宋程光 楊 鑫 閔連秋 劉長(zhǎng)喜

1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)本溪中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧本溪 117000；2.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧錦州 121001

糖尿病是缺血性腦血管病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，其發(fā)生腦梗死的危險(xiǎn)性是普通人的2～3 倍[1]。 腦梗死是2型糖尿病最常見的大血管并發(fā)癥，也是2 型糖尿病患者最常見的死亡原因，其發(fā)病后的癥狀重、預(yù)后差、病死率高。 本研究通過檢測(cè)神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分，神經(jīng)細(xì)胞數(shù)以及STAT1 的表達(dá)情況來探討原花青素（PC）對(duì)2型糖尿病局灶性腦缺血的保護(hù)作用。

Janus 激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子（JAK/STAT）途徑是眾多細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要途徑，一直是學(xué)者們研究的熱點(diǎn)。 細(xì)胞因子與其受體結(jié)合后激活JAK，進(jìn)一步激活STAT，再誘導(dǎo)其下游的目的基因表達(dá)。近來研究表明，JAK/STAT 途徑是人體內(nèi)生理和病理反應(yīng)的共同傳導(dǎo)通路之一，該途徑與多種疾病發(fā)病及防治密切相關(guān)[2-4]。腦缺血時(shí)能釋放大量細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，這些因子能夠激活JAK/STAT 信號(hào)通路，現(xiàn)已證實(shí)腦缺血可以誘導(dǎo)STAT1 蛋白表達(dá)增加[5]，使JAK/STAT 信號(hào)通路激活。STAT1 能抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程中的信號(hào)傳導(dǎo)，并能負(fù)性調(diào)節(jié)cMyc 啟動(dòng)子的表達(dá)，參與細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)[6]。

本實(shí)驗(yàn)研究PC 對(duì)2 型糖尿病局灶性腦缺血大鼠腦組織中STAT1 表達(dá)的影響，來探討原花青素對(duì)2型糖尿病大鼠局灶性腦缺血的保護(hù)作用及其機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

SD 大鼠由遼寧醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供；PC 由天津尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司提供（批號(hào)：6050804）。 Rabbit Anti-STAT1 蛋白試劑盒、生物素化二抗、DAB 濃縮顯色液、DAB 稀釋液均由武漢博士德生物試劑公司提供。 膽酸鈉、膽固醇由鄭州利偉生物實(shí)業(yè)有限公司提供，鏈脲佐菌素（STZ）由廈門星隆達(dá)化學(xué)試劑有限公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組

SD 大鼠75 只，雌雄各半，隨機(jī)分為假手術(shù)組，2型糖尿病合并腦缺血組，PC 低、中、高劑量組，每組各15 只。 PC 組在建立2 型糖尿病模型后給予灌胃，1 次/24 h，連續(xù)1 周，于大腦中動(dòng)脈缺血（middle cerebral arteryocclusion，MCAO）術(shù)前1 h 再灌胃1 次。PC 低、中、高劑量組分別以PC 粉劑50、100、200 mg/（kg·次），蒸餾水配制成懸浮液灌胃。

1.2.2 模型制作

各組均先喂以高脂高糖飼料（10%煉豬油，2.5%膽固醇，20%蔗糖，2%膽酸鈉，65.5%普通飼料[7]）4 周，誘發(fā)出胰島素抵抗，然后以鏈脲佐菌素（STZ）小劑量（25 mg/kg）腹腔注射1 次，穩(wěn)定3 d 后，測(cè)定大鼠尾尖血血糖，空腹血糖＞16.7 mmol/L 的大鼠判定為2 型糖尿病大鼠。

以線栓法制作MCAO 模型[8-9]，大鼠用10%的水合氯醛（0.3 mL/100 mg）腹腔注射麻醉后，暴露并鈍性游離左側(cè)頸總動(dòng)脈（CCA），結(jié)扎同側(cè)CCA 近心端和頸外動(dòng)脈（ECA）分叉部，距CCA 末端約5 mm 處剪口，選用頭端燒成光滑杵狀的國(guó)產(chǎn)尼龍線（直徑0.235 mm，長(zhǎng)6 cm）插入，以頸總動(dòng)脈分叉處計(jì)算進(jìn)線深度為（18.0±0.5） mm，至大腦中動(dòng)脈起始部以完全阻斷血供。 模型成功的標(biāo)志是大鼠即刻出現(xiàn)左側(cè)Horner 征。 排除有蛛網(wǎng)膜下腔出血者。 假手術(shù)組除不插入線栓外，其他操作步驟同上。手術(shù)過程中，用加熱墊和燈泡保持肛溫在37.0～37.5℃。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)

