張藝蓓，岳田利,，喬海鷗，賈 如，蔣旭鵬，李 璐

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.陜西省疾病預(yù)防控制中心，陜西 西安 710054）

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測魚中孔雀石綠、結(jié)晶紫及其代謝物

張藝蓓1，岳田利1,*，喬海鷗2，賈 如1，蔣旭鵬1，李 璐1

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.陜西省疾病預(yù)防控制中心，陜西 西安 710054）

采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定魚中孔雀石綠（malachite green，MG）、隱性孔雀石綠（leuco malachite green，LMG）、結(jié)晶紫（crystal violet，CV）、隱性結(jié)晶紫（leuco crystal violet，LCV）4種物質(zhì)殘留。樣品加入內(nèi)標物D5-MG、D6-LMG、D5-CV、D6-LCV，經(jīng)乙腈提取、離心、過中性氧化鋁柱，氮氣吹至近干，50%乙腈溶液定容，上機測定。MG和LMG線性范圍為1～50 ng/mL，CV和LCV線性范圍為1～100 ng/mL。4種物質(zhì)的檢出限均為0.05 μg/kg，定量限均為0.15 μg/kg。在50、100、200 ng/mL 3個添加水平下，回收率在87.80%～110.82%之間，相對標準偏差均小于等于4.32%（n=6）。該方法靈敏、準確、可靠，可以同時測定魚中MG、LMG、CV、LCV殘留。

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；魚；孔雀石綠；結(jié)晶紫；殘留

孔雀石綠（malachite green，MG）和結(jié)晶紫（crystal violet，CV）屬于三苯甲烷類物質(zhì)，是紡織工藝中使用的染料，因其具有消毒性和殺菌性而曾用于水產(chǎn)養(yǎng)殖和運輸過程中，作為驅(qū)蟲劑和殺菌劑防治魚類水霉病、爛腮病及寄生蟲病，延長魚類的存活時間[1]。MG是一種帶有金屬光澤綠色的結(jié)晶體，化學(xué)名稱為四甲基代二氨基三苯甲烷，化學(xué)式為C23H25ClN2，易溶于水、甲醇、乙醇和戊醇，水溶液呈藍綠色。CV是一種帶有金屬光澤深綠色的固體，化學(xué)式為C25H30ClN3，與孔雀石綠的結(jié)構(gòu)相似。分子結(jié)構(gòu)見圖1。二者進入生物體內(nèi)，會產(chǎn)生毒性更大的隱性代謝產(chǎn)物，如隱性孔雀石綠（leuco malachite green，LMG）和隱性結(jié)晶紫（leuco crystal violet，LCV）[2]。這2種隱性代謝物具有較高的親脂性，在魚類脂肪組織中代謝速度極慢，會形成穩(wěn)定的殘留并有明顯的蓄積現(xiàn)象。20世紀90年代研究陸續(xù)發(fā)現(xiàn)MG、LMG、CV、LCV的三苯甲烷官能團具有致癌性，具有高毒、高殘留的特性，可通過食物鏈對哺乳動物和人類產(chǎn)生“三致”作用，對生物體組織、生殖、免疫系統(tǒng)均有影響[3]。因此許多國家將其列為漁用禁用藥物，美國、加拿大、日本、歐盟禁止MG和CV在水產(chǎn)品養(yǎng)殖和運輸過程中使用[4]。2002年我國NY 5071—2002《無公害食品：漁用藥物使用準則》[5]中將MG列為禁用漁用藥物；2002年5月農(nóng)業(yè)部將MG和CV列入《食品動物禁用的獸藥及其化合物清單》[6]。但由于MG和CV抗菌效果好且價格低廉，尚未有更理想的替代品，仍出現(xiàn)在魚卵孵化過程和運輸過程中使用該類化合物的現(xiàn)象[7]。因此，對MG和CV的檢測和監(jiān)控顯得尤為重要。對MG和CV的檢測有許多不同的方法，如高效液相色譜法、液相色譜-線性離子阱質(zhì)譜法、共振瑞利散射法、同位素內(nèi)標測定法和薄層色譜法等[8-15]。但這些方法的靈敏度、選擇性和分析通量還存在不足之處，高效液相色譜法對樣品的凈化要求高，操作步驟繁瑣、耗時長，不利于準確定性和定量；國外主要采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定LMG，高效液相色譜法、高效液相色譜-質(zhì)譜法同時測定MG和LMG[8,16]。但是所有利用液相色譜測定LMG的方法都需要在色譜柱后串接PbO2衍生柱，將LMG轉(zhuǎn)化為MG，操作步驟繁瑣，而且PbO2衍生柱的質(zhì)量和壽命影響結(jié)果的穩(wěn)定性及檢測結(jié)果。超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLCMS-MS）是近年來發(fā)展起來的一種新的檢測技術(shù)，使用三重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜或離子阱作為檢測器，代替高效液相色譜儀中的紫外檢測器，能同時發(fā)揮液相色譜的較快分析速度、高分離度與串聯(lián)質(zhì)譜的高選擇性、高靈敏度的優(yōu)勢，采用多反應(yīng)監(jiān)測掃描方式提供特征母離子及子離子信息，能較好地進行目標化合物的定性和定量。目前，UPLC-MS-MS方法同時測定MG、LMG、CV、LCV殘留在國內(nèi)外的報道均較少，本研究采用該法，對陜西省16種水產(chǎn)品中MG、LMG、CV、LCV進行殘留測定，減少了樣品分析操作步驟，提高了方法的靈敏度和準確度，符合殘留分析的要求，為進出口水產(chǎn)品中孔雀石綠類藥物殘留監(jiān)測提供了有效的技術(shù)支持。

