孫余省 朱冠保 陶禮鈞 方 軍 徐洪波 林 才

1.溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院創(chuàng)傷外科，浙江溫州 325000；2.溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院普外科，浙江溫州 325000；3.溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院燒傷科，浙江溫州 325000

殘胃癌亦稱胃術(shù)后胃癌， 占所有胃癌的0.35%～5.8%。 它常發(fā)生于胃大部切除后的殘胃內(nèi)，也可發(fā)生在單純胃腸吻合等術(shù)后的全胃內(nèi)。 胃大部切除術(shù)后20 年以上，殘胃癌發(fā)生率較一般人群高出6～7 倍[1-3]。迄今為止，其發(fā)病的分子機制仍然不明，也沒有好的早期診斷方法。 因此，尋找特異的分子標志和早期診斷方法，了解殘胃癌的發(fā)病機制對治療和預后的判斷都有非常重要的意義[4-6]。本研究采用雙向電泳技術(shù)分離殘胃癌組織與癌旁正常胃黏膜組織的所有蛋白質(zhì)，運用蛋白質(zhì)組學技術(shù)分析殘胃癌組織與癌旁組織之間蛋白質(zhì)組的表達差異， 尋找殘胃癌的特異性標志物，分析差異表達蛋白譜的變化與殘胃癌的發(fā)生發(fā)展之間的關(guān)系、規(guī)律，為全面闡明殘胃癌的發(fā)病機制和臨床殘胃癌篩查和診斷以及治療提供新的途徑。

1 材料與儀器

1.1 材料

1.1.1 標本采集

2010 年2 月～2011 年12 月取3 對殘胃癌及癌旁正常胃黏膜組織，均來自溫州醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院胃腸外科收治的經(jīng)手術(shù)切除的殘胃癌患者， 其中女2例，男1 例，年齡59～75 歲，平均67 歲。 3 例患者均經(jīng)術(shù)后病理學檢驗，確診為胃術(shù)后“吻合口”低分化腺癌。從腫瘤的非壞死組織中獲得殘胃癌組織作為觀察組， 并從患者距離原發(fā)腫瘤在5 cm 以上的胃黏膜層組織獲得正常組織作為對照組。 其中，所有癌旁正常胃黏膜組織標本均經(jīng)病理學檢驗，證實不存在癌細胞浸潤。 所有殘胃癌組織標本經(jīng)病理學檢驗，證實腫瘤浸潤僅穿透漿膜層。 待所有標本離體之后，立即予以取材，并利用生理鹽水沖洗多次之后放入液氮中。 將所有標本均置于-80°C 的環(huán)境下，儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑

固相pH 梯度干膠條 （13 cm， 寬pH 范圍）、IPG buffer 購自通用電氣醫(yī)療集團生命科學部；丙烯酰胺、甘氨酸、甲基雙丙烯酰胺均購自上海醫(yī)藥（集團）有限公司信誼制藥總廠；十二烷基硫酸鈉（SDS）購自湖北鴻運隆生物科技有限公司；尿素購自張家港豐達制藥有限公司；3-[3-（膽酰胺基丙基） 二甲氨基] 丙磺酸鹽、 過硫酸銨和N，N，N'，N'-四甲基乙二胺（TEMED）均購自北京瑞達恒輝科技發(fā)展有限公司；3-[（3-膽固醇氨丙基）二甲基氨基]-1-丙磺酸（CHAPS）、二硫蘇糖醇（DTT）均購自上海嶸崴達實業(yè)有限公司；碘乙酰胺購自武漢濟森醫(yī)藥化工有限公司；BCA 蛋白濃度試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；UPD-D 蛋白質(zhì)染料染色試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；UPD-蛋白質(zhì)染料染色試劑盒購自溫州安得森生物科技有限公司。

