王 嘉 覃尚珠 曾常茜 李 坤 丁 寧▲

1.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外科，遼寧大連 116011；2.大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室，遼寧大連 116600

癲癇是常見的腦部慢性疾病，以大腦神經(jīng)元突發(fā) 性異常放電導(dǎo)致的短暫大腦功能障礙為特征。在我國有20%～25%的癲癇患者常規(guī)藥物治療得不到有效控制，成為社會(huì)家庭的沉重負(fù)擔(dān)。 雷公藤內(nèi)酯是近來神經(jīng)退行性疾病臨床治療研究的熱點(diǎn)藥物之一，對(duì)老年性癡呆（Alzheimer's disease，AD）、帕金森?。≒arkinson diease，PD） 和多發(fā)性硬化癥 （multiple sclerosis，MS）等具有神經(jīng)保護(hù)作用[1]。雷公藤內(nèi)酯對(duì)于癲癇的治療研究也取得了一定的進(jìn)展[2-3]。目前在哺乳動(dòng)物體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)13 種水通道蛋白（AQPs），其中水通道蛋白4（AQP4）在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)廣泛分布，與癲癇發(fā)病的電生理學(xué)機(jī)制、癲癇持續(xù)狀態(tài)及難治性癲癇腦損傷等機(jī)制密切相關(guān)[4]。 本實(shí)驗(yàn)觀察了雷公藤內(nèi)酯對(duì)海人酸致癇大鼠腦海馬AQP4 蛋白表達(dá)的影響，為雷公藤內(nèi)酯應(yīng)用于臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

10 周齡SD 雄性大鼠30 只，體重（230±10）g，由大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。免抗AQP4 多克隆抗體購自Santa Cruz Technology 公司；HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG 抗體購自北京中杉金橋公司；RIPA 蛋白裂解液購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；BCA 蛋白定量及ECL 發(fā)光試劑盒購自碧云天生物公司；Trizol及RT-PCR 試劑盒購自大連寶生物公司；雷公藤內(nèi)酯購自北京優(yōu)尼康公司；海人酸購自Sigma 公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及藥物注射 SD 大鼠分成三組：對(duì)照組、海人酸組、雷公藤內(nèi)酯干預(yù)組，各10 只。稱取記錄大鼠重量后，海人酸組頸內(nèi)皮下注射海人酸，劑量為10 mg/kg；雷公藤內(nèi)酯干預(yù)組在海人酸注射前連續(xù)7 d腹腔內(nèi)注射雷公藤內(nèi)酯，劑量為30 μg/kg；對(duì)照組注射等量的生理鹽水。 造模后觀察動(dòng)物的行為變化。

1.2.2 海馬組織取材及保存 致癇后第1 天取腦海馬組織，10%水合氯醛（350 mg/kg）皮下深麻醉后，在冰冷磷酸鹽緩沖液（PBS）中取出全腦，由矢狀線切開，去除小腦及間腦，沿穹隆分離側(cè)腦室，去除外側(cè)壁的腦組織，將海馬從剩余腦組織上剝離，包于干凈錫紙中，標(biāo)記后快速投入液氮中浸透，各組標(biāo)本收集齊后從液氮轉(zhuǎn)到-70℃低溫冰箱凍存。

1.2.3 Western blot 法檢測(cè)AQP4 蛋白表達(dá) 取材方法同“1.2.2”項(xiàng)下，準(zhǔn)備好冰盒將海馬組織從液氮中取出剪碎后放于預(yù)冷勻漿器中，勻漿的同時(shí)加入RIPA 蛋白裂解液（含PMSF100 μmol/L），然后12 000 r/min 離心15 min 除沉淀，BCA 蛋白定量后分裝凍存。各泳道取60 μg 樣品上樣后進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)膜。5%BSA 中4℃過夜封閉后用一抗（免抗AQP4 多克隆抗體1∶400，兔抗GAPDH 單抗1∶400）孵育2.5 h。 而后TBST 清洗3 次，每次10 min。繼之以HRP 標(biāo)記的二抗（山羊抗兔IgG 抗體1∶1000 稀釋）37℃孵育1 h 后TBST 清洗5 次，每次10 min。 最后于暗室ECL 發(fā)光經(jīng)顯影、定影后檢測(cè)目的條帶。膠片掃描后用Quantity One 軟件分析灰度值。

