the cDNA of SCP. A full length cDNA with 986 bp was obtained, which included an open reading frame (ORF) coding for 193 amino acid residues with a predicted molecular weight of 21.94 kD and t heoretical isoelectric point of 4.44. The protein had a high homology with SCP from other shellfishes, but the homology with insects was low. Its tertiary structure was constructed using Phyre 2.0 server and the results showed that the SCP had five helix-loop-helix motifs, namely EF-hand domains, two of which formed two Ca2+binding sites. Furthermore, bioinformatics analysis predicted that this SCP contained four linear and three conformational epitopes.

Scylla paramamosain; novel allergen; sarcoplasmic calcium binding protein; purification; mass spectrometry; cloning; bioinformatics analysis

TS254.2；Q785；R392.8

A

1002-6630（2014）03-0122-06

10.7506/spkx1002-6630-201403025

2013-03-16

國家自然科學基金項目（31171660）；福建省杰出青年科學基金項目（2010J06012）

毛海燕（1986—），女，碩士研究生，研究方向為食品生物技術。E-mail：kathleen_mm@nwsuaf.edu.cn

*通信作者：劉光明（1972—），男，教授，博士，研究方向為食品生物技術。E-mail：gmliu@jmu.edu.cn