1.1.3 主要儀器

超聲波細胞粉碎機（購自寧波先倡電子科技有限公司）；IPGphorⅢ等電聚焦儀器 （購自上海將來實驗設備有限公司）；DYY-6C 雙穩(wěn)定時電泳儀（購自安徽東南儀誠實驗室設備有限公司）；脫色搖床[購自創(chuàng)博環(huán)球（北京）生物科技有限公司]；冷凍臺式高速離心機 （購自江蘇省金壇市恒豐儀器制造有限公司）；SDS-PAGE 垂直電泳儀（購自北京君意東方電泳設備有限公司）；Powerlook 2100XL 掃描儀[購自世群國際貿(mào)易（上海）有限公司]，ImageMaster 2D platinum 6.0圖像分析軟件（購自通用電氣醫(yī)療系統(tǒng)貿(mào)易發(fā)展上海有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 提取組織總蛋白

將組織標本100 mg 快速浸于液氮之中， 充分研磨，達到粉末狀后，加入裂解液（7 mol/L 尿素，2 mol/L硫脲，4%CHAPS，40 mmol/L Tris，0.5% TritonX-100，65 mmol/L DTT，0.5%pharmalyte，1%蛋白 酶抑 制 劑cocktail）1 mL。 予以渦旋振蕩，達到混勻充分之后，置冰上進行1 h 裂解。應用超聲細胞破碎儀處理10 min，避免出現(xiàn)氣泡， 然后以15 000 r/min，4℃進行30 min離心。 組織總蛋白質(zhì)提取液即為最終的上清液。 利用BCA 試劑盒對蛋白的濃度進行檢測， 并進行分裝，然后置于-80℃環(huán)境下存放備用[7]。

1.2.2 凝膠電泳

1.2.2.1 水化上樣 從水化盤槽的邊緣， 從左至右，線性加入250 μL 樣品。取出存放在冰箱中的IPG 膠條，置于室溫環(huán)境下10 min。 然后將膠條膠面朝下，輕輕放置在水化盤中的樣品溶液上。靜置30～45 min，待膠條吸收大部分樣品之后， 將礦物油沿膠條緩慢加入。每根膠條（17 cm IPG）在3 mL 左右，避免水化過程中液體蒸發(fā)。 將等電聚焦儀于-20℃予以11～15 h 水化。

1.2.2.2 第一向等電聚焦 于聚焦盤的正負極上放置紙電極置，加5～8 μL ddH2O 進行潤濕。取出水化完畢的IPG 膠條，放在聚焦盤中。 并利用2～3 mL 礦物油覆蓋每根膠條。對等電聚焦程序進行設置，具體如下：50 V，4 h；100 V，3 h；500 V，1 h；1000 V，1 h；5000 V，1 h；8000～50 000 V，10 h，重復3 次。 待聚焦結(jié)束之后，將膠條置于樣品水化盤中， 并放在-20℃的冰箱中保存?zhèn)溆?，或者立即對膠條予以平衡。電泳之前，將膠條取出，并放置在室溫環(huán)境下予以溶解。

1.2.2.3 第二向SDS-PAGE 電泳 IPG 膠條分別置于10 mL 平衡緩沖液Ⅰ（6 mol/L 尿素，2%SDS，0.05mol/L Tris-HCl， pH 8.8， 30% 甘油包含2%二硫蘇糖醇）和平衡緩沖液Ⅱ（250 mg 碘乙酰胺的平衡液）搖床上各平衡15 min，在1×電泳緩沖液中漂洗數(shù)次，然后安放在12%的丙烯酰胺凝膠上，加入低熔點瓊脂糖封膠液封閉。先進行10 mA/17 cm，15℃電泳。仔細觀察，在樣品在全部走出IPG 膠條并濃縮為一條線之后， 增大電流強度，保持在20～30 mA/17 cm。 再次予以觀察，如果溴酚藍指示劑到達底部邊緣，即表示電泳完成[8]。

1.2.2.4 染色 利用UPD-蛋白質(zhì)染料染色試劑盒進行染色。在完成電泳之后，對凝膠予以小心的剝離，并置于蒸餾水中進行漂洗，并嚴格參照產(chǎn)品說明書中的具體步驟染色。

1.2.2.5 掃描分析圖像 利用光密度投射模式完成掃描，并以TIF 格式予以妥善保存。 利用分析軟件對圖像予以分析。比較3 塊重復的膠圖，合成標準圖譜。采用軟件進行兩兩對比分析，如果表達量差距在2 倍以上，則視為存在明顯的差異表達，并得出差異表達蛋白點的具體數(shù)據(jù)[9]。