1.2.4 RT-PCR 法檢測(cè)AQP4 基因表達(dá) 取材方法同“1.2.2”項(xiàng)下，將海馬組織從液氮中取出剪碎后放于預(yù)冷勻漿器中，加入1 mL Trizol 勻漿至肉眼看不見組織顆粒，轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP 管中，加200 μL 氯仿/異戊醇（24∶1）劇烈振蕩，混勻30 s，4℃12 000 r/min 離心5 min，取上清300～400 μL 加等體積異丙醇，冰上放置5 min 后4℃12 000 r/min 離心10 min，棄上清。 沉淀加75%乙醇1 mL，12 000 r/min 離心5 min， 棄上清，沉淀干燥。加20 μL DEPC 水溶解。紫外分光光度計(jì)測(cè)A260和A280并計(jì)算濃度。 將1 μg 總RNA 用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)成cDNA，反應(yīng)條件為42℃30 min，99℃5 min，5℃5 min；1 個(gè)循環(huán)后用AQP4 上游引物5′-GTCCTCATCTCCCTTTGCTTT-3′，下游引物5′-GACTCCCAATCCTCCAACCAC-3′。管家基因GAPDH上游引物5′-TCCCACTCTTCCACCTTC-3′，下游引物5′-CTGTAGCCGTATTCATTGTC-3′分別進(jìn)行特異性擴(kuò)增，反應(yīng)條件優(yōu)化為94℃2 min，1 個(gè)循環(huán)；94 ℃30 s，54℃30 s，72℃30 s，30 個(gè)循環(huán)；72℃10 min，1 個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后取10 μL 產(chǎn)物瓊脂糖電泳檢測(cè)表達(dá)量的變化。 凝膠成像儀照相并用Quantity One 軟件分析測(cè)定灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SSPS 11.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析， 組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)，以P < 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組動(dòng)物海馬區(qū)AQP4 蛋白表達(dá)水平變化

Western blot 結(jié)果顯示，海人酸組與對(duì)照組AQP4條帶與GAPDH 條帶的灰度值比分別為0.872±0.141和0.453±0.078，海人酸組AQP4 表達(dá)顯著增多（P <0.05）；雷公藤內(nèi)酯干預(yù)組中海馬AQP4 蛋白相對(duì)灰度值比為0.647±0.185，較對(duì)照組增多（P < 0.05），較海人酸組AQP4 表達(dá)顯著減少（P < 0.05）。 見圖1。

2.2 各組動(dòng)物海馬區(qū)AQP4 mRNA 表達(dá)水平變化

RT-PCR 結(jié)果顯示，海人酸組與對(duì)照組AQP4 條帶與GAPDH 條帶的灰度值比分別為1.212±0.115 和0.843±0.091，海人酸組AQP4 mRNA 表達(dá)與對(duì)照組比較顯著增加（P<0.05）；雷公藤內(nèi)酯干預(yù)組AQP4 mRNA相對(duì)灰度值比為1.105±0.192，與對(duì)照組相比，表達(dá)顯著增加（P < 0.05），與海人酸組相比，AQP4 mRNA 表達(dá)水平顯著減少（P < 0.05）。 見圖2。

