孫 濤，李 銘，謝 晶，薛 斌，李 立

（上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海水產(chǎn)品加工儲藏工程研究中心，上海 201306）

槲皮素與葛根素對食品體系中非酶糖基化的抑制作用

孫 濤，李 銘，謝 晶，薛 斌，李 立

（上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海水產(chǎn)品加工儲藏工程研究中心，上海 201306）

通過對果糖胺、二羰基化合物、5-羥甲基糠醛（5-hydroxymethylfurfural，5-HMF）和熒光性末端產(chǎn)物的檢測，考察槲皮素和葛根素對食品體系非酶糖基化反應(yīng)的抑制作用。結(jié)果表明：槲皮素能促進(jìn)非酶糖基化早期產(chǎn)物果糖胺和5-HMF的生成，對反應(yīng)中期的二羰基化合物和非酶糖基化末端產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）具有較強(qiáng)的抑制作用；葛根素能促進(jìn)果糖胺的生成，抑制二羰基化合物的生成，對5-HMF和AGEs無影響。這可能與槲皮素與葛根素的結(jié)構(gòu)差異有關(guān)。

非酶糖基化；槲皮素；葛根素

非酶糖基化反應(yīng)，又稱美拉德反應(yīng)，是氨基化合物蛋白質(zhì)、氨基酸與羰基化合物還原糖之間發(fā)生的一系列非酶促反應(yīng)。非酶糖基化反應(yīng)使蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)而失去活性，生成不可逆的非酶糖基化末端產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）。生成于神經(jīng)髓鞘的AGEs可促發(fā)老年癡呆癥[1]；非酶糖基化反應(yīng)可使體內(nèi)膠原蛋白交聯(lián)化，導(dǎo)致動脈粥樣硬化[2]；AGEs亦為糖尿病及其并發(fā)癥的重要產(chǎn)生因素[3-4]。AGEs一般由體內(nèi)反應(yīng)生成或日常飲食攝入[5]。食品加工中，還原糖和氨基酸之間會發(fā)生復(fù)雜的非酶褐變反應(yīng)，促成某些特有的食品風(fēng)味和烹飪食品顏色的形成；但另一方面，非酶糖基化反應(yīng)會產(chǎn)生AGEs。抑制食品體系中非酶糖基化反應(yīng)反應(yīng)，從而減少食品體系中AGEs的生成是預(yù)防眾多疾病的有效途徑之一。目前的研究熱點(diǎn)是生理?xiàng)l件下抑制非酶糖基化反應(yīng)，而食品體系中抑制非酶糖基化的研究鮮有報道。

黃酮類化合物是一類重要的天然產(chǎn)物，其母核為2-苯基色原酮，具有清除自由基、抗癌以及防治心血管疾病等功效[6-8]。研究表明，蘆丁、槲皮素等黃酮類化合物對于生理?xiàng)l件下非酶糖基化反應(yīng)有較強(qiáng)的抑制作用[9-11]，但對于黃酮類化合物在食品體系中抑制非酶糖基化反應(yīng)的研究較少。本實(shí)驗(yàn)選取2種常見的黃酮類化合物：槲皮素和葛根素，考察其對果糖-谷氨酸非酶糖基化反應(yīng)的抑制作用，為抑制非酶糖基化的研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

槲皮素、葛根素 生工生物工程（上海）股份有限公司；氨基胍鹽酸鹽、5-羥甲基糠醛 梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；Girard-T試劑、氯化硝基四氮唑蘭 國藥化學(xué)試劑有限公司；D-葡萄糖、谷氨酸等其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DK-S28型恒溫水浴鍋 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；UV-2000紫外-可見分光光度計 尤尼科（上海）儀器有限公 司；RF-5301PC熒光分光光度計 日本島津株式會社；Waters2695高效液相色譜儀 沃特世科技（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 食品體系非酶糖基化反應(yīng)

配制含0.02 mol/L果糖與0.1 mol/L谷氨酸的pH 5.5、0.2 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液作為食品非酶糖基化體系[12]。分別添加槲皮素與葛根素，使其終濃度為1.0、3.0、5.0 mmol/L，作為非酶糖基化抑制體系。將混合溶液置于沸水浴中冷凝回流反應(yīng)，分別于3、6、9 h取樣并迅速冷卻，對果糖胺、二羰基化合物、5-HMF和熒光性末端產(chǎn)物進(jìn)行檢測。設(shè)置空白對照組和5.0 mmol/L氨基胍組作陽性對照。

