成炳祥 方 煊 朱承良 秦運(yùn)升 莊 莉

1.浙江省紹興第二醫(yī)院外科，浙江紹興 312000；2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院肝膽外科，浙江杭州 310003

肝癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，其進(jìn)展迅速，對(duì)放化療不敏感，手術(shù)切除后易轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)，因而在我國惡性腫瘤的病死率中，肝癌占第2 位[1]。索拉菲尼是一種新型的口服多激酶抑制劑，其通過對(duì)Raf/絲裂原活性蛋白激酶/細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路（Raf/MEK/ERK）和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體（VEGFR）-1，2，3 等通路的抑制調(diào)控，從而發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞增殖和阻斷腫瘤新生血管形成的雙重抗腫瘤作用[2-3]。 目前臨床研究證實(shí)，索拉非尼的使用可以有效提高肝癌患者的生存時(shí)間[4-5]。miRNA 是近年來發(fā)現(xiàn)的一類廣泛存在于人體中，不編碼蛋白質(zhì)的短序列RNA（20～25 nt），在細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡、干細(xì)胞分化、胚胎后期發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[6-7]。 值得關(guān)注的是，miRNAs 表達(dá)譜和表達(dá)水平在肝癌腫瘤組織和患者血清中均出現(xiàn)較明顯的變化，提示miRNA 對(duì)于肝癌的發(fā)生和發(fā)展中起著非常重要的作用[8]。本研究采用miRNA 芯片技術(shù)檢測(cè)索拉菲尼治療前后對(duì)肝癌患者血清中腫瘤相關(guān)miRNA 表達(dá)譜改變情況，為進(jìn)一步研究索拉菲尼治療肝癌的機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2011 年10 月～2012 年9 月在紹興第二醫(yī)院及浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院接受治療的6 例肝癌患者的血清樣本。所有患者均經(jīng)組織病理學(xué)檢測(cè)證實(shí)為肝細(xì)胞肝癌，診斷均符合2001 年肝癌臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)和臨床分期。所選病例應(yīng)同時(shí)滿足以下條件：不適合手術(shù)治療，體力狀況ECOG 評(píng)分≤2 分，Child-Pugh評(píng)分A、B 級(jí)，預(yù)計(jì)生存時(shí)間>12 周，血小板（PLT）≥60×109/L，血紅蛋白（Hb）≥85 g/L，谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）≤正常值上限3 倍以內(nèi)。本組研究對(duì)象中男4 例，女2 例，平均年齡（52.6±14.8）歲；腫瘤直徑8.7～15.4 cm；病灶數(shù)目1～3 個(gè)，其中單發(fā)2 例、多發(fā)4 例；甲胎蛋白（AFP）平均值（837.42±178.75）ng/mL。

1.2 主要試劑和儀器

mirVanaTMmiRNA Isolation Kit （Ambion 公司，美國）；miScript Reverse Transcription Kit （Qiagen 公司，德國）；SYBR Green I（10000×）和PlatinumTaq DNA聚合酶（Invitrogen 公司，美國）；MMLV 反轉(zhuǎn)錄酶和RNA 酶抑制劑（epicentre 公司，美國）；miRNA 芯片由丹麥Exiqon 公司制作，上海康成生物工程有限公司代理；DU-730 紫外分光光度計(jì)和PRISM 7900 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（ABI 公司，美國）；miR-122 及U6 引物序列由閱微基因技術(shù)有限公司合成。

1.3 藥物干預(yù)

索拉非尼（商品名：多吉美，拜耳公司；批號(hào)：H20060296）采用統(tǒng)一的給藥方式，400 mg/次，2 次/d，口服，服藥前禁食2 h。比較患者服藥前和服藥1 個(gè)月后各項(xiàng)指標(biāo)。

1.4 血清樣本的收集

所有患者服藥前和服藥1 個(gè)月后空腹采集外周靜脈血5 mL，室溫下靜置60 min。然后在4℃，3000 r/min條件下離心15 min，取上清（血清）保存于-80°C 冰箱待下一步實(shí)驗(yàn)。

1.5 miRNA 表達(dá)譜芯片檢測(cè)

