曾祥宏，王振宇,2,，李 輝，左麗麗

（1.哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，極端環(huán)境研究所，黑龍江 哈爾濱 150090；2.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040）

二維多通道色譜法分離松多酚的條件優(yōu)化

曾祥宏1，王振宇1,2,*，李 輝1，左麗麗1

（1.哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，極端環(huán)境研究所，黑龍江 哈爾濱 150090；2.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040）

以東北紅松松塔為原料，采用本課題組設(shè)計(jì)的二維多通道色譜分離設(shè)備，確定其分離松多酚的最佳工藝條件。首先通過(guò)靜態(tài)吸附解吸實(shí)驗(yàn)，篩選二維多通道色譜分離設(shè)備的固相介質(zhì)和洗脫劑；然后進(jìn)行單因素動(dòng)態(tài)試驗(yàn)，考察影響二維多通道色譜設(shè)備分離效果的4 個(gè)因素：上樣量、上樣質(zhì)量濃度、洗脫速率和色譜柱數(shù)量。結(jié)果表明：X-5大孔樹(shù)脂為二維多通道色譜設(shè)備分離松多酚的最佳固相介質(zhì)，0.5%甲酸-60%乙醇溶液為其最佳洗脫劑，其對(duì)松多酚的最大吸附量為 38.74 mg/g，解吸率達(dá)72.08%；二維多通道色譜設(shè)備分離松多酚的最佳工藝條件：上樣量256 mg、上樣質(zhì)量濃度2.0 mg/mL、洗脫速率（200±20）mL/min和色譜柱聯(lián)用數(shù)量4 根。在此條件下，松多酚純度由2.37%提高到了23.257%，產(chǎn)率達(dá)到46.81%。

二維多通道色譜；松多酚；分離純化；大孔樹(shù)脂

近些年，研究發(fā)現(xiàn)松科植物體內(nèi)含有大量具有一系列獨(dú)特理化性質(zhì)和生物活性的多酚類化合物，即松屬植物多酚，簡(jiǎn)稱松多酚。松多酚是一種色素類天然抗氧化劑[1]，研究發(fā)現(xiàn)，其具有抗氧化[2-3]、抗腫瘤[4-5]、抗輻射[6]、降血糖血脂[7-8]等多種生理功能，因此開(kāi)發(fā)松多酚具有廣闊的市場(chǎng)前景。但是，大批量、工業(yè)化生產(chǎn)高純度的松多酚成為制約其市場(chǎng)化的瓶頸。

大孔吸附樹(shù)脂是一種高分子聚合物，由于其特殊的空間結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定的物理化學(xué)性質(zhì)，使其具有很好的吸附性和選擇性，逐漸運(yùn)用于活性物質(zhì)的分離純化[9-10]。目前，以大孔吸附樹(shù)脂為固相介質(zhì)的色譜分離純化技術(shù)在植物功能性化學(xué)成分的分離、純化以及富集中的應(yīng)用日趨廣泛[11-12]，同時(shí)，對(duì)多酚類化合物的分離純化也有著大量的應(yīng)用[13]；但是所采用的色譜分離技術(shù)大部分都是傳統(tǒng)的柱色譜分離、液相色譜分離和逆流色譜分離技術(shù)，它們具有分離效率低、洗脫劑消耗大、分離量小、分離周期長(zhǎng)等缺點(diǎn)[14-19]。因此，本課題組在傳統(tǒng)柱色譜分離技術(shù)的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了二維多通道色譜分離設(shè)備，本實(shí)驗(yàn)將運(yùn)用該設(shè)備，確定其分離純化松多酚的最佳工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅松種子外殼（紅松松塔），產(chǎn)地黑龍江省伊春。

