李富琴 申玉紅 馮杏琳 張 敏 申 華

河南省開封市婦產(chǎn)醫(yī)院，河南開封 475000

習慣性流產(chǎn)（habitual abortion，HA）是婦產(chǎn)科常見的一種疾病，發(fā)病主要與母體生殖道異常、母體內(nèi)分泌異常、染色體異常、生殖道感染、宮頸功能不全及免疫功能異常等有關，約50%的HA 病因不明[1]。隨著人們對疾病的免疫學發(fā)病機制研究的不斷深入，尤其是對輔助性T 細胞的深入研究，國外學者發(fā)現(xiàn)，T 細胞亞群分化失衡與HA 密切相關，且受到相關轉錄因子的調(diào)控[2]。 同時，環(huán)境因素也不容忽視，如吸煙[3]、飲酒[4]、家族史[5]、體重指數(shù)（BMI）[6]等。 本研究以50 例HA 非孕期患者和50 例正常非孕婦女為研究對象，采用問卷調(diào)查、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、實時熒光定量聚合酶鏈反應（RTQ-PCR）等技術，統(tǒng)計分析問卷調(diào)查結果，測定患者外周血Th1，Th2，Th17 的百分比， 細胞因子IFN-γ、IL-4 和IL-17 的表達水平及相關轉錄因子T-bet、GATA-3 和STAT-3 mRNA 的含量。 旨在探討HA 患者Th1、Th2、Th17 細胞變化及環(huán)境因素與HA的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2011 年6 月～2012 年9 月河南省開封市婦產(chǎn)醫(yī)院就診的50 例非孕期HA 患者（HA 組），以及同期50 例健康非孕期婦女 （NNP 組）。 HA 組納入標準：①年齡20～40 歲；②有兩次或兩次以上自然流產(chǎn)史；③無糖尿病、高血壓、生殖器畸形等器質(zhì)性疾病。NNP 組納入標準：①年齡21～40 歲；②與HA 組無血緣關系；③無自然流產(chǎn)史，無腎炎、肝病、生殖器感染等病史。 所有研究對象均知情同意并簽署知情同意。

1.2 主要試劑和儀器

莫能霉素、離子霉素和PMA 購自Takara 公司，RPMI-1640、小牛血清購自Sigma 公司，TapDNA 聚合酶購自北京天根公司，ELISA 檢測試劑盒購自上海生工，流式細胞儀購自美國Guava。

1.3 方法

1.3.1 分離和體外培養(yǎng)PBMC 采集患者抗凝靜脈血5 mL，收集其中的單個核細胞層，加入PBS 3 mL，1200 r/min離心洗滌10 min，棄上清。 用含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基重懸。 在24 孔板上加入PBMC，同時加入莫能霉素（2 μg/mL）、離子霉素（1 μg/mL）和PMA（25 μg/mL），5 h 后收集細胞，對細胞表面的CD分子和胞內(nèi)的IFN-γ、IL-4、IL-17 及相應的對照抗體染色，利用流式細胞儀進行檢測。

1.3.2 血清中IFN-γ、IL-4 和IL-17 的含量測定按照ELISA 試劑盒要求對患者血清中IFN-γ、IL-4和IL-17 的含量進行檢測。

1.3.3 RTQ-PCR 檢 測T-bet、GATA-3 和STAT-3 mRNA 的表達 將提取的總RNA 逆轉錄成cDNA，運用RTQ-PCR 技 術 擴 增T-bet、GATA-3 和STAT-3 mRNA。 PCR 反應體系：10×buffer 5 μL，10 mmol/L dNTP Mix 5 μL，cDNA 2 μL，Primers 各20 μmol/L，Tap 酶0.25 μL，總反應體系50 μL。 反應條件：94℃預變性5 min；94℃45 s；55℃50 s；72℃1 min；30 個循環(huán)；72℃延伸10 min。 擴增所需引物見表1。

表1 擴增T-bet、GATA-3 和STAT-3 所需引物

1.3.4 問卷調(diào)查 采用一對一方式，對HA 組及NNP 組進行相同問卷調(diào)查。調(diào)查內(nèi)容主要包括社會生物學特征、文化程度、BMI 值、被動吸煙狀況和飲咖啡史等。以BMI＜24.0 kg/m2和BMI≥24.0 kg/m2為分段標準，被動吸煙以無、＜1 h/d 和≥1 h/d 為分段標準，飲咖啡以無、＜100 mg/d 和≥100 mg/d 為界限[1]。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t 檢驗；計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組一般情況比較

