李漸鵬，胡林剛，李永才*，畢 陽，葛永紅，王 毅

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

復(fù)合防腐劑對百合青霉病抑制效果的研究

李漸鵬，胡林剛，李永才*，畢 陽，葛永紅，王 毅

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken二次多項式回歸方程模型進(jìn)行響應(yīng)面分析，研究硅酸鈉、硼砂、殼聚糖復(fù)合處理組合對百合鱗莖青霉病的控制效果。結(jié)果表明：3種單一試劑均能有效地控制百合鱗莖青霉病的擴(kuò)展，對病斑直徑的影響程度依次為：硅酸鈉＞殼聚糖＞硼砂，復(fù)合處理組合202 mg/L硅酸鈉＋0.98 g/100 mL硼砂＋0.60 g/100 mL殼聚糖的抑制效果最好，病斑直徑僅為對照組的51%，顯著地抑制了青霉病的擴(kuò)展。

百合鱗莖；青霉?。环栏瘎?；響應(yīng)面分析

百合（Lilium）是百合科百合屬多年生草本植物，在我國可食用的有宜興百合、龍牙百合及蘭州百合3個品系，其中蘭州百合以其鱗莖肉厚、潔白香甜，含糖量高、粗纖維低而著名，深受人們青睞[1]。但百合鱗莖在貯藏期間極易受病菌侵染造成腐爛變質(zhì)、貯藏時間短，其中由圓弧青霉（Penicillium cyclopium）引起的青霉病最為嚴(yán)重[2]。目前百合多采用－3 ℃冷庫低溫貯藏或化學(xué)合成藥物處理降低采后病害[3-5]。然而，長期大量使用化學(xué)藥劑不僅會使病原菌產(chǎn)生抗藥性，而且會造成農(nóng)藥殘留，不但威脅著人類的健康，而且嚴(yán)重污染環(huán)境。因此，開發(fā)安全環(huán)保的新型防腐劑以代替化學(xué)殺菌劑來防治果蔬的病害已勢在必行。

近年來，硅酸鹽、硼酸鹽和殼聚糖作為一種新型的安全防腐劑逐漸被應(yīng)用于果蔬采后商品化處理。采后硅酸鈉處理不僅可以有效抑制厚皮甜瓜的多種采后病害[6-7]，減輕梨果黑斑病和青霉病[8-10]以及馬鈴薯塊莖的干腐病[11-12]，還可以有效地控制柑橘的青霉病[13]。近期研究表明硼酸鉀可有效地控制灰葡萄孢（Botrytis cinerea）引起的鮮食葡萄的采后灰霉病[14]，同時硼酸鈉顯著抑制核果鏈核盤菌（Monilinia laxa）菌絲的生長，并且濃度越高抑制效果越好[15]。殼聚糖具有無毒、成膜好、抗菌范圍廣等特點，在果蔬保鮮方面受到高度的重視[16-18]。目前已在馬鈴薯[19]、杏[20]等果蔬的采后病害控制中進(jìn)行了研究和應(yīng)用。

硅酸鈉、硼砂和殼聚糖作為代替化學(xué)合成殺菌劑的安全防腐劑在果蔬采后病害控制中均具有潛在的應(yīng)用前景，但各自作用機(jī)理存在差異，硅酸鈉和硼砂主要通過直接抑制病原物的生長控制病害，而殼聚糖既具有殺菌作用又具有誘抗作用，同時其單獨(dú)處理均不能完全有效地控制病害的擴(kuò)展。因此為充分發(fā)揮各自的作用效果，減少使用劑量和降低成本，本實驗通過單因素和響應(yīng)面試驗設(shè)計，研究硅酸鈉、硼砂和殼聚糖復(fù)合處理對蘭州百合鱗莖青霉病的控制效果，確定其最佳處理組合，以期為百合鱗莖青霉病的安全控制提供新的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

百合鱗莖采自蘭州七里河區(qū)西果園鄉(xiāng)，采后放置在－2 ℃冷庫中保藏。

硅酸鈉、硼砂、殼聚糖均為分析純 天津光復(fù)公司。

圓弧青霉（Penicillium cyclopium），在染病百合鱗莖上分離、純化后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

101-1型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；AL204型電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；LDZX-30KB型立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；S.SW-CJ-1FD型凈化工作臺 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基的制作

參照方中達(dá)[21]的方法制作馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L、蔗糖20 g/L、瓊脂17～20 g/L。將馬鈴薯切成大約1 cm2的小方塊，加水煮沸30 min后過濾。同時將蔗糖和瓊脂分別溶解后與馬鈴薯過濾液混合，并定容1 000 mL，分裝在三角瓶中進(jìn)行高壓滅菌。滅菌后制備平板培養(yǎng)基。

