杜彬榮 章寶娟▲ 胡 斌

1.浙江省紹興市紹興第二醫(yī)院，浙江紹興 312000；2.浙江省紹興市藥檢所中藥室，浙江紹興 312071

聚酰胺胺（PAMAM）樹狀大分子是由Tomalia 等[1]首次合成的一類新型的聚合物，具有較大的內(nèi)部空腔和大量的端基官能團(tuán)，可與多種有機(jī)小分子或聚合物結(jié)合，并且具有細(xì)胞毒性低等許多獨(dú)特的生物性狀。正是由于這些優(yōu)勢(shì)使其非常適宜作為藥物和基因的轉(zhuǎn)運(yùn)載體[2-4]。眾所周知，多數(shù)藥物進(jìn)入人體后，必須通過血漿的儲(chǔ)存和運(yùn)輸才能到達(dá)靶部位，進(jìn)而發(fā)生藥理作用。 血清白蛋白是血液中一類重要的蛋白質(zhì)，對(duì)許多內(nèi)源性和外源性的藥物都具有較高的親和力[5]。 血清白蛋白還可與許多金屬離子結(jié)合，另有報(bào)道顯示，具有不同末端基團(tuán)的PAMAM 也可與多種金屬離子（Cu、Zn、Co、Ni、Pb、Cd）發(fā)生配位作用[6-7]。 因 此，研究PAMAM，金屬離子與白蛋白的相互作用，對(duì)闡明該藥物載體在體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)、分布和代謝等具有重要意義。

本實(shí)驗(yàn)利用紫外-可見光譜法研究Co2+與PAMAM樹狀大分子的配位作用；利用熒光光譜法研究PAMAM樹狀大分子在生理?xiàng)l件下與牛血清白蛋白、Co2+三者的作用，并探討相互作用機(jī)制，以及對(duì)蛋白構(gòu)象的影響。

1 儀器與試藥

1.1 試劑

3.5 代（G3.5，具有末端酯基）和4.0 代（G4.0，具有末端氨基）以乙二胺為核的PAMAM 樹枝狀大分子，實(shí)驗(yàn)室自制；牛血清白蛋白BSA（組分Ⅴ，生化試劑，南京大冶生物科技有限公司）；CoCl2（分析純，上海振興試劑廠）；三羥甲基氨基甲烷；實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器

RF5301 型熒光分光光度計(jì)（日本島津公司）；UV2100 型紫外分光光度計(jì)（日本島津公司）；pHS-25型酸度計(jì)（上海偉業(yè)儀器廠）；BS 124S 型電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]。

2 方法與結(jié)果

2.1 紫外光譜法研究G4.0 PAMAM 和G3.5 PAMAM與Co2+配位作用

配制一定濃度的G3.5 PAMAM 和G4.0 PAMAM樹狀大分子與Co2+的混合體系，在波長(zhǎng)為200～800 nm的范圍內(nèi)掃描紫外光譜，狹縫寬度為2.0 nm[8]。

2.2 各類PAMAM 樹狀大分子對(duì)牛血清白蛋白熒光的猝滅作用

將BSA 溶解于pH 為7.4 的Tris-HCl 緩沖鹽溶液（緩沖液含NaCl 的濃度為100 mmol/L）中，配制成終濃度為5 μmol/L 的溶液。 室溫下測(cè)定上述濃度溶液的熒光光譜。 激發(fā)波長(zhǎng)選擇295 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為300～460 nm[9]。 然后向BSA 溶液中分別加入不同濃度的各類樹狀大分子溶液，在同樣條件下測(cè)定其熒光光譜，記錄熒光強(qiáng)度。

2.3 Co2+對(duì)牛血清白蛋白熒光的猝滅作用

按照“2.1”項(xiàng)下方法，向BSA 溶液中分別加入不同濃度的Co2+，測(cè)定其熒光光譜，記錄熒光強(qiáng)度。

2.4 Co2+對(duì)PAMAM 樹狀大分子和BSA 相互作用的影響

將BSA 溶解于pH 為7.4 的Tris-HCl 緩沖鹽溶液（NaCl 濃度100 mmol/L）中，配制成濃度為5 μmol/L的溶液。 然后向其中分別加入一定量的CoCl2溶液，制成BSA- Co2+二元猝滅體系[10-11]，按照“2.2”項(xiàng)下方法測(cè)定其熒光光譜。隨后向該混合溶液中加入不同濃度的G4.0 PAMAM 或G3.5PAMAM 樹狀大分子溶液，在同樣的條件下測(cè)定熒光光譜。

