羅 磊，周燕燕，劉云宏，朱文學(xué)，郝英超，楊 彬

（河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 471000）

響應(yīng)面法優(yōu)化金銀花多酚氧化酶提取工藝

羅 磊，周燕燕，劉云宏，朱文學(xué)，郝英超，楊 彬

（河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 471000）

以金銀花為原料，采用勻漿浸提法提取多酚氧化酶，利用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化法對料液比、提取pH值、聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVP）添加量和浸提時(shí)間等工藝條件進(jìn)行分析與優(yōu)化。結(jié)果表明：勻漿浸提工藝參數(shù)對金銀花多酚氧化酶提取有顯著影響，影響顯著順序?yàn)榫彌_液pH值＞料液比＞浸提時(shí)間＞PVP添加量。金銀花多酚氧化酶勻漿浸提優(yōu)化工藝參數(shù)：料液比1∶6.29（m/V）、緩沖液pH 8.03、PVP添加量1 g/100 mL、浸提時(shí)間1.71 h，在此條件下獲得酶比活力為667.564 U/mg，所得多酚氧化酶提取回歸模型顯著（R2=0.9425），擬合性好，可用于預(yù)測多酚氧化酶的提取效果。

金銀花；多酚氧化酶；提取；響應(yīng)面優(yōu)化

金銀花為植物忍冬（Lonicera japonica Thunb.）的花蕾，具有清熱解毒、疏利咽喉、消暑除煩的功效，近代藥理實(shí)驗(yàn)和臨床應(yīng)用證實(shí)金銀花對多種致病菌有較強(qiáng)的抑菌效果[1]，并具有抗衰老、防癌變、輕身健體的良好功效，廣泛用于食品、飲料和保健品生產(chǎn)[2]，是一種天然的“藥食同源”原料[3]。金銀花采收后需及時(shí)干燥，而不恰當(dāng)?shù)母稍锿斐山疸y花外觀顏色劣變和藥用品質(zhì)的損失，前期研究結(jié)果證實(shí)，造成這一損失的主要原因是多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）引發(fā)的酶促褐變[4-7]，目前關(guān)于金銀花PPO的提取未見報(bào)道。

常見的PPO提取方法有丙酮法和勻漿浸提法，施春華[8]、肖厚榮[9]等利用丙酮法從不同品種煙草中分離PPO，Vicente等[10]則利用丙酮法提取鱷梨中的PPO。丙酮沉淀法所得酶液體積小、濃度高，提取效果好，但工藝復(fù)雜，丙酮有一定毒性。勻漿浸提法操作簡便，提取條件溫和，所得酶液活性較高，可直接用于進(jìn)一步研究。胡婉峰等[11]通過使用勻漿浸提法獲得活性較好的蓮藕PPO。為得到高比活性的金銀花PPO，本實(shí)驗(yàn)對其勻漿浸提工藝進(jìn)行研究，為金銀花酶促褐變機(jī)理及綠原酸等酚類物質(zhì)代謝途徑研究奠定一定的依據(jù)和基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金銀花，購自河南孟津縣金銀花生產(chǎn)基地，品種為金豐一號(hào)。

聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVP）、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、硫酸銨、鄰苯二酚、考馬斯亮藍(lán)G-250、牛血清白蛋白、乙醇、磷酸，均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

722N型分光光度計(jì)、PHS-3C型精密pH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；KDC-160HR高速冷凍離心機(jī)科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司。

1.3 方法

1.3.1 金銀花PPO提取與純化[12]

采用磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）勻漿浸提金銀花PPO，硫酸銨沉淀法對其進(jìn)行純化。

挑選金銀花10 g，加入pH 7的PBS溶液80 mL（內(nèi)含PVP 1.6 g），勻漿4 min，8層紗布過濾，4℃浸提1 h；于4℃、9 000 r/min離心15 min，收集上清液即為粗PPO液；采用硫酸銨分級(jí)沉淀除去粗酶液中的其他雜質(zhì)蛋白，鹽析后所得酶液置于4℃在蒸餾水中透析24 h，即為純化的PPO液。

1.3.2 酶活力測定[13]

使用磷酸鹽緩沖溶液配制鄰苯二酚為反應(yīng)底物，室溫條件下，將0.4 mL酶液與2 mL底物溶液混合均勻后倒入1 cm比色皿中，420 nm波長處測定吸光度，從酶液加入后開始計(jì)時(shí)，每10 s記錄一次吸光度，以底物溶液為空白組，通過最初直線段的斜率計(jì)算酶活力。一個(gè)酶活力單位（U）定義為：在測定條件下，單位時(shí)間內(nèi)引起吸光度改變0.001所需的酶量。

