章志超，桂 萌，彭朝輝，李平蘭,*

（1.中國農業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083；2.北京北水食品工業(yè)有 限公司， 北 京 100068）

鱘魚中熒光假單胞菌生長預測模型構建及貨架期預測

章志超1，桂 萌1，彭朝輝2，李平蘭1,*

（1.中國農業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083；2.北京北水食品工業(yè)有 限公司， 北 京 100068）

為快速預測有氧貯藏鱘魚的貨架期、預防魚肉變質，通過將鱘魚有氧冰藏條件下的特定腐敗菌（熒光假單胞菌）接種于滅菌鱘魚片后置于0、4、10、15、20 ℃有氧貯藏，分析其生長動態(tài)及貨架期終點的感官評分、pH值和揮發(fā)性鹽基氮值，在以修正的Gompertz方程為一級模型的基礎上，分別以平方根方程和Arrhenius方程為二級模型，建立 并驗證熒光假單胞菌 的生長預測模型。結果顯示：熒光假單胞菌菌數(shù)的最小腐敗值為（7.35±0.05）（lg（ CFU/g））；同時，分別在8 ℃ 和波動溫度 條件下對模型驗證的結果表明：基于平方根方程的熒光假單胞菌生長預測模型的殘差分布在- 0.09～0.10之間，準確度Af為1.14、1.17，偏 差度Bf為 0.97、1.02，貨架期預測相對誤差為-7.95%、-3.28%；而基于Arrheni us方程的模型誤差較大，其中殘差分布在-0.17～0.24 之間，Af為1.21、1.31，Bf為0.94、1.08，貨架期預測相對誤差為24.87%、7.54%。因此，基于平方根方程建立的模型可以更有效地預測有氧包裝鱘魚在0 ～20 ℃貯藏溫度條件下的熒光假單胞菌的生長及相應貨架期。

鱘魚；熒光假單胞菌；溫度；預測模型；貨架期

鱘魚是世界上一種最古老的中大型淡水魚類，有“水中活化石”之稱[1]。它具有低脂肪、低能量、高蛋白和多不飽和脂肪酸含量豐富的特點，味道鮮美，經濟價值較高[2]。近年來，隨 著鱘魚人工繁育及養(yǎng)殖技術的不斷發(fā)展與推廣，我國已成為鱘魚養(yǎng)殖的世界第一大國[3]。但新 鮮魚肉因營養(yǎng)豐富、水分含量高 等特點而極易腐敗。Gram等[4]研究發(fā)現(xiàn)，在貯藏過程中逐 漸占據(jù)優(yōu)勢地位并產生腐敗代謝產物的特定腐敗菌（specific spoilage organism，SSO）是促使魚肉腐敗的最重要原因之一。由于冷藏鮮魚貨架期短，容易成為食品安全隱患，因此確定魚肉在貯藏中的SSO并建立其生長預測模型來預測產品 貨架期，是預防魚肉腐敗變質的關鍵手 段之一。

目前微 生物預測模 型已廣泛應用于食 品行業(yè)當中，其中修正的Gompertz方程、Baranyi方程及Logistic方程是應用較為廣泛的一 級模型；二級 模型中，平方根方程及Arrhenius方程使用最為普遍，其中溫度是二級模型研究中考慮最多的因素[5]。根據(jù)現(xiàn)有文獻報道，雖然針對假單胞菌生長預測模型研究較多，但多以液體培養(yǎng)基為培養(yǎng)介質[6-7]或選擇性培養(yǎng)基計數(shù)[8-11]獲得實驗數(shù)據(jù)，雖然操作簡便，但沒有考慮到食品基質間的組織復雜性和差異性等因素。當然，每種模型都有不同的適用對象和范圍，因此需要根據(jù)產品特點和相應腐敗現(xiàn)象，選擇合適的數(shù)學模型進行評價，才能保證所構建的模型具有實用價值。