大孔樹(shù)脂 天津歐瑞生物科技有限公司；福林-酚天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；沒(méi)食子酸、無(wú)水碳酸鈉、濃硫酸、濃鹽酸、95%乙醇等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LD5-2A低速離心機(jī) 北京醫(yī)用離心機(jī)廠；RE-3000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化器廠；721型可見(jiàn)分光光度計(jì) 天津市普瑞斯儀器有限公司；DFY-500 500 g搖擺式高速中藥粉碎機(jī) 浙江溫嶺市大海藥材器械廠；JCW-1000W超聲波發(fā)生器 山東省濟(jì)寧市超聲電子儀器；101-2A型電熱鼓風(fēng)干燥箱 天津市秦斯特儀器有限公司；二維多通道色譜分離設(shè)備 課題組自主設(shè)計(jì)；規(guī)格4 cm×20 cm色譜柱 定制。

1.3 方法

1.3.1 二維多通道色譜法的構(gòu)建

1.3.1.1 構(gòu)建原理

二維多通道色譜分離純化設(shè)備，是一種利用目標(biāo)物質(zhì)與介質(zhì)的吸附原理進(jìn)行液體分離操作的傳質(zhì)系統(tǒng)。在傳統(tǒng)色譜柱的基礎(chǔ)上，將一根整體的傳統(tǒng)色譜柱，分割成若干小的色譜柱，設(shè)立吸附域和分離域，然后通過(guò)管道和閥門(mén)連接，再由中央分配系統(tǒng)控制，從而形成串聯(lián)模式、單通道和多通道并聯(lián)多種分離純化模式。原理如圖1所示。

圖1 二維多通道色譜分離設(shè)備設(shè)計(jì)原理圖Fig.1 Schematic representation of two-dimensional multi-channel chromatographic separator

1.3.1.2 設(shè)備構(gòu)成

根據(jù)原理圖設(shè)計(jì)，為了使設(shè)備更加簡(jiǎn)捷化，對(duì)設(shè)備各部分進(jìn)行模板集成化處理，最終由5大主要系統(tǒng)構(gòu)成，分別為自動(dòng)化控制系統(tǒng)、中央分配系統(tǒng)、檢測(cè)系統(tǒng)、柱吸附分離體系和料液控制體系，如圖2所示。

圖2 二維多通道色譜分離設(shè)備CAD設(shè)計(jì)圖Fig.2 CAD diagram of two-dimensional multi-channel chromatographic separator

1.3.1.3 操作流程

啟動(dòng)二維色譜設(shè)備進(jìn)樣，樣品在二維多通道色譜分離設(shè)備的吸附域吸附3 h，然后水洗，直至水洗液為澄清時(shí)停止水洗。然后開(kāi)啟二維多通道色譜分離設(shè)備的串聯(lián)模式，由靜態(tài)試驗(yàn)確定的洗脫劑進(jìn)行分離洗脫；當(dāng)串聯(lián)模式的出水口，出現(xiàn)顏色變化時(shí)立即停止分離洗脫，關(guān)閉串聯(lián)模式；然后啟動(dòng)二維色譜并聯(lián)模式，洗脫樣品，收集2 個(gè)柱體積。

1.3.2 松多酚粗提物制備[20]

首先，對(duì)紅松松塔進(jìn)行預(yù)處理，放入烘箱烘干，溫度50 ℃、時(shí)間12 h；烘干后粉碎并過(guò)30 目篩。然后，稱取一定質(zhì)量處理后的紅松松塔原料，以1：20的料液比加入60%乙醇提取液，超聲萃取2次，超聲功率1 000 W，每次超聲1～2 h；合并初提液，離心處理，5 000 r/min離心5 min；取上清液并抽濾處理。最后，對(duì)處理好的初提液進(jìn)行旋蒸濃縮，至無(wú)醇味，得松多酚粗提物以備用。

1.3.3 福林酚試劑法測(cè)定多酚[21]