2.5 紫外光譜法研究G4.0 PAMAM 和G3.5 PAMAM與Co2+配位作用結(jié)果

圖1 是PAMAM 樹狀大分子水溶液在pH 值為7.40，25℃下的紫外可見光吸收光譜圖。從圖中可以看出，該溶液在紫外區(qū)有較大吸收，而在可見光區(qū)幾乎無吸收。

圖2 是不同代數(shù)PAMAM 與Co2+溶液在pH 值為7.40，25℃下相互作用后的紫外可見吸收光譜圖，分為紫外區(qū)的吸收光譜和可見光區(qū)的吸收光譜兩個(gè)部分。從圖2 中可以發(fā)現(xiàn)，加入G4.0 PAMAM 樹狀大分子時(shí)，最大吸收波長(zhǎng)為356 nm；加入G3.5 PAMAM 樹狀大分子時(shí)，溶液在可見光區(qū)域幾乎沒有吸收。 在實(shí)驗(yàn)過程中還觀察到，當(dāng)向Co2+溶液中加入G4.0 PAMAM 后，溶液瞬間由原來的粉紅色變?yōu)榱咙S色，而加入G3.5 PAMAM 溶液沒有變化。

圖1 不同代數(shù)PAMAM 水溶液的紫外可見光吸收光譜

圖2 不同代數(shù)的PAMAM/Co2+配合物和CoCl2 溶液的紫外可見吸收光譜

2.6 各類PAMAM 樹狀大分子對(duì)牛血清白蛋白熒光的猝滅作用結(jié)果

圖3 是295 nm 激發(fā)波長(zhǎng)下不同濃度G4.0 PAMAM對(duì)BSA 熒光光譜的影響，加入樹狀大分子后熒光強(qiáng)度降低。 對(duì)于所有類型的樹狀大分子，它們濃度的增加均可引起色氨酸殘基熒光的線性下降，并且通過穩(wěn)定性考察發(fā)現(xiàn)這種猝滅作用瞬間即可達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。上述現(xiàn)象說明PAMAM 樹狀大分子同BSA 之間存在相互作用。

圖4 是根據(jù)公式F0/F=1+Ks[Q]（其中F0為猝滅體不存在的熒光強(qiáng)度，F(xiàn) 為加入猝滅體后的熒光強(qiáng)度，Ks為雙分子猝滅常數(shù)，[Q]為猝滅體濃度）得到的各類樹狀大分子對(duì)BSA 熒光猝滅的Stern-Volmer 曲線圖。

樹狀大分子對(duì)色氨酸熒光猝滅的Stern-Volmer常數(shù)見表1。Ksv 值越大，則說明PAMAM 樹狀大分子與BSA 間的相互作用越強(qiáng)。 根據(jù)表1 中Ksv 數(shù)據(jù)推測(cè)PAMAM 樹狀大分子與BSA 的相互作用強(qiáng)弱順序：G4.0>G3.5。 并且各種猝滅劑對(duì)生物大分子最大動(dòng)態(tài)猝滅過程的猝滅常數(shù)都不大于0.2 L/mmol[12～13]，而表1 中的各Ksv 值均大于此值，可由此推斷該猝滅過程是由于各類樹枝狀大分子與BSA 之間形成了配合物所引起的靜態(tài)猝滅，而非樹狀大分子擴(kuò)散時(shí)所引起的動(dòng)態(tài)猝滅。

圖3 PAMAM-BSA 的熒光猝滅光譜

圖4 G3.5 PAMAM-BSA、G4.0 PAMAM-BSA 體系的Stern-Volmer 曲線

表1 各體系的熒光猝滅常數(shù)及相關(guān)系數(shù)

2.7 熒光光譜法研究Co2+對(duì)BSA 的猝滅作用

圖5 為Co2+對(duì)BSA 的熒光猝滅光譜圖，經(jīng)Stern-Volmer 方程[y=0.2533x+1.0124，其中x 為Co2+濃度（mmol/L），y 為F0/F，相關(guān)系數(shù)r=0.9973]處理后得圖6，由圖6 可見，加入高濃度Co2+后，F(xiàn)0/F 值只發(fā)生略微增加，說明Co2+對(duì)BSA 的猝滅作用很小，其Ksv 值僅為0.2533 L/mmol。