1.3.2 果糖胺的測定

根據(jù)Jamnian等[13]的方法加以改動。取0.3 mL樣品溶液，添加3.0 mL 0.6 mmol/L NBT試劑和0.7 mL pH 10.35的NaHCO3-Na2CO3緩沖液，然后置于37 ℃水浴10 min，以緩沖液為參比于530 nm波長處測吸光度。按下式計算果糖胺抑制率。

果糖胺抑制率/%=（Ai－Aj）/Ai×100

式中：Ai為非酶糖基化體系的吸光度；Aj為非酶糖基化抑制體系的吸光度。

1.3.3 二羰基化合物的測定

根據(jù)Wells等[14]的方法加以改動。取0.5 mL樣品溶液，添加0.5 mLGirard-T試劑和7.0 mL pH 2.90的HCOOHHCOONa緩沖液，置于37 ℃水浴1 h后，以緩沖液為參比于295 nm波長處測吸光度。二羰基化合物抑制率計算公式同果糖胺。

1.3.4 5-羥甲基糠醛的測定[15]

采用Waters2695高效液相色譜儀（2998二極管陣列檢測器）測定5-羥甲基糠醛（5-HMF）的含量。測試條件如下：色譜柱：C18柱(Altantis T3，4.6 mm×150 mm，4 μm)；流動相：10%甲醇與90%水；流速：1.000 6 dL/min；柱溫：25 ℃。

1.3.5 熒光性糖基化產(chǎn)物的測定

取樣品溶液于激發(fā)波長370 nm、發(fā)射波長440 nm測定熒光強(qiáng)度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 槲皮素與葛根素對果糖胺生成的影響

表1 槲皮素與葛根素對果糖胺生成的影響Table 1 Effect of quercetin and puerarin on the formation of fructosaammiinnee

由表1可知，槲皮素以及葛根素對非酶糖基化反應(yīng)中果糖胺的生成皆有促進(jìn)作用，反應(yīng)時間為9 h，加樣濃度為5.0 mmol/L時槲皮素與葛根素對果糖胺的促進(jìn)率分別為50.2%、18.6%；同樣，氨基胍對果糖胺的生成也有促進(jìn)作用。

2.2 槲皮素與葛根素對二羰基化合物生成的影響

表2 槲皮素與葛根素對二羰基化合物生成的影響Table 2 Effect of quercetin and puerarin on the formation of α-dicarbonyl compounds

由表2可知，槲皮素以及葛根素對非酶糖基化反應(yīng)中二羰基化合物的生成皆有抑制作用，在反應(yīng)時間為9 h、樣品濃度為5.0 mmol/L時，槲皮素與葛根素對二羰基化合物的抑制率分別為23.1%和29.0%；同濃度氨基胍組有更好的抑制效果。

2.3 槲皮素與葛根素對5-HMF生成量的影響

由圖1可知，槲皮素對非酶糖基化反應(yīng)中5-HMF的生成具有促進(jìn)作用，而葛根素對5-HMF的生成無顯著影響。

圖1 槲皮素與葛 根素對5-HMF生成的影響Fig.1 Effect of quercetin and puerarin on the formation of 5-HMF

2.4 黃酮類化合物對熒光性非酶糖基化產(chǎn)物的影響

圖2 黃酮類化合物對熒光性末端產(chǎn)物生成的影響Fig.2 Effect of quercetin and puerarin on the formation of fluorescent AGEs