1.3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

準(zhǔn)確稱取10 mg沒(méi)食子酸，加入蒸餾水定容至100 mL，混合均勻得100 μg/mL的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)母液，然后由標(biāo)準(zhǔn)母液配制質(zhì)量濃度為10、20、30、40、50、60 μg/mL的沒(méi)食子酸溶液。取0.5 mL各質(zhì)量濃度沒(méi)食子酸溶液，分別置于10 mL的比色管，然后加入1.0 mL的福林試劑混合，在室溫條件下保持5 min；再加入1.0 mL 10%的碳酸鈉溶液，用蒸餾水定容至3.0 mL。在室溫條件下反應(yīng)2 h，以相應(yīng)試劑為空白對(duì)照，測(cè)定溶液在760 nm波長(zhǎng)處吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

1.3.3.2 松多酚含量的測(cè)定

取一定量的松多酚提取物樣品，根據(jù)情況稀釋50或100 倍；然后取0.5 mL稀釋過(guò)的松多酚粗提液樣品，置于10 mL的比色管，根據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法做同樣的處理，同樣以相應(yīng)試劑為空白對(duì)照，在760 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算得到松多酚粗提物含量。

1.3.4 大孔樹(shù)脂的篩選[11]

本研究選取的6 種大孔樹(shù)脂的型號(hào)及物理結(jié)構(gòu)參數(shù)如表1所示。

表1 6 種大孔樹(shù)脂物理結(jié)構(gòu)參數(shù)Table1 Physical structure parameters of 6 kinds of macroporous resins

取一定量已預(yù)處理的6 種固相介質(zhì)，進(jìn)行烘干處理（60 ℃、8 h），然后準(zhǔn)確稱取0.5 g，放入錐形瓶，95%乙醇浸泡，24 h后水洗至中性，真空抽干以備用。隨后，加入40 mL 2.173 mg/mL的松多酚粗提液；置于恒溫振蕩器，溫度（30±2）℃、振速100 r/min、時(shí)間10 h，待充分吸附后過(guò)濾，測(cè)定濾液吸光度，然后計(jì)算松多酚在各樹(shù)脂中的吸附量和吸附率。

將上述以吸附的6 種固相介質(zhì)進(jìn)行水洗，至水洗液無(wú)色；然后加入40mL 60%乙醇，置于恒溫振蕩器（溫度（30±2） ℃、振速100 r/min、時(shí)間10 h），靜置20 min，取洗脫液，測(cè)定吸光度，計(jì)算各樹(shù)脂的解吸情況。計(jì)算公式如下：

式中：Q1為吸附量/（mg/g）；E1為吸附率/%；Q2為解吸量/g；E2為解吸率/%；m為樹(shù)脂濕質(zhì)量/g；C0為起始多酚質(zhì)量濃度/（mg/mL）；C1為達(dá)到吸附平衡時(shí)溶液中多酚質(zhì)量濃度/（mg/mL）；C2為解吸液中多酚質(zhì)量濃度/（mg/mL）；V1為吸附液體積/mL；V2為解吸液體積/mL。

1.3.5 乙醇洗脫體積分?jǐn)?shù)的篩選

選取20%、30%、40%、50%、60%、70%、80% 7 個(gè)乙醇梯度，按上步的解吸實(shí)驗(yàn)操作，確定洗脫液的最佳體積分?jǐn)?shù)。

1.3.6 甲酸體積分?jǐn)?shù)對(duì)解吸的影響

為了進(jìn)一步增強(qiáng)洗脫劑對(duì)固相介質(zhì)的解吸效果，故探究不同體積分?jǐn)?shù)甲酸對(duì)洗脫效果的影響。在已選定洗脫劑的條件下，分別選取含有0.5%、1.0%、1.5%、 2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%、5.0%甲酸的洗脫劑，進(jìn)行靜態(tài)解吸實(shí)驗(yàn)，然后測(cè)定吸光度，計(jì)算各樹(shù)脂的解吸情況。

1.3.7 單因素試驗(yàn)

二維多通道色譜分離松多酚的條件由上述單因素試驗(yàn)直接確定，實(shí)驗(yàn)順序?yàn)樯蠘恿俊⑸蠘淤|(zhì)量濃度、洗脫速率和色譜柱數(shù)量，并且按照實(shí)驗(yàn)順序確定的單因素條件作為下個(gè)因素的固定條件。