圖5 Co2+-BSA 的熒光猝滅光譜

圖6 Co2+-BSA 體系Stern-Volmer 曲線

2.8 熒光光譜法研究PAMAM 樹狀大分子對(duì)Co2+和BSA 相互作用的影響

圖7 為PAMAM 樹狀大分子對(duì)BSA-Co2+二元體系的熒光猝滅光譜圖。隨著PAMAM 樹狀大分子濃度的增加，熒光猝滅增強(qiáng)。 由其Stern-Volmer 曲線（圖8，yG4.0PAMAM=1.7170x+1.0053，yG3.5PAMAM=1.3410x+1.0093，其中x 為相應(yīng)PAMAM 濃度（mmol/L），y 為F0/F，相關(guān)系數(shù)r=0.9984，0.9971）和表2 可知，Co2+的存在使G4.0 PAMAM 樹狀大分子對(duì)BSA 的猝滅降低，Ksv 值由2.7358 L/mmol 降至1.7170 L/mmol，這可能是由于Co2+先與PAMAM 之間發(fā)生了較強(qiáng)的配位作用，導(dǎo)致G4.0 PAMAM 與BSA 結(jié)合的區(qū)域構(gòu)型、電荷等發(fā)生變化，使G4.0 PAMAM 樹狀大分子對(duì)BSA 的猝滅減弱，也可能是由于Co2+優(yōu)先占據(jù)了BSA 的某些位點(diǎn)且很穩(wěn)定，從而減弱了PAMAM 與BSA 的結(jié)合。 而G3.5 PAMAM 與Co2+基本不發(fā)生配位作用，因此Co2+的加入基本上對(duì)猝滅作用沒有影響。

圖7 G4.0 PAMAM-（BSA- Co2+）的熒光猝滅光譜

圖8 PAMAM-（Co2+-BSA）體系的Stern-Volmer 曲線

表2 各體系的熒光猝滅常數(shù)及相關(guān)系數(shù)

3 討論

采用紫外光譜法研究?jī)深怭AMAM 樹狀大分子與Co2+的相互作用，結(jié)果表明應(yīng)，Co2+可與G4.0 PAMAM配位，而與G3.5 PAMAM 幾乎無作用。由于加入G4.0 PAMAM 時(shí)，Co2+同其端基-伯胺基配位，使得Co2+的d軌道分裂能ΔE 值增大，兩者混合溶液在可見光區(qū)域最大吸收波長(zhǎng)向短波方向移動(dòng)。 對(duì)于G3.5 PAMAM而言，由于其端基-酯基的配位能力弱，很難與Co2+配位，另外由于PAMAM 樹狀大分子的球體外形，當(dāng)溫度低于25℃時(shí)，Co2+克服不了G3.5 PAMAM 的空間位阻，不能進(jìn)入到其分子內(nèi)層與叔胺基進(jìn)行配位[14]，所以導(dǎo)致了G3.5 PAMAM 與Co2+的混合溶液在可見光區(qū)域幾乎沒有吸收。 用熒光光譜法研究生理?xiàng)l件下（pH=7.4）PAMAM、BSA、Co2+三者之間的相互作用，研究結(jié)果表明，在Co2+-BSA 體系中，Co2+對(duì)BSA 的猝滅作用很小，Co2+導(dǎo)致了G4.0 PAMAM 與BSA 的猝滅常數(shù)明顯減小，Ksv 值由2.7358 L/mmol 降至1.7170 L/mmol，而對(duì)G3.5 PAMAM 與BSA 的相互作用影響不大，Ksv值由1.3447 L/mmol 至1.3410 L/mmol。 這可能是由于Co2+先與PAMAM 之間發(fā)生了較強(qiáng)的配位作用，導(dǎo)致G4.0 PAMAM 與BSA 結(jié)合的區(qū)域構(gòu)型、電荷等發(fā)生變化，使G4.0 PAMAM 樹狀大分子對(duì)BSA 的猝滅減弱，也可能是由于Co2+優(yōu)先占據(jù)了BSA 的某些位點(diǎn)且很穩(wěn)定，從而減弱了PAMAM 與BSA 的結(jié)合。而G3.5PAMAM與Co2+基本不發(fā)生配位作用，因此Co2+的加入基本上對(duì)猝滅作用沒有影響。

由此可見，Co2+的存在可在一定程度上影響具有末端氨基的PAMAM 樹狀大分子與BSA 間的相互作用，對(duì)研究該類藥物載體與BSA 的結(jié)合有指導(dǎo)作用。

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