圖1 MG、LMG、CV、LCV的分子結(jié)構(gòu)Fig.1 Molecular structures of MG, LMG, CV and LCV

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

標準品MG、LMG、CV、LCV、D5-MG、D6-LMG、D5-CV、D6-LCV（純度99%） 美國Sigma-Aldrich公司；甲酸、乙腈、乙酸銨（色譜純） 德國Merck公司；中性氧化鋁萃取小柱（1g/6mL） 美國Supelco公司；Millipore A10純水系統(tǒng) 美國Millipore公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UltiMateTM3000超高效液相色譜儀 美國Dionex公司；API-3200三重四極桿質(zhì)譜儀 美國Applied Biosystems公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Acclaim RSLC C8快速分離色譜柱（2.1 mm×100 mm，2.2 μm）；流動相A為乙腈，B為含0.1%甲酸的5 mmol/L乙酸銨溶液；流速0.3 mL/min；柱溫35 ℃；進樣體積10 μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（正離子模式）；多反應(yīng)監(jiān)測模式；電噴霧電壓5 500 V；氣簾氣壓力20 psi；霧化氣壓力40 psi；輔助氣壓力40 psi；離子源溫度450 ℃；其他參數(shù)見表1。

表1 4種待測物的最優(yōu)質(zhì)譜條件Table1 Optimized MRM conditions for four analytes

1.3.3 標準溶液的制備

標準儲備液（1 mg/mL）：精確稱取MG、LMG、CV、LCV標準品10 mg分別置于4 個10 mL棕色容量瓶中，用乙腈定容至刻度，-18 ℃保存；混合標準工作液（100 ng/mL）：分別準確移取1 mg/mL的MG、LMG、CV、LCV標準儲備液0.1 mL，用乙腈稀釋成1 μg/mL的混合標準中間液，再取混合標準中間液用乙腈稀釋成100 ng/mL的混合標準工作液，4 ℃保存；內(nèi)標儲備液（1 mg/mL）：分別精確稱取孔雀石綠、隱性孔雀石綠同位素內(nèi)標標準品D5-MG、D6-LMG、D5-CV、D6-LCV 10 mg（精確到0.01 mg）于4 個10 mL棕色容量瓶中，分別用乙腈定容至刻度，-18 ℃保存；混合內(nèi)標工作液（1 ng/mL）：分別準確移取1 mg/mL的4 種內(nèi)標儲備溶液0.1 mL，用乙腈稀釋成l00 ng/mL的混合內(nèi)標中間液，再取混合內(nèi)標中間液用乙腈稀釋成1 ng/mL的混合內(nèi)標工作液，4 ℃保存；標準系列溶液：分別取100 ng/mL的混合標準工作液0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mL于10 mL容量瓶中，用50%乙腈溶液定容至刻度，得到質(zhì)量濃度依次為1、5、10、20、50、100 ng/mL的標準系列溶液。