式中：Vr為加樣緩沖液總體積/mL；Vs為取樣比色體積/mL；m為取樣質(zhì)量/g。

1.3.3 蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度測定

采用Bradford考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)含量[14]，用牛血清白蛋白制作蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=3.825 x＋0.0421，R2=0.9 992（式中：y為吸光度，x為蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度/（mg/mL）），根據(jù)方程計(jì)算出樣品中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度。

1.3.4 金銀花PPO酶比活力的測定[15-16]

酶比活力是單位蛋白質(zhì)所具有的酶活力，一般用U/mg來表示，見式（2）。

1.3.5 金銀花PPO提取單因素試驗(yàn)

以提取金銀花PPO的料液比、緩沖液pH值、浸提時(shí)間、PVP添加量為試驗(yàn)因素，以金銀花PPO酶比活力為指標(biāo)，分別做單因素試驗(yàn)，分析各因素對金銀花PPO酶比活力的影響規(guī)律。

1.3.6 金銀花PPO提取工藝的響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，使用Box-Behnken中心試驗(yàn)設(shè)計(jì)，分析料液比、提取pH值、PVP用量以及浸提時(shí)間對PPO酶比活力的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 料液比對金銀花PPO酶比活力的影響

以固定緩沖液pH7、PVP 1 g/100 mL、浸提時(shí)間2 h，考察不同料液比（1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10）對金銀花PPO酶比活力的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 料液比對金銀花PPO酶比活力的影響Fig.1 Effect of solid-to-liquid ratio on the PPO specific activity

由圖1可知，當(dāng)料液比大于1∶7時(shí)，PPO酶比活力隨料液比的增加而明顯上升，當(dāng)料液比小于1∶7后，PPO酶比活力有所降低后基本保持不變。料液比過低致使原料打漿困難PPO不能完全溶入提取液中，提取不徹底造成PPO酶比活力偏低，隨著料液比的增加，PPO越來越多地溶入提取液中，比活力隨之增加[17]，當(dāng)料液比達(dá)到一定時(shí)，隨著料液比的繼續(xù)增加，PPO的溶出量達(dá)到一定值，提取液量的增加造成PPO量減小，酶比活力降低。

2.2 緩沖液pH值對金銀花PPO酶比活力的影響

圖2 緩沖液pH值對金銀花PPO酶比活力的影響Fig.2 Effect of extraction buffer pH on the PPO specific activity

以固定料液比1∶7、PVP 1 g/100 mL、浸提時(shí)間2 h，考察不同pH值（4、5、6、7、8、9、10）緩沖液對金銀花PPO比活力的影響，結(jié)果見圖2。采用不同pH值的磷酸鹽緩沖液提取金銀花PPO，所得PPO酶比活力不同，當(dāng)緩沖液pH值為7時(shí)，存在一個(gè)明顯的峰值，pH值小于7時(shí)，隨著緩沖液pH值的增加，PPO酶比活力上升，pH值大于7時(shí)，隨著緩沖液pH值的增加，PPO酶比活力下降。這可能是酸性和堿性環(huán)境對酶的構(gòu)相穩(wěn)定性均有較大的影響，不適宜的pH值會(huì)引起酶蛋白的聚集、變性等，造成酶活力的降低；由于PPO是含Cu元素膜結(jié)合蛋白，在pH值較低的酸性環(huán)境中，Cu2+被解離出來，當(dāng)在pH值過高的堿性環(huán)境中時(shí)，Cu2+解離形成氧化銅，或轉(zhuǎn)化成Cu(OH)2沉淀，從酶中脫離出來，均會(huì)降低酶比活性[18]。

2.3 PVP添加量對金銀花PPO酶比活力的影響

以固定料液比1∶7、緩沖液pH 7、浸提時(shí)間2 h，考察不同PVP添加量（1、1.5、2、2.5、3、3.5、4 g/100 mL）對金銀花多酚氧化酶比活力的影響，結(jié)果如圖3。

圖3 PVP添加量對金銀花PPO酶比活力的影響Fig.3 Effect of added PVP concentration on the PPO specific activity