上樣量：選取6 個(gè)水平，分別為80 mL×1.6 mg/mL、120 mL×1.6 mg/mL、160 mL×1.6 mg/mL、200 mL×1.6 mg/mL、240 mL×1.6 mg/mL、280 mL×1.6 mg/mL。

上樣質(zhì)量濃度：在上樣量確定的情況下，選取的上樣質(zhì)量濃度分別為1.2、1.6、2.0、2.4、2.8、3.2 mg/mL。

洗脫速率：在上兩個(gè)因素確定的條件下，選?。?00±20）、（200±20）、（300±20）、（400±200、（500±20）、（600±20）mL/min 6 個(gè)不同洗脫流速。

色譜柱數(shù)量：在上述條件確定的條件下，選取1 根柱聯(lián)用、2 根柱聯(lián)用、3 根柱聯(lián)用、4 根柱聯(lián)用、5 根柱聯(lián)用5種不同柱數(shù)量的聯(lián)用洗脫情況。

1.3.8 純度計(jì)算

根據(jù)福林-酚試劑法測(cè)定所收集樣品的多酚含量，并取一定體積的樣品，置于平皿，放入烘箱烘干至質(zhì)量恒定，稱量干質(zhì)量。公式如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 總多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以溶液在760 nm波長(zhǎng)處的吸光度為縱坐標(biāo)、沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，建立總多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=0.019 9x-0.007 5，R2=0.999 7。根據(jù)回歸方程，得松多酚提取物中多酚含量為8.259 8 mg/g。

2.2 大孔樹(shù)脂的篩選

由于大孔樹(shù)脂的極性、孔徑、比表面積、平均孔徑等理化性質(zhì)的不同，其分離目標(biāo)物質(zhì)的效果也不同[9]。大孔樹(shù)脂分離天然活性成分利用的是其吸附的可逆性，在生產(chǎn)制備上，大孔樹(shù)脂的選取不僅要求吸附量大，而且解吸效果也要較好[22]。因此，吸附性能和解吸性能是大孔樹(shù)脂作為固相介質(zhì)篩選的重要依據(jù)。表2顯示，從吸附性看，不同型號(hào)的樹(shù)脂對(duì)松多酚的吸附程度不同，與樹(shù)脂的極性呈正相關(guān)，其中吸附量和吸附率較高的是極性樹(shù)脂S-8、NAK-2、NAK-9和中等極性的ADS-17，而弱極性和非極性的較低；S-8的吸附性最好，吸附量和吸附率分別達(dá)到了75.19 mg/g和86.43%。產(chǎn)生這種情況的原因可能和多酚類物質(zhì)屬于中等極性化合物有一定的關(guān)系，同時(shí)又有一定的疏水性，因此根據(jù)相似相容原理，極性和中等極性的大孔樹(shù)脂更易與多酚類物質(zhì)吸附。從解吸性看，解吸效果較好的是X-5和D101，均達(dá)到了50%以上。綜合吸附和解吸兩個(gè)參數(shù)，S-8的吸附性能最佳，吸附量達(dá)到75.19 mg/g，而解吸量?jī)H僅只有17.05 mg/g；而X-5吸附性能不佳，吸附率僅僅達(dá)到44.53%，但解吸較好，解吸率達(dá)到63.73%，解吸量為24.69 mg/g。因此，確定X-5大孔樹(shù)脂作為二維多通道色譜法分離松多酚的固相介質(zhì)。這一結(jié)果，與其他學(xué)者分離純化多酚類活性成分所篩選樹(shù)脂的極性基本一致，都為弱極性吸附樹(shù)脂[22-24]。

表2 6 種大孔樹(shù)脂對(duì)松多酚的吸附與解吸Fig.2 Adsorption and desorption capacities of 6 kinds of macroporous resins