1.2.3.1 神經(jīng)功能缺損評(píng)分 MCAO 術(shù)后24 h 采用Bederson[10]6 級(jí)5 分評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)估，5級(jí)0 分：正常（無(wú)功能障礙）；4 級(jí)1 分：對(duì)側(cè)上肢不能完全伸展；3 級(jí)2 分：向?qū)?cè)推時(shí)抵抗力下降；2 級(jí)3 分：提尾時(shí)向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；1 級(jí)4 分：自動(dòng)轉(zhuǎn)圈；0 級(jí)5 分：無(wú)自發(fā)性活動(dòng)伴意識(shí)障礙。

1.2.3.2 HE 染色 MCAO 術(shù)后24 h，大鼠以10%水合氯醛（0.3 mL/100 mg）腹腔注射麻醉，打開頸部，暴露頸右總動(dòng)脈，插管，先輸注生理鹽水約50 mL，然后輸注4%多聚甲醛約50 mL，斷頭取腦。 甲醛固定，冠狀腦片制備，選擇梗死中心（即最大層面），常規(guī)酒精脫水，石蠟包埋，制成4～6 μm 厚的切片，附片，行蘇木精-伊紅（HE）染色：60℃烤箱過夜，二甲苯脫蠟后逐級(jí)酒精浸水，蘇木精浸染，1%鹽酸酒精分色，自來水漂洗，蒸餾水返藍(lán)30 min，鏡檢使細(xì)胞核呈藍(lán)紫色，其余結(jié)構(gòu)基本無(wú)色。 伊紅染液浸染后蒸餾水洗，逐級(jí)酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。觀察并計(jì)數(shù)海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞。

1.2.3.3 免疫組化法 采用免疫組化法檢測(cè)缺血側(cè)大腦皮質(zhì)STAT1 的表達(dá)，MCAO 術(shù)后24 h，大鼠取腦步驟同HE 染色，取雙側(cè)大腦冠狀位距嗅球尖端6～11 mm的腦組織塊，放入4%多聚甲醛固定液中繼續(xù)固定24 h，常規(guī)梯度脫水、透明、石蠟包埋。 從冠狀面中1/3層面開始留取切片，厚度5 μm，連續(xù)切片，切片貼附于經(jīng)APES 處理的載玻片上，備用。 用免疫組化法測(cè)定，嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 11.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P < 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分情況

與假手術(shù)組比較，2 型糖尿病合并腦缺血組的神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分明顯增高，PC 各劑量組均能改善2 型糖尿病局灶性腦缺血大鼠的神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分，其中PC 中、高劑量組效果比低劑量組更明顯，但PC 中、高劑量組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。 見表1。

表1 各組神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分情況（分，±s）

表1 各組神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分情況（分，±s）

注：與假手術(shù)組比較，▲P < 0.01；與2 型糖尿病腦缺血組比較，■P <0.05，*P < 0.01；與PC 低劑量組比較，#P < 0.05；PC：原花青素

?

2.2 各組大鼠缺血側(cè)海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)

PC 各組大鼠缺血側(cè)海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)均明顯增多，其中PC 中、高劑量組效果比低劑量組更明顯，但PC 中、高劑量組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見表2。

表2 原花青素對(duì)各組大鼠缺血側(cè)海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響（個(gè)/HP，±s）

表2 原花青素對(duì)各組大鼠缺血側(cè)海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響（個(gè)/HP，±s）

注：與假手術(shù)組比較，▲P < 0.01；與2 型糖尿病腦缺血組比較，*P <0.01；與PC 低劑量組比較，#P < 0.01；PC：原花青素

?

2.3 不同劑量PC 對(duì)2 型糖尿病局灶性腦缺血大鼠大腦皮質(zhì)STAT1 陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率的影響

PC 各組均能減少2 型糖尿病局灶性腦缺血大鼠腦組織中STAT1 的含量，其中PC 中、高劑量組效果比低劑量組更明顯，但PC 中、高劑量組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。 見表3、圖1。

表3 原花青素對(duì)各組大鼠缺血側(cè)大腦皮質(zhì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子1 陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率的影響（個(gè)/HP，±s）

表3 原花青素對(duì)各組大鼠缺血側(cè)大腦皮質(zhì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子1 陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率的影響（個(gè)/HP，±s）

?