1.3.2 孢子懸浮液的配制

參照畢陽等[22]方法。取25 ℃培養(yǎng)7 d的P. cyclopium菌株培養(yǎng)皿1個，加入含0.05%吐溫-80的無菌水約10 mL，收集病原菌孢子，用4層紗布過濾并轉(zhuǎn)入已滅菌的三角瓶中，在振蕩器上充分振蕩，待孢子完全被打散均勻后，獲得純孢子懸浮液，經(jīng)顯微血球計數(shù)板計數(shù)確定孢子濃度，并稀釋至1×106CFU/mL。

1.3.3 單因素試驗

選擇外觀健康、瓣大肉厚的鱗莖，用自來水清洗干凈后，在0.1%的次氯酸鈉中浸泡20 s進(jìn)行表面消毒，取出晾干，用1×106CFU/mL的P. cyclopium進(jìn)行損傷接種，放置2 h后，分別在質(zhì)量濃度50、100、150、200、250 mg/L的硅酸鈉，0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 g/100 mL的硼砂和0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 g/100 mL的殼聚糖溶液中浸泡處理3 min。取出晾干，置于培養(yǎng)皿內(nèi)于室溫下保鮮膜覆蓋保濕貯藏，6 d后測病斑直徑。以蒸餾水處理作對照，每次處理用鱗莖40個，重復(fù)3次。

1.3.4 響應(yīng)面試驗設(shè)計

根據(jù)不同質(zhì)量濃度試劑的單因素試驗結(jié)果，選取硅酸鈉（A）、硼砂（B）、殼聚糖（C）3個因素為自變量，以病斑直徑為響應(yīng)值，進(jìn)行中心組合試驗設(shè)計，每個試驗重復(fù)3次，取其平均值，試驗因素水平及編碼見表1。將數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，并對回歸方程進(jìn)行方差分析及擬合度檢驗，討論模型所在響應(yīng)面特征，預(yù)測響應(yīng)值是否為極大值、極小值，或是鞍點。若為極值，則進(jìn)行驗證；若為鞍點，則進(jìn)行脊嶺分析，確定在何處進(jìn)行實驗可得到最好結(jié)果。

表1 響應(yīng)面分析試驗設(shè)計因素水平及編碼Table 1 Factorial levels of Box Behnken design

1.3.5 模型驗證

通過響應(yīng)面法優(yōu)化藥物復(fù)合處理后百合鱗莖的病斑直徑，并以優(yōu)化后的最佳復(fù)合方式進(jìn)行實驗驗證，比較模型預(yù)測值和實驗值，驗證模型的有效性。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 8.1及Microsoft Excel 2003統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析和差異顯著性分析，采用Design Expert 8.06軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析。每個實驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 硅酸鈉對青霉病斑直徑的影響

圖1 硅酸鈉處理對百合鱗片青霉病病斑直徑的影響Fig.1 Effects of sodium silicate treatment on lesion diameters of lily bulb inoculated with P. cyclopium

由圖1可知，除250 mg/L硅酸鈉外，各質(zhì)量濃度硅酸鈉處理的百合鱗片病斑直徑均低于對照（P＜0.05）。但各處理組對青霉病的控制效果并不存在質(zhì)量濃度差異效應(yīng)，其中200 mg/L的硅酸鈉處理組控制效果最好，其病斑直徑僅為對照的61.8%。而當(dāng)處理質(zhì)量濃度進(jìn)一步提高到250 mg/L時，其病斑直徑反而增高，這可能由于高濃度藥物對百合產(chǎn)生了藥害。王彩霞等[23]在研究不同質(zhì)量濃度的醚菌酯對百合鱗莖青霉病的控制，同樣發(fā)現(xiàn)125 mg/L的高質(zhì)量濃度處理顯著增加病害的發(fā)生率和病斑直徑。

2.1.2 硼砂對青霉病斑直徑的影響

圖2 硼砂處理對百合鱗片青霉病病斑直徑的影響Fig.2 Effects of sodium borate treatment on lesion diameters of lily bulb inoculated with P. cyclopium

由圖2可知，硼砂處理可有效降低損傷接種P. cyclopium的百合鱗莖的病斑直徑，不同質(zhì)量濃度的硼砂處理的控制效果存在差異。當(dāng)質(zhì)量濃度低于1.00 g/100 mL時，隨著處理質(zhì)量濃度的增加，其控制效果明顯增加，且病斑直徑均顯著低于對照（P＜0.05），其中1.00 g/100 mL的硼砂處理控制效果最好，病斑直徑為對照的89.1%。當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)1.25 g/100 mL時，其病斑直徑雖仍顯著低于對照（P＜0.05），但控制效果明顯降低。