1.3.4 樣品處理

1.3.4.1 樣品的制備

從市場上采集16 個品種共計120 條魚，經(jīng)剖殺去除頭、骨、內(nèi)臟，取可食部分切成塊狀，用電動絞肉機打成漿狀，于-18 ℃保存，待測。

1.3.4.2 提取和凈化

將魚樣解凍，準確稱取5 g（精確到0.1 g）樣品于50 mL塑料離心管中，添加50 μL混合同位素內(nèi)標中間液，加入提取液乙腈25 mL，渦旋混合2 min，10 000 r/min離心10 min，收集上清液于100 mL玻璃離心管中，待凈化。

用5 mL乙腈活化中性氧化鋁萃取小柱，在氮吹儀上用氮氣吹干；取5 mL上清液，加載在中性氧化鋁小柱上，收集濾液，再用4 mL乙腈淋洗小柱，再收集濾液，將2 次濾液合并；在氮吹儀上50 ℃用氮氣吹至近干，用50%乙腈溶液溶解殘渣，并定容至0.5 mL，0.22 μm膜過濾，待檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取與凈化

由于MG和CV在水產(chǎn)品中主要以隱性代謝物LMG和LCV形式存在，具有很好的親脂性，而且水產(chǎn)品基質(zhì)化學(xué)成分復(fù)雜，脂肪含量較高，不利于目標分析物的提取和凈化。各種氧化鋁小柱（酸性氧化鋁、中性氧化鋁、堿性氧化鋁）可以去除樣品中的脂肪[17-18]，但也可吸附目標化合物。用乙腈活化過的酸性氧化鋁和中性氧化鋁對LMG、LCV的吸附很弱，而堿性氧化鋁對LMG、LCV的吸附較強。因此，本研究在樣品的前處理過程中，利用中性氧化鋁固相萃取凈化，去除酸性雜質(zhì)，消除了油脂和基體的影響，保護了色譜柱和質(zhì)譜儀，提高了方法的靈敏度。

檢測水產(chǎn)品中殘留的MG、CV及其隱性代謝物時常使用的提取溶劑包括乙酸銨緩沖溶液、乙腈、甲醇、二氯甲烷等。由于LCV在乙腈中的溶解度要高于甲醇，本研究選擇乙腈做為提取劑，提高了目標物的提取效率，并減少溶液的多次轉(zhuǎn)移造成的損失。同時，在樣品提取和凈化過程中，微量的LMG、LCV被氧化為MG、CV，文獻[19]報道加入還原能力更強的物質(zhì)能有效防止這種情況的發(fā)生，而本實驗則采用加入穩(wěn)定性同位素內(nèi)標物質(zhì)來提高測定的準確性。

2.2 質(zhì)譜和色譜條件的優(yōu)化

本研究采取UPLC-MS-MS法進行分析，同時根據(jù)現(xiàn)有儀器、試劑和實際操作等情況，參照GB/T 19857—2005《水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測定》[20]、SC/T 3021—2004《水產(chǎn)品中孔雀石綠殘留量的測定：液相色譜法》[21]，優(yōu)化檢測方法。

圖2 標準液相色譜圖譜Fig.2 UPLC profiles of standards

對MG、LMG、CV、LCV、D5-MG、D6-LMG、D5-CV、D6-LCV掃描母離子，得到其準分子離子峰，再以適當?shù)呐鲎材芰繏呙璺肿与x子，響應(yīng)值最強的子離子為定量離子，響應(yīng)值相對較強的離子為定性離子。這2個信號較強的子離子，以母離子和子離子組成監(jiān)測離子對；采用多反應(yīng)監(jiān)測模式對母離子和子離子進行碎裂電壓及碰撞能量的優(yōu)化（表1），滿足歐盟規(guī)定對于禁用藥物的質(zhì)譜確證方法的要求[22]，使得樣品定量離子與定性離子的離子強度比在其相應(yīng)的標準系列離子強度比的80%～120%范圍內(nèi)，可作為準確定性的依據(jù)。