2.3 X-5大孔樹(shù)脂吸附性的考察

2.3.1 X-5大孔樹(shù)脂對(duì)松多酚的動(dòng)力吸附

圖3 X-5樹(shù)脂對(duì)松多酚的動(dòng)力吸附曲線Fig.3 Dynamic adsorption curves of pine polyphenols on X-5 resin

大孔樹(shù)脂吸附目標(biāo)物質(zhì)是一個(gè)由快速吸附到最終吸附飽和的動(dòng)態(tài)過(guò)程，由于每種樹(shù)脂的理化性質(zhì)的不同和吸附物性質(zhì)的差異，故大孔樹(shù)脂吸附的動(dòng)態(tài)過(guò)程差異較大，有的幾十分鐘即可達(dá)到平衡，但有些需要幾個(gè)小時(shí)。由圖3可以看出：在開(kāi)始的一段時(shí)間內(nèi)，X-5大孔樹(shù)脂對(duì)松多酚吸附量在逐漸增大。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，吸附逐漸達(dá)到飽和。當(dāng)吸附2 h左右時(shí)，X-5樹(shù)脂對(duì)松多酚的吸附達(dá)到平衡，吸附量不再增加，趨于穩(wěn)定，其吸附量為39 mg左右。因此該吸附平衡時(shí)間作為了二維多通道色譜分離設(shè)備分離松多酚吸附域的吸附時(shí)間的參考標(biāo)準(zhǔn)，為了保證吸附完全，選取3 h作為吸附域最終的吸附時(shí)間。

2.3.2 X-5樹(shù)脂對(duì)松多酚的等溫吸附

在等溫吸附實(shí)驗(yàn)中，通常采用朗繆爾和費(fèi)倫德利希吸附模型 描述大孔樹(shù)脂與吸附物之間的相互作用，揭示其吸附過(guò)程[12-13,25]。朗繆爾吸附模型公式[25]如式（7）所示：

式中：Qe為樹(shù)脂吸附能力；Ce為松多酚平衡濃度；Qm為經(jīng)驗(yàn)常數(shù)；K為朗繆爾常數(shù)。

費(fèi)倫德利希吸附模型[25]公式如式（8）所示：

式中：Qe為樹(shù)脂吸附能力；Ce為松多酚平衡濃度；k為費(fèi)倫德利希常數(shù)；1/n為經(jīng)驗(yàn)常數(shù)。

X-5吸附松多酚的等溫吸附曲線如圖4所示，同時(shí)根據(jù)上述公式得兩吸附模型參數(shù)如表3、4所示，綜合比較兩吸附模型的相關(guān)系數(shù)，X-5大孔樹(shù)脂對(duì)松多酚的吸附過(guò)程更趨于朗繆爾單分子吸附模型，在不同溫度下其吸附模型的線性擬合R2＞0.99。在費(fèi)倫德利希模型，1/n的值是判斷其吸附模型是否易于發(fā)生的依據(jù)[25]；在0～0.5之間說(shuō)明費(fèi)倫德利希模型易于發(fā)生，反之大于0.5，則不易發(fā)生。在表4中1/n的值均大于0.5，故X-5大孔樹(shù)脂對(duì)松多酚的吸附過(guò)程不符合費(fèi)倫德利希模型。

圖4 X-5樹(shù)脂對(duì)松多酚的等溫吸附曲線Fig.4 Absorption isotherms of pine polyphenol on X-5 resin