由圖2可知，葛根素對熒光 性末端產(chǎn)物的生成無影響，而槲皮素對熒光性末端產(chǎn)物的生成則有顯著的抑制作用，其抑制效果優(yōu)于氨基胍。

3 討 論

本研究使用果糖與谷氨酸模擬食品體系非酶糖基化反應(yīng)，通過對果糖胺、二羰基化合物、5-羥甲基糠醛和熒光性末端產(chǎn)物的檢測，考察了黃酮醇類槲皮素與異黃酮類葛根素對非酶糖基化反應(yīng)的抑制作用。結(jié)果表明，在非酶糖基化反應(yīng)早期，氨基化合物的氨基和還原糖的羰基發(fā)生親核加成反應(yīng)，生成非酶糖基化反應(yīng)的重要檢測指標(biāo)化合物之一果糖胺；同時還原糖還可發(fā)生分子內(nèi)脫水反應(yīng)降解成糠醛[16]。實(shí)驗(yàn)表明槲皮素和葛根素可促進(jìn)果糖胺的生成。隨后果糖胺經(jīng)過一系列異構(gòu)化反應(yīng)形成Amadori產(chǎn)物。在非酶糖基化反應(yīng)中期，Amadori產(chǎn)物經(jīng)過氧化、裂解、重排等反應(yīng)形成乙二醛、乙二酸、丙酮醛、3-脫氧葡萄糖酮醛等二羰基類中間產(chǎn)物[17]。而槲皮素及葛根素對食品體系非酶糖基化反應(yīng)體系中二羰基化合物表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用，這與生理?xiàng)l件下的研究結(jié)果相似[18]。此后非酶糖基化反應(yīng)進(jìn)入末期，二羰基化合物和糠醛等中間產(chǎn)物與氨基酸進(jìn)一步交聯(lián)成不可逆的熒光性末端產(chǎn)物。在本實(shí)驗(yàn)中槲皮素對非酶糖基化反應(yīng)熒光性末端 產(chǎn)物表現(xiàn)出顯著的抑制作用，且抑制作用強(qiáng)于氨基胍，此前生理?xiàng)l件下的研究結(jié)果也證明了這一點(diǎn)[19]。而葛根素對熒光性末端產(chǎn)物無顯著影響。Matsuda等[20]的研究表明，黃酮醇對AGEs的抑制能力強(qiáng)于異黃酮。槲皮素與葛根素分子中芳烴基的取代位置不同可能是導(dǎo)致其非酶糖基化抑制能力差異的原因。

槲皮素能促進(jìn)非酶糖基化早期產(chǎn)物果糖胺和5-HMF的生成，對反應(yīng)中期的二羰基化合物和末端熒光性產(chǎn)物（AGEs）具有較強(qiáng)的抑制作用，這表明槲皮素對非酶糖基化反應(yīng)的抑制作用發(fā)生在反應(yīng)的中后期階段；葛根素亦能促進(jìn)果糖胺的生成，但抑制二羰基化合物的生成，對5-HMF和末端熒光性產(chǎn)物無影響。本實(shí)驗(yàn)為食品體系非酶糖基化的預(yù)防及藥物治療提供了思路，槲皮素和葛根素對于非酶糖基化反應(yīng)的抑制機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

[1] MüNCHA G, THOME J, FOLEY P, et al. Advanced glycation endproducts in ageing and Alzheimer’s disease[J]. Brain Research Reviews, 1997, 23(1): 134-143.

[2] BASTA G, SCHMIDT A M, CATERINA R D. Advanced glycation end products and vascular infl ammation: implications for accelerated atherosclerosis in diabetes[J]. Cardiovascular Research, 2004, 63(4): 582-592.

[3] WEISS F M, ERHARD P, KADER-ATTIA F A, et al. Mechanisms for the formation of glycoxidation products in end-stage renal disease[J]. Kidney International, 2000, 57(6): 2571-2585.

[4] 周文郁. 非酶促蛋白糖基化及其與糖尿病并發(fā)癥[J]. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床, 1993, 13(3): 25-28.

[5] SUJI G, SIVAKAMI S. Glucose, glycation and aging[J]. Biogerontology, 2004, 5(6): 365-373.

[6] 延璽, 劉會青, 鄒永青, 等. 黃酮類化合物生理活性及合成研究進(jìn)展[J]. 有機(jī)化學(xué), 2008, 28(9): 1534-1544.

[7] 毛雪石. 黃酮類化合物的抗腫瘤活性[J]. 國外醫(yī)學(xué): 藥學(xué)分冊, 1995, 22(2): 92-96.

[8] 周俊, 周德生. 天然黃酮類化合物對心腦血管的藥理研究進(jìn)展[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志, 2010, 8(6): 725-727.