MG、LMG屬于三苯基甲烷類化合物，具有弱堿性，因此可以通過調(diào)節(jié)流動相的pH值來抑制弱堿的解離，同時加入甲酸和低濃度的揮發(fā)性緩沖鹽可以在離子化過程中得到豐富的離子碎片信息，并改善峰形。本實驗中，流動相中加入5 mmol/L乙酸銨，用乙酸調(diào)節(jié)pH 4.5，獲得良好的峰形，提高了靈敏度（圖2）。MG、LMG、CV、LCV、D5-MG、D6-LMG、D5-CV、D6-LCV保留時間分別為1.62、6.03、2.72、5.66、1.59、5.96、1.59、5.96 min。

為了能同時檢測顯色母體和隱性代謝物，通常在液相色譜分離后，利用一個在線柱后PbO2衍生柱，將隱性代謝物LMG、LCV轉(zhuǎn)化為在可見光波長處有強吸收的顯色母體（MG和CV）。但是衍生柱填料的配比容易受到流動相和樣品基質(zhì)的影響，衍生柱的壽命也會影響檢測效果，使得結(jié)果不準確。本研究未使用PbO2衍生柱，避免了衍生柱質(zhì)量不穩(wěn)定對檢測結(jié)果造成的影響。

2.3 標準曲線及檢出限

本研究采用內(nèi)標法進行定量，在空白魚肉樣品中添加4種抗生素的標準溶液，由標準儲備液配制質(zhì)量濃度為1、5、10、20、50、100 ng/mL的混標溶液，分別取10 μL測定，以分析物質(zhì)量濃度與內(nèi)標物質(zhì)量濃度的比值為橫坐標、 以分析物峰面積與內(nèi)標物峰面積的比值為縱坐標，繪制標準曲線。

Bergwerff等[23]利用LC-MS-MS方法對鯰魚、鰻鱺、虹鱒、鮭魚、熱帶蝦、大比目魚肌肉組織中的MG和LMG進行了測定，檢出限均達到0.2 μg/kg。Turnipseed等[24]采用非放電氣壓化學(xué)離子化的離子阱質(zhì)譜法對鮭魚肌肉組織中的MG進行了測定，先將LMG氧化成MG，然后進行檢測，檢測限達到0.2 μg/kg，可食用金魚組織中的MG和LMG的檢測限分別達到0.13 μg/kg和0.06 μg/kg。本研究4 種物質(zhì)的檢出限為0.05 μg/kg，定量限為0.15 μg/kg，優(yōu)于歐盟2004年提出的檢測限要求（2 μg/kg）[25]，同時達到目前水產(chǎn)品中MG和LMG檢出限的最低水平。

MG、LMG在質(zhì)量濃度為1～50 ng/mL的范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，CV、LCV在質(zhì)量濃度為1～100 ng/mL的范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性范圍寬，靈敏度高（表2）。

表2 回歸方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限、定量限Table2 Linear regression equations with correlation coefficients, LODs, and LOQs of veterinary drugs

2.4 加標回收率和精密度

以陰性樣品進行加標回收實驗，使用3組陰性樣品為測試樣品，MG、LMG、CV、LCV的3個添加水平為50、100、200 ng/mL，每個添加量在相同的實驗條件下做6個平行樣，對照標準工作曲線計算每個樣品的質(zhì)量濃度，計算加標回收率、相對標準差，平均加標回收率為87.80%～110.82%，相對標準偏差均小于等于4.32%，達到較好的準確度及精密度（表3）。

Bergwerff等[23]的研究中，幾種魚類組織中MG和LMG的平均回收率分別為43.8%～67.6%和86%～105%。Turnipseed等[24]的研究中，鮭魚組織中MG的平均回收率為86%～109%，可食用金魚組織中的MG和LMG的平均回收率分別是71%和89%以上。同時，Bergwerff等[23]認為，檢測時應(yīng)盡量避免樣品的反復(fù)凍融，否則會影響物質(zhì)的回收率；此外儲存溫度對2種物質(zhì)的穩(wěn)定性影響較大，當貯藏溫度為4℃、貯藏4 d時，對其測定影響很大，檢測值只有未貯藏時的60%左右。因此，本研究在儲存樣品時采用分瓶存放的形式，避免了反復(fù)凍融；在貯藏溫度為-18℃、貯藏時間不超過3 d時及時進行測定。

