左長(zhǎng)清 鐘月春 汪宗桂 戴 忠 吳 鐵

1.廣東醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，廣東東莞 523808；2.廣東醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室，廣東東莞 523808

骨質(zhì)疏松癥是世界范圍內(nèi)的常見(jiàn)病、多發(fā)病。 促進(jìn)間質(zhì)干細(xì)胞成骨定向分化與成熟是治療骨質(zhì)疏松癥的新的有效手段。白藜蘆醇是一種含有芪類結(jié)構(gòu)非黃酮類多酚化合物，具有促進(jìn)間質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞方向分化，并抑制間質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化潛能[1]，但白藜蘆醇促成骨分化機(jī)制尚未完全闡明。

間質(zhì)干細(xì)胞成骨分化是一個(gè)非常復(fù)雜的生物過(guò)程[2]，涉及到多基因、多信號(hào)通路組成的復(fù)雜基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。 筆者前期通過(guò)網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)方法研究發(fā)現(xiàn)CXCL12、EGFR 和CCL2 基因在重組人骨形成蛋白2（rhBMP-2）成骨分化網(wǎng)絡(luò)中處于中心節(jié)點(diǎn)[3]。 本文應(yīng)用C3H10T1/2 間質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)體系， 觀察白藜蘆醇對(duì)rhBMP-2 促成骨分化作用及對(duì)CXCL12、EGFR 和CCL2 基因表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠間質(zhì)干細(xì)胞C3H10T1/2 購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。白藜蘆醇（Sigma），rhBMP-2（Human Zyme），napthol AS-MX phosphate 和Fast Blue BB salt（Sigma），TRIzol（Invitrogen），RT-PCR Kit（TaKaRa），CCK-8（Dojindo）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 CCK-8 法檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞增殖功能的影響C3H10T1/2 細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合，用含0.25%胰酶的消化液消化，制成細(xì)胞懸液，以3000 個(gè)細(xì)胞/孔接種于96 孔板內(nèi)，37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 24 h 細(xì)胞貼壁后，更換含不同濃度白藜蘆醇（分別為0、5、10、20、40、80、100 μmol/L） 的DMEM 培養(yǎng)液100 μL，細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后， 每孔加入10 μL CCK-8 溶液，培養(yǎng)箱中孵育2 h，以多功能酶標(biāo)儀讀取波長(zhǎng)450 nm處的OD 值。 按下述公式計(jì)算細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率：細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（%）＝（1－用藥組平均吸光度/對(duì)照組平均吸光度）×100% 。

1.2.2 堿性磷酸酶染色鑒定成骨分化 C3H10T1/2 接種于24 孔板中，細(xì)胞生長(zhǎng)至約90%融合，實(shí)驗(yàn)分為三組：空白對(duì)照組、300 ng/mL rhBMP-2 組、20 μmol/L白藜蘆醇+300 ng/mL rhBMP-2 組，每3 天更換1 次培養(yǎng)基。當(dāng)成骨誘導(dǎo)分化6 d 后，單層細(xì)胞用PBS 清洗2次，然后用體積分?jǐn)?shù)為0.70 乙醇室溫固定15 min，采用含0.1 mg/mL napthol AS-MX phosphate 和0.6 mg/mL Fast Blue BB salt 染色液避光染色30 min， 用蒸餾水漂洗細(xì)胞3 次，倒置顯微鏡下觀察并拍照記錄。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測(cè)CXCL12、EGFR 和CCLl2 mRNA 的表達(dá) C3H10T1/2 細(xì)胞接種至12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，20 μmol/L 白藜蘆醇處理48 h 后，Trizol 法提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)PrimeScriptTMRT reagent Kit 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)制備cDNA，real time PCR 檢測(cè)CXCL12、EGFR和CCL2 mRNA 的表達(dá)，采用GAPDH 基因作為內(nèi)參照，引物序列見(jiàn)表1。 采用2-ΔΔCt表示基因相對(duì)表達(dá)水平。

表1 定量RT-PCR 引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析， 計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析， 組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)，以P < 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 白藜蘆醇對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