目前針對鱘魚SSO的生長預測模型和貨架期模型的研究較少，本研究以鱘魚有氧冰藏確定的SSO—熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）為實驗菌株，將SSO反接于無菌的食品基質中以有效控制微生物初始菌數(shù)、保證所建的模型的穩(wěn)定性、有效模擬實際微生物生長環(huán)境，利用修正的Gompertz模型對SSO在有氧包裝的無菌鱘魚魚片中的生長情況進行擬合，同時就平方根方程與Arrh enius方程描述溫度對特定腐敗菌生長動力學參數(shù)的影響進行了比較。在此基礎上，建立了0～20 ℃范圍內的特定腐敗菌生長預測模型及鱘魚貨架期預測模型，并對模型的可靠性進行了評價，為快速預測有氧貯藏鱘魚的貨架期提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活鱘魚（質量1～1.5 kg，體長40～50 cm）購自北京回龍觀城北水產 市場；熒光假單胞菌分離于貨架期終點的有氧冰藏鱘魚魚肉中，并由菌相和腐敗能力分析確定為有氧貯藏鱘魚的特定腐敗菌；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、假單胞菌分離培養(yǎng)基 青島海博生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

LSB35L-I型立式壓力滅菌器 江陰濱江醫(yī)療設備有限公司；KDY-9820型凱氏定氮儀 北京通潤機電技術公司；Satroris PB-10型pH計 賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；LRH-250型生化培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 滅菌鱘魚片 的制備

參照Macé等[11]的方法并適當調整：將購買的鮮活鱘魚敲擊頭部致死后，立刻用50 g/L Na2CO3溶液清洗去除 表面黏液，去除頭、尾、內臟。在無菌環(huán) 境下再依次用50 g/L Na2CO3溶液、2%福爾馬林溶液清洗，無菌條件下切成魚片（每片約30 g），用無菌水充分洗凈后瀝干。經培養(yǎng)計數(shù) ，滅菌魚片的細菌總數(shù)小于2（lg（CFU/g））。

1.3.2 菌懸液的制備

將從有氧貯藏鱘魚腐敗終點分離得到、甘油管保藏的熒光假單胞菌于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中活化2次，再以2%接種量接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)約12 h，使菌懸液濃度達到8 （lg（CFU/mL）），稀釋至5 （lg（CFU/mL））后用于魚片接種。

1.3.3 接種與貯藏

參照李學英等[12]的方法并作適當調整?。簩⒅苽浜玫臏缇~片浸于5 （lg（CFU/mL））菌液中，1 5 s后澇出瀝干，經測定魚肉初始接種量為3～4 （lg（CFU/g）），將接種后的魚塊無菌托盤包裝，實驗設空白對照， 分別置于0、4、8、10、15、20 ℃及波動溫度條件下貯藏（參考SC/T 2009-1999《水產品加工質量管理規(guī)范》[13]設計：20 ℃，6 h（加工）；0 ℃，2 d（運輸銷售）；20 ℃，2 h（購買回家）；4 ℃，貯藏（家庭貯藏））。

1.3.4 指標測定

1.3.4.1 感官評價

感官評價采用質量指數(shù)法（quality index method，QIM）。參照朱志偉等[14]的方法并適當調整：參照評定人員由經過專門培訓的6 名人員組成。隨機抽取不同貯藏期的魚肉樣品，對魚肉的顏色、光澤度、通透性、氣味、表面黏液和質地進行評價。 QIM中每個參數(shù)的分值范圍根據(jù)貯藏期的變化特征在0～3之間，其中0 代表最佳的品質，分數(shù)越高質量越差。每個參數(shù)分值相加，形成QI值，用以代表魚肉品質。

1.3.4.2 菌落計數(shù)

參照GB/T 4789.2-2010《食品衛(wèi)生微生物學檢驗：菌落總數(shù)測定》[15]方法，采用假單胞分離培養(yǎng)基對假單胞菌進行計數(shù)。