2.1.3 殼聚糖對青霉病斑直徑的影響

圖3 殼聚糖處理對百合鱗片青霉病病斑直徑的影響Fig.3 Effects of chitosan treatment on lesion diameters of lily bulb inoculated with P. cyclopium

由圖3可知，隨著殼聚糖質(zhì)量濃度的升高，病斑直徑逐漸減小，然而當(dāng)質(zhì)量濃度大于0.6 g/100 mL時，隨著殼聚糖質(zhì)量濃度的升高，病斑直徑反而逐漸增大。其中0.60 g/100 mL的處理病斑直徑最小，為對照的85%。這可能是較低質(zhì)量濃度的殼聚糖誘導(dǎo)百合組織產(chǎn)生了抗病性，孫曉娟等[19]在研究殼聚糖對馬鈴薯塊莖干腐病的控制時發(fā)現(xiàn)，較低質(zhì)量濃度的殼聚糖能顯著抑制病斑的擴(kuò)展，而1.0 g/100 mL高質(zhì)量濃度的殼聚糖處理塊莖表皮出現(xiàn)了輕微的藥害，病斑直徑反而增大。

2.2 響應(yīng)面試驗設(shè)計與優(yōu)化分析

2.2.1 響應(yīng)面設(shè)計結(jié)果及顯著性檢驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以硅酸鈉(A)、硼砂（B）、殼聚糖（C）為自變量，以百合鱗莖青霉病斑直徑（L）為響應(yīng)值，設(shè)計三因素三水平的Box-Behnken響應(yīng)面分析試驗，如表2所示。

表2 響應(yīng)面分析試驗設(shè)計方案及結(jié)果Table 2 Experimental design and corresponding results for response surface analysis

表3 回歸方程模型方差分析及其系數(shù)的顯著性檢驗Table 3 Analysis of variance for the fitted quadratic model and significance test of the regression coefficients in it

應(yīng)用Design Expert 8.0.6軟件對表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，獲得回歸模型為：

L=0.37－5.00A＋0.011B＋1.25C－0.038AB＋0.018AC＋5.00BC＋0.035A2＋0.063B2＋0.038C2。

由表3可知，經(jīng)顯著性檢驗可以看出，回歸模型顯著，R2為0.873 8，調(diào)整后R2為0.711 6，說明模型的擬合度較好，響應(yīng)值的71.16%是由于所選變量引起，表明百合鱗莖病斑直徑實際值與預(yù)測值之間具有較好的擬合相關(guān)性。模型失擬項表示模型預(yù)測值與實際值不擬合的概率，本試驗?zāi)Ｐ褪M項的P值為0.250 2＞0.1，模型失擬項不顯著，進(jìn)一步說明此模型的擬合度良好。變異系數(shù)反映模型的置信度，值越低模型的置信度越高，本試驗的變異系數(shù)為6.51%，說明模型方程能夠較好地反映真實值。綜合分析該模型擬合程度良好，故可使用該模型來分析和預(yù)測復(fù)合防腐劑的配方。對模型中的回歸系數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗可以看出，二次項中AB、A2、B2、C2對百合鱗莖病斑直徑（L）有較顯著影響（P＜0.05）。對回歸方程中一次項系數(shù)的絕對值進(jìn)行比較，各試驗因素對病斑直徑（L）的影響順序為：硅酸鈉＞殼聚糖＞硼砂。

2.2.2 交互作用分析

圖4 硅酸鈉和硼砂對百合鱗莖病斑直徑的影響Fig.4 Effects of sodium silicate and sodium borate on lesion diameters of lily bulb inoculated with P. cyclopium

從圖4a可以看出，硅酸鈉和硼砂存在著協(xié)同作用，即在一定的質(zhì)量濃度區(qū)域內(nèi)，只有兩者同時升高或同時降低，才能降低病斑直徑。當(dāng)硅酸鈉質(zhì)量濃度為150～250 mg/L時，且硼砂質(zhì)量濃度為0.80～1.10 g/100 mL時，百合青霉病斑直徑有最小值0.36 cm。如圖4b所示，兩者之間等高線的形狀呈橢圓形，表明交互影響作用顯著。

圖5 硅酸鈉和殼聚糖對百合鱗莖病斑直徑的影響Fig.5 Effects of sodium silicate and chitosan on lesion diameters of lily bulb inoculated with P. cyclopium