白藜蘆醇在低劑量組（5、10、20 μmol/L）對(duì)C3H10T1/2間質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)沒(méi)有明顯影響， 既不能促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，同時(shí)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)也沒(méi)有明顯的抑制作用，隨著劑量增大至40 μmol/L 時(shí)，白藜蘆醇對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生明顯的生長(zhǎng)抑制作用，當(dāng)劑量達(dá)到80～100 μmol/L 時(shí)，生長(zhǎng)抑制率達(dá)到84%。表明高劑量的白藜蘆醇具有明顯的細(xì)胞毒性。 因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用20 μmol/L 白藜蘆醇。見(jiàn)表2。

表2 不同濃度白藜蘆醇對(duì)C3H10T1/2 間質(zhì)干細(xì)胞增殖的影響（±s，n = 4）

表2 不同濃度白藜蘆醇對(duì)C3H10T1/2 間質(zhì)干細(xì)胞增殖的影響（±s，n = 4）

注：與0 μmol/L 比較，**P < 0.05；“-”表示基本無(wú)抑制，未計(jì)算該數(shù)據(jù)

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2.2 白藜蘆醇對(duì)rhBMP-2 促成骨分化影響

C3H10T1/2 間質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)成骨誘導(dǎo)分化6 d 堿性磷酸酶染色顯示： 空白對(duì)照組細(xì)胞未見(jiàn)藍(lán)紫色；300 ng/mL rhBMP-2 組細(xì)胞呈藍(lán)紫色， 提示rhBMP-2能誘導(dǎo)間質(zhì)干細(xì)胞早期成骨定向分化； 而300 ng/mL rhBMP-2+20 μmol/L 白藜蘆醇組ALP 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增多，且ALP 顏色增深。 表明非毒性劑量下，20 μmol/L 白藜蘆醇能增強(qiáng)rhBMP-2 促成骨分化作用。 見(jiàn)圖1。

圖1 C3H10T1/2 間質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)6 d 堿性磷酸酶染色

2.3 白藜蘆醇對(duì)CXCL12、EGFR 和CCL2 mRNA 表達(dá)的影響

前期筆者通過(guò)網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)對(duì)rhBMP-2 誘導(dǎo)C3H10T1/2 成骨分化基因表達(dá)譜進(jìn)行分析， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CXCL12、EGFR 和CCL2 基因在rhBMP-2 成骨分化網(wǎng)絡(luò)中處于中心節(jié)點(diǎn)。為了鑒定白藜蘆醇促成骨分化作用是否通過(guò)影響rhBMP-2 成骨分化網(wǎng)絡(luò)， 本研究用20 μmol/L 白藜蘆醇處理C3H10T1/2 細(xì)胞48 h后，觀察上述基因表達(dá)水平。 結(jié)果表明：白藜蘆醇處理組CXCL12、EGFR 和CCL2 表達(dá)水平分別為 （1.02±0.09）、（1.03±0.05）、（1.10±0.11），與對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。 見(jiàn)圖2。

圖2 白藜蘆醇對(duì)C3H10T1/2 細(xì)胞CXCL12、EGFR 和CCL2 mRNA表達(dá)的影響

3 討論

rhBMP-2 是一種被FDA 批準(zhǔn)的重要促成骨藥物，目前已在臨床尤其是整形外科領(lǐng)域廣泛使用[4]。眾多研究表明，rhBMP-2 具有非常明顯的促進(jìn)間質(zhì)干細(xì)胞、 前體成骨細(xì)胞骨向分化作用[5-7]。 本研究采用300 ng/mL rhBMP-2 作用C3H10T1/2 間質(zhì)干細(xì)胞6 d，ALP 染色表明，rhBMP-2 能誘導(dǎo)C3H10T1/2 間質(zhì)干細(xì)胞早期成骨分化，與前述研究結(jié)果一致。