2 結(jié)果

2.1 蛋白雙向凝膠電泳

對3 對殘胃癌和癌旁組織分別進行了多次重復雙向凝膠電泳，選取背景清晰、分辨率高、無扭曲、拖帶的膠圖各3 張， 共18 張進行分析。 利用Image-Master 2D platinum 6.0 軟件進行分析之后可得，癌旁組織平均984 個蛋白點， 殘胃癌組織凝膠平均1068個蛋白點。 進行多對兩兩比較之后可得，在匹配的蛋白點方面，癌旁組織一共有883 個蛋白點，殘胃癌組織一共有886 個蛋白點。癌旁組織和殘胃癌組織的平均匹配率分別為89.8%和81.8%。 殘胃癌組織和癌旁組織的蛋白雙向電泳凝膠圖見圖1。18 塊凝膠的蛋白點統(tǒng)計情況見表1。

圖1 2-D 電泳凝膠圖

表1 18 塊凝膠的蛋白點統(tǒng)計

2.2 殘胃癌組織中差異表達的蛋白情況

通過膠圖比對和軟件分析，將所有殘胃癌組織的膠圖合成一個虛擬膠圖，同樣所有癌旁組織膠圖也合成為一個虛擬對照膠圖，再進行比較。 在殘胃癌組織和癌旁正常胃黏膜組織中發(fā)現(xiàn)兩者間共有112 個差異表達的蛋白點，其中顯著差異（表達差異2 倍以上）的蛋白點42 個。 在這42 個蛋白點之中，在殘胃癌組織里表達上調(diào)的一共有17 個點； 在殘胃癌組織里表達下調(diào)的一共有14 個點； 在殘胃癌組織中失表達的一共有8 個點；僅在殘胃癌組織中表達的一共有3 個點。 部分差異表達蛋白見圖2。

3 討論

機體的各種正常生命活動或者異常的疾病發(fā)生過程都是各種復雜因素相互作用的結(jié)果，其中以各種蛋白質(zhì)的相互作用最為重要，因為蛋白質(zhì)是生命的組成和生命活動的物質(zhì)基礎[10-11]。 全面研究各種蛋白質(zhì)在疾病的發(fā)生過程中的變化比單一研究某個蛋白的作用無疑具有更大的優(yōu)勢，更能準確、全面了解真實的疾病發(fā)生原理。 1994 年，“蛋白質(zhì)組（proteome）”概念誕生。 該概念是由澳大利亞學者Williams 以及Wilkins 經(jīng)過大量的研究提出的，并認為蛋白質(zhì)組指的是對一種組織或者細胞中所有蛋白質(zhì)的相關(guān)研究[12]。隨著現(xiàn)代研究的不斷深入，蛋白質(zhì)組相關(guān)理論研究和技術(shù)水平等都得到了較大的發(fā)展，被廣泛應用于對各種疾病的發(fā)生和發(fā)展的研究之中，成為一種重要的研究工具， 尤其是在人類基因組計劃完成之后，“組學”研究更是成為生命科學的重要研究方向。在功能基因組以及后基因組的研究過程中，蛋白質(zhì)組的研究又顯得尤其重要，因為蛋白質(zhì)才是絕大數(shù)基因功能的最終執(zhí)行者[13]。 目前國際國內(nèi)對胃癌的研究中，有許多的學者都已經(jīng)采用蛋白質(zhì)組學技術(shù)在蛋白水平上大規(guī)模的研究腫瘤特異性的蛋白表達變化，如國內(nèi)學者Li等[8]2008 通過蛋白質(zhì)組研究發(fā)現(xiàn)胃癌組織中表達上調(diào)的蛋白主要集中在：①轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白，如鋅指蛋白；②信號轉(zhuǎn)導蛋白，如G 蛋白信號3 蛋白（RGS3）；③腫瘤相關(guān)蛋白，如ras 相關(guān)蛋白；④細胞骨架蛋白，如大皰性類天皰瘡抗原1。 一些學者也做過類似的胃癌比較，發(fā)現(xiàn)了很多類型的胃癌中表達上調(diào)的蛋白，例如轉(zhuǎn)膠蛋白和熱休克蛋白27 及其異構(gòu)體， 以及抗增殖蛋白和NSP3， 還有葡萄糖代謝相關(guān)蛋白以及二硫化物異構(gòu)酶A3 蛋白等。 而表達上調(diào)的蛋白也有很多類型，例如P20 和二磷酸核酸異構(gòu)酶A，以及載脂蛋白A-1 和抗胰蛋白酶等。 另外，血清轉(zhuǎn)鐵蛋白是表達下調(diào)的蛋白[14]。