同時(shí)如圖4可知，在25、35 ℃和45 ℃三個(gè)梯度溫度，X-5大孔樹(shù)脂對(duì)松多酚的吸附能力隨著溫度的升高而降低，25 ℃時(shí)X-5樹(shù)脂對(duì)松多酚的吸附最佳。同時(shí)，在這3 個(gè)溫度梯度下，X-5大孔樹(shù)脂對(duì)松多酚的吸附，隨著松多酚質(zhì)量濃度的增加而不斷的增強(qiáng)，當(dāng)松多酚質(zhì)量濃度達(dá)到2.0 mg/mL左右時(shí)，其吸附達(dá)到飽和。隨后繼續(xù)增加質(zhì)量濃度，X-5大孔樹(shù)脂對(duì)松多酚的吸附量不再增加，甚至略有下降。這可能是因?yàn)閯傞_(kāi)始松多酚濃度的提高，使目標(biāo)吸附物質(zhì)的量也隨之提高，增加了松多酚與大孔樹(shù)脂的相互作用；當(dāng)達(dá)到吸附平衡時(shí)，繼續(xù)增加松多酚的質(zhì)量濃度，樹(shù)脂表面接觸的松多酚分子過(guò)多，延緩了多酚分子進(jìn)入大孔樹(shù)脂的內(nèi)部空間結(jié)構(gòu)，同時(shí)質(zhì)量濃度的增加也增大了競(jìng)爭(zhēng)多酚吸附雜質(zhì)的量，從而松多酚的吸附量略有下降。這與其他學(xué)者研究多酚質(zhì)量濃度對(duì)吸附影響的結(jié)果是一致的[24,26-27]。X-5大孔樹(shù)脂對(duì)松多酚的吸附過(guò)程符合朗繆爾單分子層吸附模型，在25 ℃條件下（即室溫）對(duì)松多酚的吸附較佳，松多酚質(zhì)量濃度在2.0 mg/mL左右較佳。

表3 不同溫度條件下X-5大孔樹(shù)脂對(duì)松多酚的朗繆爾吸附模型參數(shù)Table3 Langmuir parameters of pine polyphenol on X-5 resin at different temperatures

表4 不同溫度條件下X-5大孔樹(shù)脂對(duì)松多酚的費(fèi)倫德利希吸附模型參數(shù)Table4 Freundlich parameters of pine polyphenol on X-5 resin at different temperatures

2.4 X-5大孔樹(shù)脂解吸性的考察

2.4.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)解吸的影響

通常洗脫劑的極性決定著大孔樹(shù)脂的解吸效果[9,28]，將吸附松多酚飽和的X-5大孔樹(shù)脂等分成份，分別用不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液作為解吸劑，測(cè)定解吸液中松多酚含量，計(jì)算解吸率，結(jié)果如圖5所示。60%乙醇的解吸最高，達(dá)到63.73%，且較快達(dá)到解吸平衡。因此，選擇60%的乙醇作為進(jìn)一步研究的洗脫劑。

圖5 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)解吸的影響Fig.5 Effect of ethanol concentration on desorption capacity

2.4.2 不同甲酸體積分?jǐn)?shù)洗脫液對(duì)解吸的影響

從一些研究中發(fā)現(xiàn)，大孔樹(shù)脂在弱酸性的條件下有利于多酚類活性成分的洗脫[29-30]。因此，利用不同體積分?jǐn)?shù)的甲酸對(duì)洗脫液進(jìn)行酸化，從而洗脫液酸化程度對(duì)X-5大孔樹(shù)脂的解吸影響，結(jié)果如圖6所示。不同酸化程度的洗脫液對(duì)X-5大孔樹(shù)脂的解吸有一定的作用；適當(dāng)?shù)募尤肷僭S的甲酸能夠提高洗脫劑的解吸能力，在甲酸的體積分?jǐn)?shù)達(dá)到0.5%時(shí)，洗脫劑的解吸能力最強(qiáng)，解吸率達(dá)到72.08%；隨后隨著甲酸濃度的增加，洗脫劑的解吸能力逐漸減弱。這可能是因?yàn)槎喾釉谥行詶l件下易離解，離解物與樹(shù)脂的結(jié)合力可能比非離解物大，經(jīng)弱酸化的洗脫液可以抑制多酚的離解，可能會(huì)改善洗脫效果；隨后酸化的程度不斷增加，有可能導(dǎo)致松多酚結(jié)構(gòu)的改變，與樹(shù)脂的結(jié)合力增加，從而降低了洗脫劑的解吸能力。