兩組BMI≥24.0 kg/m2所占比例比較，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。兩組年齡、文化程度、被動吸煙、體重指數(shù)（＜24.0 kg/m2）及飲咖啡比較，差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）。 見表2。

表2 兩組一般情況比較[n（%）]

2.2 兩組Th1、Th2 和Th17 細胞水平比較

與NNP 組相比，HA 組Th1 和Th17 細胞百分比較高，而Th2 細胞百分比較低，差異均有統(tǒng)計學意義（均P ＜0.05）。 見表3。

表3 兩組Th1、Th2 和Th17 細胞水平比較（%，±s）

表3 兩組Th1、Th2 和Th17 細胞水平比較（%，±s）

注：HA：習慣性流產(chǎn)；NNP：正常非孕婦女

?

2.3 兩組血清中IFN-γ、IL-4 和IL-17 的表達水平比較

HA 組IFN-γ 和IL-17 的含量明顯高于NNP 組，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05），而IL-4 的表達水平低于NNP 組，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。 見表4。

表4 兩組血清中IFN-γ、lL-4 和IL-17 的表達水平比較（μg/L，±s）

表4 兩組血清中IFN-γ、lL-4 和IL-17 的表達水平比較（μg/L，±s）

注：HA：習慣性流產(chǎn)；NNP：健康非孕期婦女；IFN-γ：γ-干擾素；IL：白細胞介素

?

2.4 兩組T-bet、GATA-3 和STAT-3 mRNA 的表達水平比較

結果顯示，以NNP 組3 種轉錄因子的表達量分別為1，與其相比較，HA 組T-bet 和STAT-3 mRNA 的表達量明顯增高（6.3 倍和3.5 倍），差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05），GATA-3 mRNA 表達量顯著降低（P ＜0.05）。見表5。

表5 兩組T-bet、GATA-3 和STAT-3 mRNA 的表達水平

3 討論

輔助性T 細胞為CD4+T 細胞，按其所產(chǎn)生的細胞種類，可分為Th1 和Th2 細胞。Th1 細胞主要分泌IL-2、IFN-γ 和TNF-α 等；Th2 細胞主要分泌IL-4、5、6 和IL-10 等。 兩類亞群細胞對不同細胞因子的反應性各異：IFN-γ 可誘導Th1 細胞分化，但抑制Th2 細胞增殖；IL-4 誘導Th2 細胞分化，但可與IL-13 等一起抑制Th1 細胞功能和分化。 機體在正常功能狀態(tài)下，各細胞因子處于動態(tài)平衡狀態(tài)，共同維持機體的體液免疫和細胞免疫功能。 T-bet 是T-box 基因家族的新型轉錄因子，選擇性地表達于Th1 細胞，可誘導IFN-γ的產(chǎn)生，并可抑制IL-4 的分泌。 GATA-3 是Th2 細胞重要的特異性轉錄因子，可誘導產(chǎn)生IL-4。 T-bet 和GATA-3 分別促進Th1 和Th2 的發(fā)育，二者存在交互抑制作用[7-8]。Th17 是一種新發(fā)現(xiàn)的能夠分IL-17 的T細胞亞群，STAT-3 是其主要的轉錄因子[9]。

近年來的研究報道顯示，T 細胞亞群分化失衡與妊娠結局存在較大關聯(lián)[10]。 Liu 等[11]研究結果顯示，正常妊娠婦女外周血Th 細胞亞群與未妊娠婦女無差異，而與正常的未妊娠婦女相比，HA 患者外周血Th17比例較高。 這與本研究結構相一致。 本研究結果還顯示，HA 組Th1 明顯增高以及IFN-γ、IL-17 的水平均高于NNP 組。 Th2 細胞所占比例及IL-4 的水平均低于NNP 組，表明HA 組患者存在T 細胞亞群比例以及功能失調(diào)。 另外，從轉錄因子的表達水平看，HA 組患者T-bet 和STAT-3mRNA 表達水平較高， 再次證明了HA 組患者Th1 和Th2 細胞特異性轉錄因子呈高表達狀態(tài)。