系統(tǒng)生物網(wǎng)絡(luò)揭示： 復(fù)雜疾病不能通過(guò)干預(yù)單一靶點(diǎn)而奏效， 必須通過(guò)干擾疾病生物網(wǎng)絡(luò)多個(gè)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。 研究藥物干擾疾病網(wǎng)絡(luò)，形成了藥理學(xué)一個(gè)新興的分支——網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)或網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)[8-9]。 前期筆者通過(guò)網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)方法對(duì)rhBMP-2 誘導(dǎo)C3H10T1/2 成骨分化基因表達(dá)譜進(jìn)行分析， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CXCL12、EGFR 和CCL2 基因在rhBMP-2 成骨分化網(wǎng)絡(luò)中處于中心節(jié)點(diǎn)。 目前已經(jīng)證明EGFR 信號(hào)參與骨原始細(xì)胞群維持、成骨分化平衡調(diào)控[10]，同時(shí)與前體成骨細(xì)胞活性和增殖[11]相關(guān)。而CXCL12 信號(hào)參與骨形成和骨吸收調(diào)控[12]。 最近表明BMP-9 誘導(dǎo)間質(zhì)干細(xì)胞成骨分化早期和中期，CXCL12 信號(hào)軸發(fā)揮重要作用[13]。

綜觀目前國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展， 關(guān)于白藜蘆醇促成骨作用機(jī)制主要涉及到ERK1/2 信號(hào)通路[14]、WNT 信號(hào)通路[15]，同時(shí)通過(guò)激活Sirt1/Runx2[16]或者抑制PPAR2活性，從而抑制干細(xì)胞成脂分化，促進(jìn)成骨分化[1]。 但是，間質(zhì)干細(xì)胞成骨分化涉及到多基因、多信號(hào)通路組成的復(fù)雜基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)， 白藜蘆醇在整個(gè)成骨分化復(fù)雜生物網(wǎng)絡(luò)中起到怎樣的調(diào)控作用， 目前知之甚少。本研究采用20 μmol/L 白藜蘆醇聯(lián)合rhBMP-2作用C3H10T1/2 細(xì)胞， 結(jié)果表明白藜蘆醇具有促進(jìn)rhBMP-2 的成骨誘導(dǎo)作用。 進(jìn)一步分析白藜蘆醇對(duì)rhBMP-2 成骨分化網(wǎng)絡(luò)中心節(jié)點(diǎn)CXCL12、EGFR 和CCL2 的影響，結(jié)果表明白藜蘆醇對(duì)上述基因表達(dá)沒(méi)有明顯的作用。 這說(shuō)明白藜蘆醇促成骨分化作用可能不是通過(guò)調(diào)控CXCL12、EGFR 和CCL2 網(wǎng)絡(luò)接點(diǎn)來(lái)實(shí)現(xiàn)。分析原因可能是：①在BMP-2 成骨分化網(wǎng)絡(luò)中，存在其他重要節(jié)點(diǎn)，白藜蘆醇可能通過(guò)影響其他網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)發(fā)揮作用； ②筆者僅僅分析了rhBMP-2 促成骨蛋白互作網(wǎng)絡(luò)， 對(duì)于rhBMP-2 更加復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，由于需要更多時(shí)間點(diǎn)基因芯片數(shù)據(jù)，沒(méi)有進(jìn)行分析；③成骨分化是一個(gè)動(dòng)態(tài)的時(shí)續(xù)過(guò)程，網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)也會(huì)根據(jù)分化程度發(fā)生部分時(shí)續(xù)改變。

綜上， 本研究證明低劑量白藜蘆醇能增強(qiáng)rhBMP-2 成骨分化作用，在臨床上，可以聯(lián)合應(yīng)用增強(qiáng)療效， 同時(shí)對(duì)白藜蘆醇作用進(jìn)行了初步網(wǎng)絡(luò)分析。隨著研究深入，芯片數(shù)據(jù)量的增加，技術(shù)成熟，可以進(jìn)一步對(duì)轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、時(shí)續(xù)動(dòng)態(tài)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，從而進(jìn)一步解析白藜蘆醇促成骨分化機(jī)制。[1] Backesja CM，Li Y，Lindgren U，et al. Activation of Sirt1 Decreases Adipocyte Formation during Osteoblast Differentiation of Mesenchymal Stem Cells [J]. Cells Tissues Organs，2009，189（1-4）：93-97.

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