①總RNA 和miRNA 的提取按照mirVanaTMmiRNA Isolation Kit 和mirVanaTMRNA Isolation Kit 說明書步驟進(jìn)行操作。 DU-730 紫外分光光度計(jì)進(jìn)行RNA 定量，1.5%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量。 ②制備熒光標(biāo)記探針：采用miRCURYTM Array Power 標(biāo)記試劑盒，用標(biāo)記酶將Hy3TM：熒光基團(tuán)標(biāo)記miRNA 制備熒光標(biāo)記探針。 ③miRNA 芯片雜交、圖像掃描和數(shù)據(jù)分析：在標(biāo)準(zhǔn)條件下將制備好的熒光標(biāo)記探針和miRCURYTM芯片放入PhalanxTM的熱收縮雜交袋進(jìn)行雜交。 使用GenePix 4000B 芯片掃描儀對(duì)雜交好的芯片進(jìn)行掃描并收集熒光強(qiáng)度信號(hào)，圖像生成后使用Genepix Pro 6.0 軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析運(yùn)算，并將實(shí)驗(yàn)結(jié)果轉(zhuǎn)換成數(shù)字型數(shù)據(jù)保存。芯片實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析軟件MeV4.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，計(jì)算兩種檢測(cè)信號(hào)的比值（log2）。

1.6 Real time RT-PCR 驗(yàn)證

基于芯片結(jié)果對(duì)miR-122 進(jìn)行驗(yàn)證。采用stem-loop進(jìn)行miRNA 逆轉(zhuǎn)錄。 反應(yīng)條件如下：16℃，30 min；42℃，40 min；85°C，5 min。 采用Sybergreen Ⅰ方法進(jìn)行Realtime PCR 反應(yīng)。 按以下程序進(jìn)行擴(kuò)增：95℃，10 min；40 個(gè)PCR 循環(huán)（95℃，15 s；60℃，60 s），擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后繼續(xù)從72°C 緩慢加熱到99℃以建立PCR產(chǎn)物的熔解曲線（每5 秒升高1℃），實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，以U6 snRNA 作為內(nèi)參，數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT法對(duì)miR-122的表達(dá)進(jìn)行分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 13.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩獨(dú)立樣本的計(jì)量資料采用t 檢驗(yàn)。 以P < 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miRNA 表達(dá)譜差異情況

所有血清樣本中提取的RNA，通過紫外定量和瓊脂糖凝膠電泳分析顯示RNA 完整性較好， 質(zhì)量符合要求芯片檢測(cè)的要求。 miRNA 芯片內(nèi)置約1700 個(gè)miRNA 捕獲探針，通過應(yīng)用SAM 軟件分析miRNA 表達(dá)譜芯片，結(jié)果顯示，同治療前相比，服用索拉非尼1個(gè)月后肝癌患者血清miRNA 表達(dá)譜中存在16 個(gè)明顯上調(diào)的miRNAs 和10 個(gè)明顯下調(diào)的miRNAs；特別是miR-122，其表達(dá)上升幅度大于10 倍。 見表1。

2.2 Real-time RT-PCR 驗(yàn)證miR-122

以U6 snRNA 為內(nèi)參，通過Real-time RT-PCR檢測(cè)索拉非尼治療前后肝癌患者血清中的miR-122表達(dá)水平的差異。 結(jié)果顯示，治療前肝癌患者血清miR-122 相對(duì)表達(dá)值為（1.07±0.32），索拉非尼治療1個(gè)月后肝癌患者血清中的miR-122 相對(duì)表達(dá)值為（9.10±1.89），較治療前表達(dá)水平顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），與芯片的結(jié)果一致。 見圖1。

表1 索拉菲尼治療前后肝癌患者血清中miRNAs 表達(dá)改變

圖1 RT-PCR 檢測(cè)miR-122 在索拉菲尼治療前后肝癌患者血清中的表達(dá)

3 討論

索拉非尼是拜耳公司和ONYX 公司共同研制的一種小分子多靶點(diǎn)的生物靶向治療新藥。 2005 年首次被美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)用于治療晚期腎細(xì)胞癌。此后，臨床研究發(fā)現(xiàn)，索拉非尼可以顯著提高晚期肝癌患者的生存時(shí)間[9]。因此，索拉非尼已被FDA 和我國原國家食品藥品監(jiān)督管理局（SFDA）批準(zhǔn)為治療晚期肝細(xì)胞癌唯一有效的分子靶向藥[4]。