目前針對殘胃癌組織與癌旁組織的蛋白質(zhì)組研究還未見報道。本研究在提取殘胃癌組織蛋白的過程中，筆者予以了適當?shù)奶崛?yōu)化，即將組織標本快速浸于液氮之中，充分研磨，達到粉末狀后，加入裂解液，并予以渦旋振蕩，達到混勻充分。這樣的提取過程可以對蛋白質(zhì)的溶解性予以改善。 同時在裂解處理后，采用超聲破碎處理，克服提取液中由于包含基因組DNA 而比較黏稠，會影響后期電泳結(jié)果，造成拖帶現(xiàn)象的缺點[15]。 研究結(jié)果顯示，2-D 膠圖上背景較少，蛋白質(zhì)點清晰，重復性較好，達到進一步分析的要求。另外，在研究蛋白質(zhì)組的過程中，凝膠蛋白質(zhì)染色技術(shù)會對最終的質(zhì)譜分析等產(chǎn)生較大的影響。 因此，研究過程中，還需要做好染色環(huán)節(jié)。本研究中，筆者即利用UPD-蛋白質(zhì)染料染色試劑盒進行染色。 在完成電泳之后，對凝膠予以小心的剝離，并置于蒸餾水中進行漂洗，嚴格參照產(chǎn)品說明書中的具體步驟染色。

圖2 殘胃癌組織中差異表達的蛋白情況

同時，本研究采用以相同的實驗條件、相同的試劑和實驗參數(shù)同時研究癌組織和癌旁組織，從凝膠圖譜上看，具有很好的重復性和可比性，也證明了雙向電泳技術(shù)分離蛋白質(zhì)的效果良好，是研究癌癥組織蛋白質(zhì)組的有力工具。本研究的第一向等電聚焦采用了pH 3～10 的IPG 膠條，基本上覆蓋了絕大部分的殘胃癌組織和癌旁組織表達的蛋白質(zhì)譜，能夠全面反映其蛋白質(zhì)組的分布。但是，在膠圖中也發(fā)現(xiàn)，大部分的蛋白質(zhì)多集中在pH 5～8 之間， 給具體的分析過程帶來一定的難度。于是，分析的過程中，高豐度表達的蛋白可能會對于低豐度表達的一部分蛋白質(zhì)造成不同程度的掩蓋。 因此，進一步的研究應該繼續(xù)采用高分辨的窄pH 范圍的膠條，比如pH 3～8， pH 7～10 的膠條來做進一步的分離。雙向電泳分離蛋白質(zhì)只是蛋白質(zhì)組研究的第一步，下一步應該采用各種蛋白酶切加質(zhì)譜分析技術(shù)， 例如MALDI-TOF-MS 等來對出現(xiàn)差異表達的蛋白點代表什么蛋白質(zhì)予以進一步的鑒定，并進一步分析其代謝途徑和信號通路， 即所謂的Pass way 分析。 通過更加深入的分析研究，爭取了解疾病的發(fā)病機制，才能進一步發(fā)現(xiàn)新的治療策略和診斷方法[16]。 總之，在各種人類重大疾病的預防診治研究過程中，蛋白質(zhì)組學是一個十分重要的研究課題，可以提高人們“全景式”病理機制認識水平。 另外，關(guān)于蛋白質(zhì)組學的研究還具有極強的研究前景，各種新型藥物靶標與藥物的研發(fā)將會給各種疾病患者帶來巨大的福音，并為各種疾病對治療提供新的思路。

綜上所述，利用雙向電泳蛋白質(zhì)組技術(shù)對殘胃癌組織進行研究，可以獲得質(zhì)量良好的胃癌組織蛋白質(zhì)組雙向電泳圖譜，應用效果良好。

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