圖6 不同甲酸體積分?jǐn)?shù)洗脫液對(duì)解吸的影響Fig.6 Effect of formic acid concentration of the eluent on desorption capacity

2.5 二維多通道色譜分離設(shè)備線上條件優(yōu)化

2.5.1 上樣量對(duì)分離松多酚的影響

圖7 上樣量對(duì)二維多通道色譜分離設(shè)備分離松多酚的影響Fig.7 Effect of sample loading amount for pine polyphenol purity

從圖7可以看出，上樣量對(duì)二維多通道色譜分離設(shè)備分離松多酚的影響較大。從二維多通道色譜分離設(shè)備的單一域來(lái)看，在不同上樣量的條件下，吸附域分離純化松多酚較為穩(wěn)定，分離獲得的松多酚純度基本在4%～6%之間，沒(méi)有太大波動(dòng)，說(shuō)明上樣量對(duì)二維多通道色譜分離設(shè)備吸附域的分離影響較??；但對(duì)二維多通道色譜分離設(shè)備的分離域影響較大，各分離域分離獲得的松多酚純度高低不一，波動(dòng)較大。從分離效果的整體來(lái)看，二維多通道色譜分離設(shè)備分離效果明顯，在上樣量為160 mL×1.6 mg/mL時(shí)，分離域-1分離的松多酚效果最好，純度達(dá)19.907%。故選取160 mL×1.6 mg/mL的上樣量作為上樣條件。

2.5.2 上樣質(zhì)量濃度對(duì)分離松多酚的影響

從圖8可以看出，松多酚的上樣質(zhì)量濃度對(duì)二維多通道色譜分離設(shè)備分離松多酚產(chǎn)生了顯著的影響。同樣的，從單一域可以看出，吸附域的分離效果波動(dòng)較小，但分離純化的效果不佳；分離域的分離效果顯著，波動(dòng)大。隨著上樣濃度的改變，二維多通道色譜分離設(shè)備分離松多酚的效果峰值也發(fā)生了改變，由1.6 mg/mL的分離域-1轉(zhuǎn)變?yōu)榱?.0 mg/mL的分離域-2，其分離獲得的松多酚純度達(dá)到了23.257%。因此，二維多通道色譜分離設(shè)備分離松多酚的上樣質(zhì)量濃度選取2.0 mg/mL。

圖8 上樣質(zhì)量濃度對(duì)二維多通道色譜分離設(shè)備分離松多酚的影響Fig.8 Effect of sample concentration on pine polyphenol purity

2.5.3 洗脫速率對(duì)分離松多酚的影響

洗脫速率對(duì)二維多通道色譜分離設(shè)備分離松多酚的影響如圖9所示。可知，洗脫速率對(duì)分離松多酚的影響顯著。從整體分離效果看，在較低的洗脫速率的條件下，二維多通道色譜分離設(shè)備分離松多酚的效果比在較高洗脫速率條件下，分離效果好。二維多通道色譜分離設(shè)備的各個(gè)色譜域，在流速為（200±20）mL/min時(shí)，分離效果都達(dá)到峰值；其中分離效果最好的是分離域-2，分離獲得的松多酚純度達(dá)到23.257%。

圖9 洗脫流速對(duì)二維多通道色譜分離設(shè)備分離松多酚的影響Fig.9 Effect of eluent flow rate on pine polyphenol purity

2.5.4 色譜柱數(shù)量對(duì)分離松多酚的影響

圖10 色譜柱數(shù)量對(duì)二維多通道色譜分離設(shè)備分離松多酚的影響Fig.10 Effect of number of chromatographic columns used on pine polyphenol purity