[9] PASHIKANTI S, ALBA D R, BOISSONNEAULT G A, et al. Rutin metabolites: novel inhibitors of nonoxidative advanced glycation end products[J]. Free Radical Biology and Medicine, 2010, 48(5): 656-663.

[10] LAUREAN D C, SCHRAMM D D, JACOBSON E L, et al. Inhibition of advanced glycation end product formation on collagen by rutin and its metabolites[J]. Journal of Nutritional Biochemistry, 2006, 17(8): 531-540.

[11] 張超. 地菍黃酮類化合物對入血清白蛋白Maillard反應(yīng)抑制作用的研究[J]. 中醫(yī)藥學(xué)刊, 2003, 21(11): 1891-1892.

[12] LAMBERTS L, ROMBOUTS I, DELCOUR J A. Study of nonenzymic browning in α-ami no acid and γ-aminobutyric acid/sugar model systems[J]. Food Chemistry, 2008, 111(3): 738-744.

[13] CHOMPOO J, UPADHYAY A, KISHIMOTO W, et al. Advanced glycation end products inhibitors from Alpinia zerumbet rhizomes[J]. Food Chemistry, 2011, 129(3): 709-715.

[14] WELLS K, ZYZAK D V, LITCHFIELD J E, et al. Mechanism of autoxidative glycosylation: identifi cation of glyoxal and arabinose as intermediates in autoxidative modifi cation of proteins by glucose[J]. Biochemistry, 1995, 34(11): 3702-3709.

[15] ARDA S, VURAL G, BUR?E A M. Effects of different grain mixtures on Maillard reaction products an d total antioxidant capacities of breads[J]. Journal of Food Composition and Analysis, 2012, 26(1): 160-168.

[16] T?MMERAAS K, V?RUM K M, CHRIS TENSEN B E, et al. Preparation and characterisation of oligosaccharides produced by nitrous acid depolymerisation of chitosans[J]. Carbohydrate Research, 2001, 333(2): 137-144.

[17] 肖和蘭, 徐喆, 蔡國平. 糖基化終產(chǎn)物AGEs的病理意義及其抑制性藥物開發(fā)原理的研究進(jìn)展[J]. 免疫學(xué)雜志, 2003(增刊1): 104-109.

[18] WU J W, HSIEH C L, WANG H Y, et al. Inhibitory effects of guava (Psidium guajava L.) leaf extracts and its active compounds on the glycation process of protein[J]. Food Chemistry, 2009, 113(1): 78-84.

[19] CHOMPOO J, UPADHYAY A, KISHIMOTO W, et al. Advanced glycation end products inhibitors from Alpinia zerumbet rhizomes[J]. Food Chemistry, 2011, 129(3): 709-715.

[20] MATSUDA H, WANG T, MANAGI H, et al. Structural requirements of fl avonoids for inhibition of protein glycation and radical sc avenging activities[J]. Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2003, 11(24): 5317-5323.

Inhibitory Effect of Flavonoid Compounds on Dietary Nonenzymatic Glycation

SUN Tao, LI Ming, XIE Jing, XUE Bin, LI Li
(Shanghai Engineering Research Center of Aquatic-product Processing and Preservation, College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

The inhibitory effects of the flavonoid compounds quercetin and puerarin on the formation of fructosamine, α-dicarbonyl compounds, 5-hydroxymethylfurfural (5-HMF) and fl uorescent advanced glycation end products (AGEs) from dietary nonenzymatic glycation were teste d. The results showed that quercetin could promote the formation of fructosamine and an early glycation product (5-HMF) but inhibit the formation of α-d icar bonyl compounds (an intermedate glycation product) and fl uorescent glycation end-products (AGEs). Puerarin could promote the formation of fructosamine, but inhibit the formation of α-dicarbonyl compounds, and had no infl uence on the formation of 5-HMF and fl uorescent AGEs. These results may be related to the different structures of quercetin and puerarin.

nonenzymatic glycation; quercetin; puerarin

TS201.2

A

1002-6630（2014）03-0047-03

10.7506/spkx1002-6630-201403010

2013-04-18

“十二五”國家科技支撐計劃項(xiàng)目（2012BAD38B04）

孫濤（1970—），女，副教授，博士研究生，研究方向?yàn)槭称窇?yīng)用化學(xué)。E-mail：taosun@shou.edu.cn