1.3.4.3 pH測定

采用GB/ T 5009.45-2003《水產品衛(wèi)生標準的分析方法》[16]中的酸度計法測定。

1.3.4.4 揮發(fā)性鹽基氮（total volatile base nitrogen，TVBN）含量測定

采用GB/T 5009.44-2003《肉與肉制品衛(wèi)生標準的分析方法》[17]中半微量定氮法測定。

1.3.5 熒光假單胞菌生長預測模型的建立

在0、4、10、15、20 ℃獲得的熒光假單胞菌的生長數(shù)據(jù)，用修正的Gompertz模型擬合不同溫度條件下熒光假單胞菌的生長動態(tài)。修正的Gompertz模型如式（1）[18-19]：

式（1）中：Nt為t時刻微生物的對數(shù)值（lg（CFU/g））；N0和Nmax分別為Nt的初始值、最大值（lg（CFU/g））；λ為恒溫條件下遲滯期/h；k為最大比生長速率/h-1。

Bělehrádek平方根方程[20]、Arrhenius方程[21]廣泛用于描述溫度對熒光假單胞菌的最大比生長速率k和延滯期λ的影響，其表達如式（2）、（3）：

式（2）中：T為攝氏溫度/℃；Tmin為微生物沒有代謝活動時的理論最小溫度/℃；bk、bλ為方程常數(shù)。

式（3）～（5）中：T為絕對溫度/K；Tref為基準溫度（273K）；k0和λ0分別為Tref時的最大比生長速率/h-1和延滯時間/h；Eak、Eaλ分別是k、λ的活化能/（kJ/mol）；R為通用的氣體常數(shù)/（J/（mol·K））。

1.3.6 生長預測模型可靠性評價

評價預測模型可靠性的最有效的手段之一是將預測值與真實檢測數(shù)據(jù)進行比較。本研究采用準確度（Af）、偏差度（Bf）及殘差分析來評價建立的生長預測模型的可靠性。同時參考實際流通條件，以8 ℃和波動溫度（同1.3.3節(jié)）條件下貯藏鱘魚實驗得到的熒光假單胞菌生長實測值與模型預測值進行比較，驗證生長預測模型的可靠性。其中Af、Bf的表達式[22]如下：

式中：n為實驗次數(shù)；Ni預為第i次實驗預測值；Ni實為第i次實驗實測值。

1.3.7 鱘魚貨架 期（shelf life，SL）預測及評價

0～20 ℃的貯藏溫度范圍內，在建立的熒光假單胞菌生長預測模型的基礎上，利用鱘魚中熒光假單胞菌從初始菌數(shù)增殖到感官拒絕點時的最小腐敗菌數(shù)的時間來表示有氧貯藏鱘魚的貨架期。將在8 ℃和波動溫度條件下有氧貯藏的鱘魚貨架期實測值與模型預測值進行比較，根據(jù)相對誤差的評價貨架期預測的可靠性。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有實驗重復測定2 次，數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SPSS 17.0和ANOVA方差分析處理，結果以“平均值±標準誤差”表示。

2 結果與分析

2.1 熒光假單胞菌生長預測模型的建 立與可靠性評價

2.1.1 不同貯藏溫度條件下熒光假單胞菌的生長預測模型的建立

圖1 鱘魚在不同溫度條件下的熒光假單胞菌生長曲線Fig.1 Grow th curves of Pseudo monas fl uorescens in sturgeon stored at different temperatures