從圖10可以看出，不同數(shù)量的色譜柱聯(lián) 用對(duì)二維多通道色譜分離設(shè)備分離松多酚有著顯著的作用。整體看，多柱聯(lián)用的二維多通道色譜分離設(shè)備的分離效果要優(yōu)于單柱聯(lián)用。二維多通道色譜分離設(shè)備分離松多酚并不是色譜柱聯(lián)用的數(shù)量越多越好，在4 根色譜柱聯(lián)用時(shí)，二維多通道色譜分離設(shè)備分離松多酚的效果即達(dá)峰值。與其他數(shù)量色譜柱聯(lián)用相比，4 柱聯(lián)用的效果，無(wú)論是整體分離效果還是單柱分離都優(yōu)于其他數(shù)量色譜柱聯(lián)用的效果。從而，確定二維多通道色譜分離設(shè)備分離松多酚的色譜柱聯(lián)用數(shù)量為4 根柱聯(lián)用。

按上述優(yōu)化的分離純化條件，使松多酚的純度由2.37%提高到了23.257%，純化倍數(shù)高達(dá)9.8。說(shuō)明分離條件優(yōu)化后的二維多通道色譜分離設(shè)備對(duì)松多酚有著很好的分離純化作用。

3 結(jié) 論

本研究通過(guò)靜態(tài)吸附解吸和單因素動(dòng)態(tài)試驗(yàn)，確定了二維多通道色譜法分離松多酚的最佳工藝，條件：X-5樹(shù)脂為固相介質(zhì)、0.5%甲酸-60%乙醇溶液為洗脫劑、上樣量256 mg、上樣質(zhì)量濃度2.0 mg/mL、洗脫速率（200±20）mL/min和色譜柱4柱聯(lián)用。在此條件下，松多酚純度高達(dá)23.257%，較原松多酚提取液（2.37%）提高了9.8 倍，同時(shí)產(chǎn)率達(dá)到46.81%。因此，二維多通道色譜分離設(shè)備對(duì)松多酚的分離純化具有較好的效果；同時(shí)，較其他松多酚分離純化技術(shù)，二維多通道色譜分離設(shè)備具有操作自動(dòng)化、洗脫液消耗少、生產(chǎn)周期短、處理量大等優(yōu)勢(shì)，對(duì)于松多酚工業(yè)化、大批量生產(chǎn)具有一定的參考價(jià)值和意義。

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Optimization of Two-Dimensional Multi-Channel Chromatographic Separation of Pine Polyphenols

ZENG Xiang-hong1, WANG Zhen-yu1,2,*, LI Hui1, ZUO Li-li1
(1. School of Food Science and Engineering, Institute of Extreme Environment, Harbin Institute of Technology, Harbin 150090, China; 2. School of Forestry, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China)

A two-dimensional multi-channel chromatographic separator designed by our research group was us ed to purify polyphenols extracted from the pinecones of Pinus koraiensis Sieb. et Zucc. from north-eastern China. The chromatographic conditions were optimized. The stationary and eluent were selected by static adsorption and desorption experiments. Onefactor-at-a-time design was used to investigate four factors influencing the separation efficiency of polyphenols by dynamic adsorption, sample loading amount, sample concentration, eluent flow rate, and number of chromatographic columns used. Results indicated that X-5 macroporous resin was the best stationary phase for polyphenol separation and the best elutent comprised a mixture of 0.5% formic acid and 60% ethanol in water, providing maximum adsorption quantity of 38.74 mg/g and maximum desorption rate of 72.08%. The optimal experimental conditions for chromatographic separation of polyphenols were 256 mg of sample at a concentratio n of 2.0 mg/mL, eluent flowing at a rate of (200±20) mL/min and using 4 chromatographic columns. Under these conditions, the purity of polyphenols was increased from 2.37% to 23.257%, and the recovery was 46.81%.

two-dimensional multi-channel chromatographic separator; pine polyphenols; separation and purification; macroporous resin

TS201.2

A

1002-6630（2014）10-0185-07

10.7506/spkx1002-6630-201410035

2013-03-11

曾祥宏（1989—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)樯锓蛛x工程及植物功能活性成分。E-mail：437027356@qq.com

*通信作者：王振宇（1957—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭秤弥矘O端環(huán)境營(yíng)養(yǎng)學(xué)、生物分離工程及功能性食品。

E-mail：wzy219001@hit.edu.cn