圖1 雷公藤內(nèi)酯對(duì)大鼠海馬區(qū)水通道蛋白4 表達(dá)的影響

圖2 雷公藤內(nèi)酯對(duì)大鼠海馬區(qū)水通道蛋白4 mRNA 水平的影響

3 討論

癲癇是常見的神經(jīng)系統(tǒng)多發(fā)病之一，全世界癲癇患者總數(shù)達(dá)3000 萬人，且我國每年有45 萬新增患者，總數(shù)約650 萬[5]，其中約有1/4 的患者治療后不能有效控制發(fā)作，轉(zhuǎn)為難治性癲癇；而約有2/3 的難治性癲癇為顳葉癲癇。顳葉癲癇的臨床特征是反復(fù)出現(xiàn)的自發(fā)性癲癇發(fā)作，最明顯的病理改變是海馬組織硬化，病情進(jìn)展迅速，預(yù)后極差。 因此積極尋求高效、安全、毒副作用小的抗癇新藥及治療新靶點(diǎn)已成為臨床及基礎(chǔ)研究的重中之重。

雷公藤內(nèi)酯是從雷公藤中分離出來的單體，毒性較小。 它可以透過血腦屏障，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療中發(fā)揮抗炎及免疫調(diào)節(jié)作用。 大量研究顯示，雷公藤內(nèi)酯可以抑制膠質(zhì)細(xì)胞的活化，減少炎癥因子及促炎癥細(xì)胞因子的釋放，對(duì)神經(jīng)元具有明確的保護(hù)作用[5-6]，但其對(duì)水通道蛋白家族作用的分子機(jī)制方面研究報(bào)道較少。

AQP4 是大腦內(nèi)的主要水通道蛋白，在軟腦膜、室管膜、脈絡(luò)叢及海馬、視上核、下丘腦等均有顯著的表達(dá)[7]。 AQP4 在神經(jīng)系統(tǒng)主要有控制腦內(nèi)水分的流動(dòng)，易化星形膠質(zhì)細(xì)胞的遷移，改變神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性等作用，參與了腦缺血、顱內(nèi)感染、腦腫瘤以及神經(jīng)退行性疾病等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理學(xué)過程。 AQP4 在癲癇治療中的作用一直是研究熱點(diǎn)，Binder 等[8]發(fā)現(xiàn)AQP4 敲除可提高癲癇發(fā)作的閾值，提示神經(jīng)膠質(zhì)的AQP4 可能參與了腦興奮性活動(dòng)的調(diào)節(jié)。 在對(duì)海馬硬化的中央顳葉癲癇患者的研究中發(fā)現(xiàn)，硬化海馬中水含量增多。 通過采用定量RT-PCR 分析、免疫組織化學(xué)和高通量免疫金標(biāo)記的方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，硬化的海馬中AQP4 表達(dá)明顯上調(diào)[9]。腹腔注射鋰-匹羅卡品建立SD 大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)模型，在6、12、24、48、72、96、120、168 h 分別用免疫組化和RT-PCR 方法檢測(cè)AQP4 的表達(dá)，結(jié)果顯示癲癇持續(xù)狀態(tài)24 h 后腦組織AQP4 的蛋白和mRNA 表達(dá)水平明顯增高，48 h 達(dá)到高峰，持續(xù)72 h 后下降，并且AQP4 的動(dòng)態(tài)表達(dá)變化和腦水腫形成過程呈正相關(guān)[10]。 以上研究說明AQP4與癲癇疾病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，AQP4 很可能成為癲癇治療研究的新靶點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)采用大鼠皮下注射海人酸方法建立了大鼠癲癇模型，它是研究難治性癲癇發(fā)病機(jī)制及藥物治療的良好模型。RT-PCR 和Western blot 結(jié)果均表明，海人酸組中海馬AQP4 蛋白和mRNA 表達(dá)水平比對(duì)照組顯著增多（P ＜0.05），與Alvestad 等[11]報(bào)道一致。進(jìn)一步用雷公藤內(nèi)酯干預(yù)發(fā)現(xiàn)，海馬區(qū)AQP4 蛋白和mRNA 表達(dá)水平比海人酸組顯著減少（P ＜0.05）。 結(jié)果提示，雷公藤內(nèi)酯可下調(diào)AQP4 蛋白和mRNA 的表達(dá)，可以作為臨床治療難治性癲癇的候選藥物之一。但是雷公藤內(nèi)酯對(duì)其下調(diào)的具體機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。

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