從圖5a可以看出，硅酸鈉和殼聚糖同樣存在著協(xié)同作用，即在一定的質(zhì)量濃度區(qū)域內(nèi)，只有兩者同時升高或同時降低，才能降低病斑直徑。當(dāng)硅酸鈉質(zhì)量濃度為160～250 mg/L，且殼聚糖質(zhì)量濃度為0.45～0.75 g/100 mL時，百合青霉病斑直徑有最小值0.36 cm。如圖5b所示，兩者之間等高線的形狀呈橢圓形，表明交互影響作用顯著。

圖6 硼砂和殼聚糖對百合鱗莖病斑直徑的影響Fig.6 Effects of sodium borate and chitosan on lesion diameters of lily bulb inoculated with P. cyclopium

從圖6 a可以看出，殼聚糖質(zhì)量濃度為0.40～0.80 g/100 mL時，病斑直徑呈下降趨勢，硼砂質(zhì)量濃度0.75～1.25 g/100 mL時，病斑直徑也呈下降趨勢，兩者之間沒有顯著的交互作用。從圖6b可以看出，等高線的性狀為圓形，表明了硼砂和殼聚糖交互作用不顯著。

2.2.3 最佳復(fù)合防腐劑配方的確定及驗證實驗

根據(jù)二次回歸的數(shù)學(xué)模型分析結(jié)果，得出在本試驗條件下最佳抑菌配方為：硅酸鈉質(zhì)量濃度202 mg/L、硼砂質(zhì)量濃度0.98 g/100 mL、殼聚糖質(zhì)量濃度0.60 g/100 mL，此時百合鱗莖病斑直徑為0.37 cm。為了驗證響應(yīng)面法的可行性，將最佳條件重復(fù)實驗3次，百合鱗莖病斑直徑為0.36 cm，與理論值相差不大，充分驗證了模型的正確性，表明響應(yīng)面法適用于百合鱗莖青霉病防腐劑配方的優(yōu)化。

3 結(jié) 論

硅酸鈉、硼砂和殼聚糖單獨(dú)處理均能不同程度地抑制百合鱗莖青霉病的擴(kuò)展，其中硅酸鈉和殼聚糖的控制效果較好。依據(jù)響應(yīng)面試驗設(shè)計數(shù)學(xué)模型確定的最佳防腐劑復(fù)合配方為202 mg/L的硅酸鈉＋0.98 g/100 mL的硼砂＋0.60 g/100 mL的殼聚糖，用此優(yōu)化組合處理百合鱗莖，青霉病斑直徑為對照組的51%，顯著地抑制了青霉病的擴(kuò)展。模型方差分析和響應(yīng)面分析表明，該模型回歸顯著，對實驗擬合較好，對控制百合鱗莖的青霉病有一定應(yīng)用價值。

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Controlling Effects of Preservative Blends on Blue Mold of Lily Bulb

LI Jian-peng, HU Lin-gang, LI Yong-cai*, BI Yang, GE Yong-hong, WANG Yi
(College of Food Science and Engineering, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China)

This study was designed to examine the inhibitory effect of mixtures of sodium silicate, sodium borate and chitosan on blue mold of Lanzhou lily bulbs (Lilium davidii var. unicolor). Based on single-factor experiments, a quadratic polynomial regression equation model was developed by using Box-Behnken design (BBD) and elucidated by response surface analysis. The results showed that all three preservatives when used individually reduced the expansion of blue mold effectively and their efficacy descended in the order: sodium silicate ＞ chitosan ＞ sodium borate. The most effective inhibitory activity against blue mold was obtained by mixing sodium silicate, sodium borate and chitosan at final concentrations of 202 mg/L, 0.98 g/100 mL and 0.60 g/100 mL. The resulting lesion diameter was only 51% as compared to the control, thereby significantly controlling the expansion of blue mold.

lily bulb; blue mold; preservatives; response surface methodology

TS255.3

A

1002-6630（2014）03-0071-05

10.7506/spkx1002-6630-201403015

2013-03-19

甘肅省應(yīng)用技術(shù)研究與開發(fā)專項計劃項目（1004TCYA039）；蘭州市高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)化項目（2011-1-34）

李漸鵬（1988—），男，碩士研究生，主要從事采后果蔬角質(zhì)層組分及結(jié)構(gòu)研究。E-mail：869746940@qq.com

*通信作者：李永才（1973—），男，副教授，博士，主要從事果蔬采后防腐保鮮技術(shù)研究。E-mail：liyongcai@gsau.edu.cn