由表1可知，利用修正的Gompertz方程擬合的R2均大于0.97，擬合度高，模型均為極顯著（P＜0.000 1），說明該一級模型能夠很好地描述熒光假單胞菌的在不同溫度條件下的生長曲線，許振偉等[23]對鯉魚、羅非魚等研究中均有類似結論。同時，初始菌數(shù)值集中在3～4 lg（CFU/g），符合實驗預期；穩(wěn)定期的最大菌數(shù)對數(shù)9～10 （lg（CFU/g）），平均值為9.55（lg（CFU/g）），受溫度影響不大；隨著溫度的升高，熒光假單胞菌的最大比生長速率k從0℃時的0.02/h增加到20℃的0.24/h；而生長延滯期λ則隨溫度的升高而減小，0℃時的延滯期最長，為118.93 h，20 ℃時縮短為1.86 h，說明在0～20 ℃范圍內，貯藏溫度對熒光假單胞菌的k、λ等影響較大。因此貯藏溫度常被認為是肉品腐敗中最重要的影響因素[24]，在SSO二級模型研究中也考慮較多。

表1 不同溫度條件下的熒光假單胞菌的生長動力學參數(shù)Table1 Kinetic parameters of Pseudomonas fluoresceennss growth at different temperatuurreess

2.1.2 溫度對熒光假單胞菌生長動力學參數(shù)的影響

圖2 溫度對熒光假單胞菌的最大比生長速率（k）、延滯期（λ）的影響Fig.2 Effect of temperature on maximum specific growth rate (k) and lag phase (λ) of Pseudomonas fl uorescens

分別利用平方根方程和Arrhenius方程描述溫度T與最大比生長速率k、延滯期λ的關系，從圖2可以看出：實際觀測值都在95%預測置信區(qū)間之內，同時平方根方程和Arrhenius方程分別對k、λ的擬合度均大于0.93，表現(xiàn)出良好的線性相關性。假單胞菌在青魚、多寶魚等生長數(shù)據(jù)均得到類似結論[8,25]；平方根方程和Arrhenius方程對T與k的關系的擬合效果均好于對T與λ的關系，這可能是由于延滯期受計數(shù)時間、條件的波動和微生物物種的差異等影響較大，從而導致延滯期的預測重復性較最大比生長速率差，預測難度也更大[7]。

2.1.3 熒光假單胞菌生長預測模型的建立與可靠性評價

將2.1.2節(jié)中的方程A、B代入修正的Gompertz方程，可以得到基于平方根方程的熒光假單胞菌在0～20 ℃條件下的生長預測模型Ⅰ，表達如下：

同理，將2.1.2節(jié)中的方程C、D代入修正的Gompertz方程，可以得到基于Arrhenius方程的熒光假單胞菌在0～20 ℃條件下的生長預測模型Ⅱ，表達如下：

表2 8 ℃、波動溫度條件下模型預測準確度（Af）和偏差度（Bf）Table2 Comparison of Afand Bffrom different models under isothermal (8 ℃) and non-isothermal conditions

冷鏈鮮魚的溫度一般保持在0～8 ℃[26]，但在實際加工與流通過程也可能發(fā)生冷鏈中斷等情況而造成貯藏溫度波動。為使建立的模型更具實用價值，選取在8 ℃、波動溫度條件下熒光假單胞菌的生長情況對預測模型進行驗證。利用預測值和觀察值的直觀對比圖可以揭示偏差，殘差值越接近0，模型越可靠。根據(jù)熒光假單胞菌的菌數(shù)對數(shù)值的殘差分析：基于方程（8）得到的8 ℃、波動溫度的殘差值均在在±0.1以內，沒有離群值，觀測值較為可靠。但方程（9）得到的8 ℃條件下的殘差分布在-0.17～0.1，波動溫度為-0.15～0.24，殘差分布相對較散。