表3 回收率和精密度實驗（n=6）Table3 Recoveries of spiked samples and RSDs (n=6)

2.5 實際樣品的測定

圖3 魚樣品液相色譜圖譜Fig.3 UPLC profiles of samples

應(yīng)用此方法檢測市售的120份魚樣品，其中MG陽性樣品2份，質(zhì)量濃度為2.2 μg/kg；LMG陽性樣品8份，質(zhì)量濃度為8.6 μg/kg；CV陽性樣品12份，質(zhì)量濃度為5.24 μg/kg；LCV未檢出陽性樣品。結(jié)果表明，市售的魚樣品中仍然存在濫用MG和CV的情況（圖3）。

3 結(jié) 論

本研究建立了UPLC-MS-MS同時測定批量魚樣品中MG、LMG、CV、LCV殘留量的方法。樣品中MG、LMG、CV、LCV直接用乙腈提取，簡化了樣品前處理步驟，并加入穩(wěn)定同位素內(nèi)標進行校正，降低基質(zhì)抑制效應(yīng)。在3個添加水平下的回收率、精密度良好，檢出限低。同時發(fā)揮液相色譜的較高的分析速度、高分離度與串聯(lián)質(zhì)譜的高選擇性、高靈敏度的優(yōu)勢，采用多反應(yīng)監(jiān)測掃描方式提供特征的母離子及子離子信息，較好地進行目標化合物的定性、定量，達到高效、快速、操作簡單、重復(fù)性好、結(jié)果準確的效果，滿足水產(chǎn)品進出口檢測的要求。

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Determination of Malachite Green, Crystal Violet and Their Metabolites in Fishes by Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

ZHANG Yi-bei1, YUE Tian-li1,*, QIAO Hai-ou2, JIA Ru1, JIANG Xu-peng1, LI Lu1
(1. College of Food Science and Engineering, Northwest A & F University, Yangling 712100, China; 2. Shaanxi Provincial Center for Disease Control and Prevention, Xi’an 710054, China)

Purpose: Malachite green (MG), leuco malachite green (LMG), crystal violet (CV) and leuco crystal violet (LCV) residues in fish were determined simultaneously using ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS-MS). Methods: Fish samples after addition of internal standards D5-MG, D6-LMG, D5-CV, and D6-LCV were extracted with acetonitrile and centrifuged, and then the supernatants were applied on a neutral alumina column, blown almost dry under a stream of nitrogen and re-dissolved in 50% aqueous acetonitrile (by volume) before being subjected to UPLC-MS-MS analysis. Results: A linear relationship was observed over a concentration range of 1–50 ng/mL for MG and LMG, and over a concentration range of 1–100 ng/mL for CV and LCV. The limits of detection (LOD) for MG, LMG, CV and LCV were 0.05 μg/kg and the limits of quantification (LOQ) for all of them were 0.15 μg/kg. Average recoveries from blank samples spiked at levels of 50, 100 and 200 ng/mL ranged from 87.80% to 110.82%, with relative standard deviation smaller than or equal to 4.32% (n = 6). Conclusions: This method proved sensitive, accurate and reliable.

ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS-MS); fish; malachite green (MG); crystal violet (CV); residues

TS207.3

A

1002-6630（2014）10-0179-06

10.7506/spkx1002-6630-201410034

2013-09-24

2013年度西北農(nóng)林科技大學(xué)“大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃”校級重點項目（1201310712174）

張藝蓓（1993—），女，本科生，研究方向為食品安全。E-mail：zhangyibei0666@163.com

*通信作者：岳田利（1965—），男，教授，博士，研究方向為食品與發(fā)酵工程及食品安全控制技術(shù)。E-mail：yuetl@nwsuaf.edu.cn