注：與假手術(shù)組比較，▲P<0.01；與2 型糖尿病腦缺血組比較，*P<0.01；與PC 低劑量組比較，#P < 0.01；PC：原花青素；STAT1：信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子1

圖1 原花青素各組大鼠缺血側(cè)大腦皮質(zhì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子1 陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)（SABC×400）

3 討論

糖尿病對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響隨著此類患者的增多越來越受到人們的重視。糖尿病除了引起周圍神經(jīng)病變外，還表現(xiàn)出腦血管病發(fā)病率升高，糖尿病患者可能會(huì)合并其他并發(fā)癥，如高血壓、高脂血癥、自主神經(jīng)病、動(dòng)脈粥樣硬化的加速、血小板黏附和聚集能力升高、紅細(xì)胞變形能力降低、纖溶活性受損、血黏度高、腦實(shí)質(zhì)內(nèi)增殖性小血管病等，而且糖尿病缺血性卒中時(shí)可以有應(yīng)激性高血糖的產(chǎn)生，以上因素都加重缺血性腦損傷。

JAK/STAT 通路是一條重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，它的一個(gè)十分重要的作用就是轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞因子信號(hào)。該途徑是一種比較簡(jiǎn)單的轉(zhuǎn)錄化轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，不需要第二信使，其通過穿膜受體將細(xì)胞外多肽信號(hào)信息直接傳送到核內(nèi)的靶基因啟動(dòng)子，進(jìn)而發(fā)揮基因轉(zhuǎn)錄活化子蛋白與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子的作用[11-13]。

PC 具有降低毛細(xì)血管通透性、抗氧化的藥理作用[14-15]，其含有大量的活性酚羥基，這種化學(xué)結(jié)構(gòu)使其具有很強(qiáng)的清除各種活性氧自由基及抗氧化的能力。已有研究證實(shí)原花青素可通過清除缺血局部血管內(nèi)皮細(xì)胞的氧自由基和抗氧化作用而應(yīng)用于治療和預(yù)防心肌缺血-再灌注損傷[16]，從藥理機(jī)制和腦血管病發(fā)病機(jī)制上看，PC 對(duì)缺血性腦血管病應(yīng)有較好的作用。

近來有研究認(rèn)為STAT1 有促進(jìn)凋亡的作用[17-19]。Takagi 等[17]將小鼠STAT1 基因敲除，制備STAT1 基因缺陷小鼠，發(fā)現(xiàn)這種小鼠有抗缺血能力，表現(xiàn)為腦梗死面積明顯小于野生型小鼠， 并且TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞顯著減少，神經(jīng)功能缺損也明顯減輕。為了探索STAT1基因缺陷小鼠抗缺血損傷的具體機(jī)制，筆者發(fā)現(xiàn)再灌注2 h 后Akt 絲氨酸473 位點(diǎn)磷酸化較野生型小鼠明顯，而缺血誘導(dǎo)的c-Jun 氨基末端激酶（JNK）、P38 絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）磷酸化在兩型小鼠之間的差異并不明顯，提示STAT1 可能具有調(diào)節(jié)Akt 活化的作用。 此外，STAT1 基因缺陷小鼠半光氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）的活化明顯低于野生型小鼠。 Stephanou 等[20]報(bào)道STAT1 可以降低Bcl-2和Bcl-x 的表達(dá)，而Bcl-2 和Bcl-x 是腦缺血再灌注損傷中很重要的抗凋亡基因，提示了在腦缺血損害過程中STATl 的促凋亡作用。腦缺血能誘導(dǎo)磷酸化STAT1蛋白活化及核轉(zhuǎn)位，它們通過調(diào)節(jié)與凋亡和細(xì)胞死亡相關(guān)蛋白Caspase-3 的轉(zhuǎn)錄與磷酸化參與了缺血性腦損傷的過程。

在本研究中，2 型糖尿病局灶性腦缺血組大鼠缺血側(cè)大腦皮質(zhì)STAT1 表達(dá)較假手術(shù)組明顯增多（P <0.01），說明STAT1 可能在2 型糖尿病合并腦缺血時(shí)起到重要作用，推測(cè)其機(jī)制可能為2 型糖尿病合并腦缺血時(shí)能引起大量細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的釋放，誘導(dǎo)磷酸化STAT1 蛋白活化及核轉(zhuǎn)位，激活JAK/STAT1 信號(hào)通路，它們能通過調(diào)節(jié)與凋亡和細(xì)胞死亡相關(guān)蛋白Caspase-3 的轉(zhuǎn)錄與磷酸化和其他途徑參與了缺血性腦損傷的過程，發(fā)揮了其促凋亡作用[21]。 PC 各組均能使2 型糖尿病局灶性腦缺血大鼠缺血側(cè)大腦皮質(zhì)STAT1 表達(dá)下調(diào)，其中PC 中、高劑量組效果更明顯。推測(cè)PC 可能通過抑制STAT1 的表達(dá)而起到抑制JAK/STAT1 通路，最終抑制了其促凋亡作用，從而起到了對(duì)2 型糖尿病局灶性腦缺血大鼠的保護(hù)作用。

由于動(dòng)物和人體有巨大的差異且缺血機(jī)制復(fù)雜，可能阻斷單一環(huán)節(jié)的藥物都不一定奏效[22]。因此對(duì)PC的進(jìn)一步研究，將為治療糖尿病合并腦梗死提供更為可靠的理論依據(jù)。

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