為進一步對微生物生長預測模型驗證，Ross[22]引入偏差因子衡量預測值和觀測值之間的平均偏差，利用準確因子評估所建立模型的準確度，其中Af、Bf為1.0表示模型擬合效果最理想。由表2可知，在8℃、波動溫度條件下，方程（8）得出的Bf分別為0.97、1.02，Bf平均值為1.00，說明生長預測模型Ⅰ的預測值與實測值基本一致（Bf=1）；而方程（9）得出的Bf則為0.94和1.08，Bf平均值為1.01，生長預測模型Ⅱ預測值超出實測值1%（Bf＞1），可認為這類模型是安全的（faildangerous）[22]。方程（8）、方程（9）的Af分別為1.14～1.17、1.21～1.31，則生長預測模型Ⅰ的預測誤差可能在14%～17%，生長預測模型Ⅱ的預測誤差可能在21%～31%，可見基于平方根方程的生長預測模型Ⅰ的預測效果更好。Koutsoumanis等[9]用平方根方程建立了在變溫下金頭鯛中假單胞菌生長預測模型，預測效果與本研究類似，其中Bf均值為1.04，Af為1.11～1.17，可能的預測誤差為11%～17%等；而Bruckner等[10]基于Arrhenius方程的豬肉中假單胞菌生長預測模型的Bf均值為0.97，Af為1.05～1.24，可能的預測誤差為5%～24%等，結果較本研究略好。這可能與不同假單胞菌菌種的腐敗能力及其作用的食品基質等差異有關。

2.2 0～20 ℃鱘魚貯藏貨架期模型的建立與可靠性評價

2.2.1 特定腐敗菌最小腐敗值的確定

表3 不同貯藏溫度條件下感官拒絕點的各指標測定Table3 Physiochemical properties of surgeon stored at different temperatures at the end of shelf life

表3表明，經感官評價得出有氧包裝鱘魚片在0、4、10、15 ℃和20 ℃條件下分別在284.00、189.33、37.00、23.00和17 h達到感官拒絕點，即貨架期終點。同時當達到感官拒絕點時，不同溫度條件下QI值集中在9～10，pH值約為6.60～6.80，菌數(shù)平均對數(shù)值為（7.35±0.04）（lg（CFU/g）），TVBN平均值為（20.99±1.27）mg/100 g，達到GB 2733-2005《鮮、凍動物性水產品衛(wèi)生標準》[27]對淡水魚的20 mg/100 g衛(wèi)生限值，說明當菌數(shù)對數(shù)值超過上述的范圍，魚肉可能腐敗，因此，確定熒光假單胞菌菌數(shù)的最小腐敗平均值為7.35（lg（CFU/g））。國際食品微生物規(guī)格委員會規(guī)定：消費者對食品中微生物可接受限值為7.00（lg（CFU/g））[28]；Bruckner等[10]研究在有氧包裝豬肉、禽肉中SSO（假單胞菌）生長情況時，也得到相似的結果，SSO的最小腐敗值為7.50（lg（CFU/g）），說明本實驗確定的SSO的菌數(shù)最小腐敗值是可接受的。

2.2.2 貨架期預測模型的建立與可靠性評價

已確定的SSO菌數(shù)最小腐敗值，結合2.1.2節(jié)中的方程A、B，由修正的Gompertz方程可以出鱘魚在0～20 ℃的貨架期預測模型Ⅰ，其表達如下：

同理，結合2.1.2節(jié)中的方程C、D可以推導出鱘魚在0～20 ℃的貨架期預測模型Ⅱ：

表4 8 ℃、波動溫度條件下對貨架期預測模型驗證Table4 Validation of shelf life prediction models under isothermal (8 ℃) and non-isothermal conditions