此外，環(huán)境因素與HA 發(fā)病的關聯(lián)日益受到學者們的關注，國內(nèi)外學者對此也有相關報道。Zhang 等[12]對中國南方女性HA 與環(huán)境因素的關聯(lián)進行了分析，被動吸煙（≥1 h/d）和肥胖（BMI≥24.0 kg/m2）與HA有關。 國外學者報道，患者的高胰島素抵抗與HA 相關[13]，并且由于胰島素抵抗而出現(xiàn)的高血壓、高血脂、高糖與肥胖導致的自然流產(chǎn)有關[14]。 本研究也發(fā)現(xiàn)，肥胖（BMI≥24.0 kg/m2）與HA 之間存在關聯(lián)（P ＜0.05），但未發(fā)現(xiàn)被動吸煙與HA 相關，這與Zhang 等[12]的研究結果不相一致，原因可能與本次研究樣本量不足或此次的研究對象對煙草的敏感性較低有關。

HA 的發(fā)生存在多種因素，本研究主要從T 細胞亞群分化角度和環(huán)境因素兩方面與HA 的關聯(lián)進行了探討。在今后的研究中，需要從多角度、多方面進行深入思考，如HA 的發(fā)生是否存在易感基因，是否與某種病原體感染以及激素水平的調(diào)節(jié)有關，并且探討上述因素與環(huán)境因素是否存在交互作用等。

[1] Allison JL，Schust DJ. Recurrent first trimester pregnancy loss：revised definitions and novel causes [J]. Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes，2009，16（6）：446-450.

[2] Saini V，Arora S，Yadav A，et al. Cytokines in recurrent pregnancy loss [J]. Clin Chim Acta，2011，412 （9-10）：702-708.

[3] Shea AK，Steiner M.Cigarette smoking during pregnancy[J].Nicotine Tob Res，2008，10（2）：267-278.

[4] Benedum CM，Yazdy MM，Mitchell AA，et al. Risk of spina bifida and maternal cigarette， alcohol，and coffee use during the first month of pregnancy [J]. Int J Environ Res Public Health，2013，10（8）：3263-3281.

[5] Sugiura-Ogasawara M，Aoki K，F(xiàn)ujii T，et al. Subsequent pregnancy outcomes in recurrent miscarriage patients with a paternal or maternal carrier of a structural chromosome rearrangement [J]. J Hum Genet，2008，53（7）：622-628.

[6] Veleva Z，Tiitinen A，Vilska S，et al. High and low BMI increase the risk of miscarriage after IVF/ICSI and FET [J].Hum Reprod，2008，23（4）：878-884.

[7] Usui T，Preiss JC，Kanno Y，et al. T-bet regulates Th1 responses through essential effects on GATA-3 function rather than on IFNG gene acetylation and transcription [J].J Exp Med，2006，203（3）：755-766.

[8] Hwang ES，Szabo SJ，Schwartzberg PL，et al. T helper cell fate specified by kinase-mediated interaction of T-bet with GATA-3 [J]. Science，2005，307（5708）：430-433.

[9] Liu X，Nurieva RI，Dong C. Transcriptional regulation of follicular T-helper （Tfh） cells [J]. Immunol Rev，2013，252（1）：139-145.

[10] Kheshtchin N，Gharagozloo M，Andalib A，et al. The expression of Th1- and Th2-related chemokine receptors in women with recurrent miscarriage：the impact of lymphocyte immunotherapy[J]. Am J Reprod Immunol，2010，64（2）：104-112.

[11] Liu YS，Wu L，Tong XH，et al. Study on the relationship between Th17 cells and unexplained recurrent spontaneous abortion [J]. Am J Reprod Immunol，2011，65（5）：503-511.

[12] Zhang BY，Wei YS，Niu JM，et al. Risk factors for unexplained recurrent spontaneous abortion in a population from southern China [J]. Int J Gynaecol Obstet，2010，108（2）：135-138.

[13] Zolghadri J，Tavana Z，Kazerooni T，et al. Relationship between abnormal glucose tolerance test and history of previous recurrent miscarriages， and beneficial effect of metformin in these patients：a prospective clinical study[J].Fertil Steril，2008，90（3）：727-730.

[14] Li Y，Yang D，Zhang Q. Impact of overweight and underweight on IVF treatment in Chinese women [J]. Gynecol Endocrinol，2010，26（6）：416-422.