索拉非尼治療惡性腫瘤的作用機(jī)制復(fù)雜，主要通過作用于多靶點(diǎn)實(shí)現(xiàn)抑制腫瘤增殖及新血管形成，從而達(dá)到殺傷腫瘤的目的。 主要包括：抑制位于腫瘤血管生成信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑的上游及腫瘤細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑的上游的Raf/絲裂原活性蛋白激酶/細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路（Raf/MEK/ERK）；抑制人VEGFR-1，2，3、血小板衍生生長(zhǎng)因子受體 （PDGFR）-β、FMS 樣酪氨酸激酶3（FLT3）和c-Kit 原癌基因的酪氨酸激酶活性；抑制Mcl-1 基因翻譯，c-Kit 蛋白以及致癌性RET 受體酪氨酸激酶等[10-11]。然而，索拉非尼抗惡性腫瘤的作用機(jī)制尚未完全闡明。

miRNA 是新近發(fā)現(xiàn)的一類廣泛影響/調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)的各種細(xì)胞生物學(xué)過程和調(diào)節(jié)途徑的小RNA 分子。大量的研究證實(shí)，miRNA 在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸中起著非常重要的作用[12]，惡性腫瘤患者腫瘤組織和血清中miRNAs 的表達(dá)往往是失調(diào)的，且這種異常改變與腫瘤的形成、生長(zhǎng)、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移以及預(yù)后是密切相關(guān)的[8，13]。

miR-122 是目前證實(shí)的在肝細(xì)胞中特異性高表達(dá)的一種miRNA，其前體定位于人類18 號(hào)染色體18q21.31 上，是來源于hcr 基因轉(zhuǎn)錄本且肝臟中特異性高表達(dá)的一種miRNA。 生理狀態(tài)下，miR-122 在調(diào)控肝臟的細(xì)胞發(fā)育、調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝和誘導(dǎo)細(xì)胞分化等生命活動(dòng)過程中發(fā)揮重要作用[14]。研究顯示，miR-122與肝癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。 肝癌細(xì)胞中miR-122 的表達(dá)明顯下調(diào)，其在肝癌的發(fā)生發(fā)展中表現(xiàn)出抑癌基因的功能。 Cyclin G1、Wnt1、β-catenin、Igf1R、ADAM-17、TCF-4 和Bcl-w 等致癌基因被證實(shí)為miR-122 的下游靶基因[15]。此外，有研究表明，人為上調(diào)肝癌細(xì)胞中miR-122 的表達(dá)可以提高腫瘤細(xì)胞對(duì)索拉非尼的敏感性[16-17]。

本次實(shí)驗(yàn)采用的是基于LNATM 技術(shù)捕獲探針的miRNA 芯片來檢測(cè)索拉非尼治療前后對(duì)肝癌患者血清中腫瘤相關(guān)miRNA 表達(dá)譜改變情況。 將表達(dá)豐度改變≥2 倍作為篩選差異顯著miRNA 的評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果顯示，同治療前相比，服用索拉非尼1 月后肝癌患者血清miRNA 表達(dá)譜中存在16 個(gè)明顯上調(diào)的miRNAs 和10 個(gè)明顯下調(diào)的miRNAs；特別是miR-122，其表達(dá)上升幅度大于10 倍。 Real time PCR進(jìn)一步驗(yàn)證miR-122，結(jié)果顯示與芯片結(jié)果一致，提示miR-122 可能參與索拉非尼對(duì)肝癌的治療，但是具體的機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，本次研究結(jié)果顯示，索拉非尼治療能導(dǎo)致肝癌患者血清中腫瘤相關(guān)miRNA 表達(dá)譜發(fā)生明顯改變。 提示索拉非尼對(duì)肝癌相關(guān)miRNAs 的調(diào)控可能是索拉非尼治療肝癌的重要機(jī)制之一。通過人工上調(diào)相關(guān)miRNAs（如miR-122）的表達(dá)，可能增強(qiáng)索拉非尼對(duì)肝癌的療效，這對(duì)于晚期肝癌的非手術(shù)治療將有很大應(yīng)用價(jià)值。

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