根據(jù)實際的冷鏈流通情況，在8 ℃、波動溫度條件下對貨架期預測模型進行驗證。由表4可知：當達到感官拒絕點時，8 ℃和波動溫度條件下的菌數(shù)對數(shù)值分別為（7.56±0.08）（lg（CFU/g））、（8.43±0.03）（lg（CFU/g）），大于熒光假單胞菌菌數(shù)的最小腐敗值，由于不可能做到對樣品實時監(jiān)測，波動溫度條件下的4 ℃貯藏階段只能每12 h監(jiān)測一次，這可能是造成誤差的原因，但QI、pH值和TVBN值均處于確定的最小腐敗水平范圍內，因此表4數(shù)據(jù)仍具有參考價值。與建立的鱘魚貨架期預測模型得到的預測值相比較，方程（10）對8 ℃、波動溫度的預測相對誤差分別為-7.95%和-3.28%，均小于10%，預測效果良好；而方程（11）的預測相對誤差則分別為24.87%和7.54%，對8 ℃條件下的貨架期預測偏差較大；可見方程（10）對貨架期的預測效果更好。但同一模型在類似的應用（相同的SSO及包裝形式等）中，結果仍存在一定的差異。在Gompertz、平方根方程基礎上，Koutsoumanis等[9]建立的金頭鯛、碎肉貨架期預測模型的預測相對誤差為5.80%、13.10%；宋志強等[8]貨架期預測相對誤差則為5.74%～20.80%；Bruckner等[10]基于Gompertz、Arrhenius方程對豬肉、禽肉貨架期預測相對誤差則為-0.60%～13.30%、-0.50%～26.20%。這可能與研究對象差異、數(shù)據(jù)采集點的方式和采集數(shù)量及確定感官拒絕點的主觀差異等有關。

3 結 論

修正的Gompertz模型能夠很好地擬合0、4、10、15 ℃和20 ℃條件下SSO（熒光假單胞菌）在有氧貯藏鱘魚片中生長情況。在此基礎上，基于平方根方程的溫度模型對0～20 ℃范圍內的有氧貯藏鱘魚片的SSO生長動態(tài)和相應的鱘魚貨架期的預測誤差更小，預測效果更好。

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Predictive Modeling of Pseudomonas fl uorescens Growth and Shelf Life Prediction of Stu rgeo n

ZHANG Zhi-chao1, GUI Meng1, PENG Chao-hui2, LI Ping-lan1,*
(1. College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural U nive rsity, Beijing 100083, China; 2. Beijing Beis hui Food Co. Ltd., Beijing 100068, China)

The aim of this study was to establish predictive models for the growth of Pseudomonas fl uorescens in sturgeon and its shelf life. Pseudomonas fluorescens, the special spoilage organi sm (SSO) of aerobically stored sturgeon, was inoculated to sterile sturgeon fi llets and stored aerobically at 0, 4, 10, 15 or 20 ℃. The models were developed based on the data of kinetic growth of Pseudomonas fl uorescens and sensory evaluation, pH, total volatile base nitro gen (TVBN) at the end of the shelf life of sturgeon. On the basis of the m odifi ed Gompertz equation, square root equations and Arrhenius equations were used as the secondary models to construct the prediction models of growth and shelf life for Pseudom onas fl uorescens. The results showed that the average logarithmic val ue of Pseudomonas fl uorescens was (7.35 ± 0.05) lg (CFU/g) at the end of shelf life. Meanwhile, the models were validated under isothermal (8 ℃) and non-isothermal conditions. The residual errors, accuracy factors (Af), bias factors (Bf) and relative errors of shelf lives from the models based on square root equations we re -0.09–0.10, 1.14 and 1.1 7, 0.97 and 1.02, and -7.95% and -3.28%, respectively. In contrast, the residual errors, Af, Bf, and relative errors of shelf lives from the models based on Arrhenius equation were -0.17–0.24, 1.21 and 1.31, 0.94 and 1.08, and 24.87% and 7.54%, re spectively. In conclusi on, the square root equatio n models were more ef fective for predi cting the growth of Pseudomonas fl uorescens and the shelf lives of sturgeon stored aerobically at 0–20 ℃.

sturgeo n; Pseudomonas fl uorescens; tem perature; prediction mo del; shelf life

S983

A

1002-6630（2014）10-0278-06

10.7506/spkx1002-6630-201410052

2014-01-04

北京市鱘魚、鮭鱒魚創(chuàng)新團隊項目（SCGWZJ20131105-2）

章志超（1989—），男，碩士研究生，研究方向 為食品微生物學。E-mail：zhgio2008@126.com

*通信作者：李平蘭（1964—），女，教授，博士，研究方向為食品微生物學。E-mail：lipinglan@cau.edu.cn