由圖3可知，當(dāng)PVP添加量為1.5 g/100 mL時(shí)，PPO酶比活力達(dá)到最大值，PVP添加量小于1.5 g/100 mL時(shí)，隨著添加量的增加PPO酶比活力逐漸升高，PVP添加量大于1.5 g/100 mL時(shí)，隨著添加量的增加PPO酶比活力逐漸降低。這可能是金銀花PPO提取過程中，原料自身所含的酚類物質(zhì)能與PPO發(fā)生結(jié)合，沉淀蛋白質(zhì)從而影響PPO酶活性。PVP是一種多酚吸附劑，能夠在酶提取過程中保護(hù)酶蛋白的構(gòu)象和活力不受酚類的影響。當(dāng)PVP添加量過低時(shí)，不能有效的吸附酚類物質(zhì)，使PPO活性較低，PVP添加量過高時(shí)，在吸附酚類物質(zhì)的同時(shí)，PVP中的一個(gè)肽鏈結(jié)構(gòu)能與PPO中的Cu2+產(chǎn)生螯合作用，影響PPO活性；PVP含量過高，使提取液過于黏稠，不利于PPO的提取[19]。

2.4 浸提時(shí)間對金銀花PPO酶比活力的影響

以固定料液比1∶7、緩沖液pH7、PVP 1 g/100 mL，考察不同浸提時(shí)間（0、1、2、3、4、5、6 h）對金銀花PPO酶比活力的影響，結(jié)果如圖4。

圖4 浸提時(shí)間對金銀花PPO酶比活力的影響Fig.4 Effect of extraction time on the PPO specific activity

由圖4可知，隨著浸提時(shí)間的增長，PPO的酶比活力先增加，當(dāng)達(dá)到一定時(shí)間后開始逐漸降低，當(dāng)浸提1 h時(shí)，PPO的提取率最高。這可能是在PPO提取的過程中，隨著時(shí)間的增長，越來越多的酶被浸提到緩沖液中，提取液的酶活性也相應(yīng)的提高，隨著時(shí)間的延長，由于酶蛋白在溶液狀態(tài)下構(gòu)象不穩(wěn)定，以及金銀花酚類等其他物質(zhì)溶出，均容易造成酶活性的降低[20-21]。

2.5 金銀花PPO提取工藝的響應(yīng)面優(yōu)化

2.5.1 回歸模型的建立

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果Table 1 Box-Behnken experimental design and results

響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表1。每個(gè)試驗(yàn)組合重復(fù)試驗(yàn)3次，取其平均值作為PPO酶比活力結(jié)果，采用Design-Expert 8.05軟件分析試驗(yàn)結(jié)果。

對表1試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，得金銀花PPO酶比活力對料液比（X1）、緩沖液pH值（X2）、PVP添加量（X3）和浸提時(shí)間（X4）的二次多項(xiàng)式回歸模型為：

Y=－6 414.146 73＋1 170.322 54X1＋779.509 02X2＋25.535 8 9X3＋330.021 6 1X4－34.013 6 2X1X2＋35.483 58X1X3－3.148 33X1X4－24.302 75X2X3－0.736 25X2X4－40.445 00X3X4－73.726 21X12－33.644 25X22－13.335 84X32－77.362 27X42。

對回歸模型進(jìn)行方差分析和系數(shù)顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果如表2。

表2 回歸模型的方差分析及回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)Table 2 Analysis of variance for the established regression model

由回歸模型方差分析的結(jié)果（表2）可以看出，模型顯著性極高，方程不失擬；R2=0.942 5，表明所建立的回歸二次模型成立，可用此模型來分析和預(yù)測勻漿浸提法提取金銀花PPO提取工藝條件。從回歸模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果可知，X2、X1X2、X3X4、X12、X22、X42對提取金銀花PPO酶比活力影響極顯著，X1、X2X3對提取金銀花PPO酶比活力影響顯著，對提取金銀花PP O酶比活力影響不顯著。對金銀花PPO酶比活力影響的主次因素依次為緩沖液pH值＞料液比＞浸提時(shí)間＞PVP添加量。

2.5.2 模型雙因素交互作用效應(yīng)分析

將回歸方程中的任意2個(gè)因素固定在零水平，對余下的2個(gè)因素按照所得的二元二次回歸方程進(jìn)行編程運(yùn)算[22]，經(jīng)軟件分析得到交互因素的響應(yīng)面和等高線圖。由圖5并結(jié)合表2的顯著性分析可知，模型中因素X1X2和因素X3X4之間的交互作用較顯著。X1X2交互作用顯著可能是因料液比影響PPO的質(zhì)量濃度，緩沖液pH值的變化會(huì)影響PPO的酶活性，兩者相互作用改變PPO酶比活力；X3X4交互作用顯著的原因可能為PVP對酶液中酚類物質(zhì)的吸附作用隨著浸提時(shí)間的變化而變化，進(jìn)一步影響PPO的酶比活性。

圖5 料液比與緩沖液pH值及PVP添加量與浸提時(shí)間交互作用的響應(yīng)面和等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots showing the effects of X1X2and X3X4on the PPO specific activity

對回歸方程進(jìn)行分析計(jì)算，得到金銀花PPO最佳提取工藝條件為料液比1∶6.29、緩沖液pH 8.03、PVP添加量1 g/100 mL、浸提時(shí)間1.71 h，在此條件下獲得PPO酶比活力667.564 U/mg。

2.5.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為檢驗(yàn)響應(yīng)面優(yōu)化法對金銀花PPO提取效果的可靠性，在優(yōu)化提取條件下進(jìn)行PPO的提取，參考實(shí)際操作，采用料液比1∶6.3、緩沖液pH 8、PVP添加量1 g/100 mL、浸提時(shí)間1.7 h為最佳提取條件，進(jìn)行3次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，所得金銀花PPO的平均酶比活力為654.998 U/mg，與理論值偏差較小，重復(fù)性好，沒有顯著差異，說明運(yùn)用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的模型參數(shù)準(zhǔn)確可靠。

3 結(jié) 論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)，建立了金銀花PPO提取工藝參數(shù)的二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型，經(jīng)檢驗(yàn)該模型合理可靠，能較準(zhǔn)確的預(yù)測金銀花PPO的酶比活力，反映了提取效果的優(yōu)劣。勻漿浸提法對金銀花PPO酶比活力影響的主次因素依次為緩沖液pH值＞料液比＞浸提時(shí)間＞PVP添加量，料液比與緩沖液pH值的交互作用，及PVP添加量與浸提時(shí)間的交互作用對PPO酶比活力影響顯著。最佳提取條件為料液比1∶6.29（m/V）、緩沖液pH 8.03、PVP添加量1 g/100 mL、浸提時(shí)間1.71 h，在此條件下獲得酶比活力為667.564 U/mg。利用響應(yīng)面分析方法獲得金銀花多酚氧化酶提取的最優(yōu)工藝參數(shù)，將為干燥過程中金銀花酶促褐變機(jī)理及綠原酸等酚類物質(zhì)代謝途徑研究提供參考。

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Optimization of Extraction Process for Polyphenoloxidase from Honeysuckle (Lonicera japonica Thunb.) Flowers Using Response Surface Methodology

LUO Lei, ZHOU Y an-yan, LIU Yun-hong, ZHU Wen-xue, HAO Ying-chao, YANG Bin
(College of Food and Biological Engineering, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471000, China)

This study was aimed to optimize the extraction process for polyphenoloxidase (PPO) from honeysuckle (Lonicera japonica Thunb.) flowers using response surface methodology. The results showed that four operating parameters including buffer pH, material-to-liquid ratio, extraction time and polyvinylpyrrolidone(PVP) concentration had notable effects on the extraction of PPO from honeysuckle flowers and their effects could be ranked in decreasing order of importance as follows: buffer pH ＞ material-to-liquid ratio ＞ extraction time ＞ PVP concentration. The optimal extraction parameters were determined as pH 8.03 and 1:6.29 (m/V) of material-to-liquid, 1 g/100 mL PVP added to the extraction solvent and extraction for 1.71 h , resulting in a PPO specific activity of 667.564 U/mg. The established regression model describing PPO extraction from honeysuckle flowers as a function of the four extraction parameters was highly significant (R2＝0.9425). The predicted and experimental results were found to be in good agreement. Thus, the model can be applicabl e for the prediction of PPO extraction from honeysuckle flowers.

honeysuckle; polyphenoloxidase (PPO); extraction; response surface optimization

TS201

A

1002-6630（2014）03-0117-05

10.7506/spkx1002-6630-201403024

2013-08-03

國家自然科學(xué)基金聯(lián)合基金項(xiàng)目（U1304330）

羅磊（1976—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)樘烊换钚晕镔|(zhì)。E-mail：13623896431@139.com