馬雪濤，牛之瑞，馮 雷，譚健林

（云南省產品質量監(jiān)督檢驗研究院，云南 昆明 650223）

離子交換固相萃取結合超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定豆制品中烏洛托品殘留量

馬雪濤，牛之瑞，馮 雷，譚健林

（云南省產品質量監(jiān)督檢驗研究院，云南 昆明 650223）

建立了離子交換固相萃取結合超高 效液相色譜-串聯(lián)質譜測定豆制品中烏洛托品殘留量的分析方法。通過0.4%高氯酸提取，固相萃取凈化，超高效液相色譜-串聯(lián)質譜在正離子模式下，通過多反應監(jiān)測方式進行檢測。比較了Strata-SCX、SepPak C18和Cleanert PCX三種不同的固相萃取小柱對豆制品中烏洛托品殘留量的凈化和富集，其中Cleanert PCX凈化效果最好。在添加水平為5.0 μg/kg和50.0 μg/kg時，3種豆制品中烏洛托品的回收率范圍在76.0%～83.6%，相對標準偏差低于6%。方法具有快速、靈敏、準確、重復性較好的特點，適合于日常大批量樣品的測定。

烏洛托品；超高效液相色譜-串聯(lián)質譜；豆制品

烏洛托品即六亞甲基四胺是一種化工產品，可用作酚醛塑料的固化劑、氨基塑料的催化劑等用途[1-3]。由于烏洛托品在酸性溶液中能分解放出甲醛和氨而具有殺菌作用，常用于醫(yī)學上消毒防腐藥物。近些年來有些不法豆制品生產廠家為了延長其產品的保質期和保持產品的色澤違規(guī)使用烏洛托品作為防腐保鮮劑，對豆制品質量安全和消費者身體健康帶來安全隱患[4]。因此，對豆制品中烏洛托品含量檢測與控制顯得尤為必要。

烏洛托品的分析方法主要有分光光度法[5]、離子電極法[6]、氣相色譜法[7-8]、液相色譜法[9]等，實際應用中以氣相色譜法和液相色譜法居多，這兩種方法都存在靈敏度不高，且溶液出現(xiàn)假陽性結果的弊端[10-12]。液相色譜與串聯(lián)質譜的聯(lián)用，使得檢測結果的靈敏度顯著提高，同時對陽性樣品進行確認。

本實驗研究固相萃取對烏洛托品的凈化和富集，建立離子交換固相萃取結合液相色譜-串聯(lián)質譜（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometer，UPLC-MS-MS）對豆制品中烏洛托品殘留量的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豆腐皮樣品購于昆明市場；烏洛托品標準品（純度99.2%） 德國Dr. Ehrenstorfer GmnH公司；乙腈、甲醇、乙酸、乙酸銨（均為色譜純） 美國Fisher公司；氨水（分析純） 重慶川東化工有限公司；高氯酸（分析純） 金鹿化工有限公司；Strata-SCX固相萃取小柱（3 mL/60 mg） 美國Phenomenex公司；SepPak C18固相萃取小柱（6 mL/500 mg） 美國Waters公司；Cleanert PCX固相萃取小柱 美國Agela Technologies公司。

1.2 儀器與設備

UFLC-20A高效液相色譜 日本Shimadzu公司；API3200三重四極桿串聯(lián)質譜聯(lián)用儀 美國Applied Biosystems公司，CAPCELL PAK（CR）色譜柱（100 mm×2.1 mm，5 ?m） 日本Shiseido公司；Shim-pack XR-ODS色譜柱 （75 mm×3.0 mm，2.2 ?m）日本Shimadzu公司；GL-12B高速離心機 上海安亭科學儀器廠；N-EVAP氮吹儀 美國Organomation公司；CPA225D電子天平 德國Sartorius公司；十二孔固相萃取裝置 美國Waters公司；Omni均質機 美國Pulsafeeder公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的配制

準確稱取10 mg烏洛托品標準品，用乙腈溶解并定容至100 mL，配制成100 mg/L的標準物質儲備溶液，避光保存于-20 ℃冰箱中。準確量取標準儲備溶液1.0 mL，V（體積分數(shù)0.1%乙酸）：V（乙腈）=8：2溶解并定容至100 mL，質量濃度相當于1.0 μg/mL，使用時，以V（體積分數(shù)0.1%乙酸）：V（乙腈）=8：2稀釋成2.0、5.0、10.0、50.0、100.0、500.0 μg/L供高效液相色譜-串聯(lián)質譜測定。

1.3.2 樣品的制備

取樣品中有代表性的約200 g，用組織搗碎機搗碎，準確稱取2 g試樣（精確到0.01 g）于10 mL比色管中，加入體積分數(shù)0.4%高氯酸溶液定容至10 mL，用均質器以10 000 r/min均質2 min，再以10 000 r/min離心5 min，取出上清液于50 mL離心管中，加入10 mL石油醚，用均質器以10 000 r/min均質2 min，再以10 000 r/min離心5 min，用滴管吸去有機相，留水相備用。

1.3.3 凈化

固相萃取柱使用前分別用3 mL甲醇和體積分數(shù)0.4%高氯酸溶液預處理，并保持柱體濕潤。準確吸取4.0 mL水相溶液過固相萃取柱，依次用3.0 mL體積分數(shù)0.1%乙酸，1.0 mL甲醇淋洗固相萃取柱，棄去流出液，在2 kPa以下減壓抽3 min使柱體干涸；用6.0 mL V（氨水）：V（甲醇）=5：95洗脫，洗脫液在40 ℃下用氮吹儀濃縮至近干，用1.0 mL V（體積分數(shù)0.1%乙酸）：V（乙腈）=8：2溶解殘渣，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，供LC-MSMS測定。

1.3.4 色譜-質譜條件

色譜條件：流動相A相為10 mmol/L乙酸銨溶液（用乙酸調pH值到4.5），流動相B為乙腈，流動相梯度見表1。流速：0.4 mL/min；進樣量5 μL；柱溫：40 ℃。

表1 流動相的梯度洗脫程序Table1 Mobile phase composition for gradient elution

質譜條件：掃描方式：電噴霧正離子模式（electrospray ionization mass，ESI+）；檢測方式：多反應監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）；噴霧電壓：5 500 eV；氣簾氣：68.9 kPa；碰撞氣：68.9 kPa；去溶劑溫度：450 ℃；霧化氣：413.5 kPa；輔助氣：344.6 kPa；其他參考條件參見表2。

表2 烏洛托品的質譜分析參數(shù)Table2 Mass spectral parameters for urotropine analysis in MRM mode

2 結果與分析

2.1 色譜分離條件的優(yōu)化

分別比較了CR和XR-ODS兩種不同類型的色譜柱，前者分離效果較好。烏洛托品屬于低分子質量高極性化合物，在反相材料C18的色譜柱上保留時間較短，無法和干擾物質完全分離，需要使用離子對試劑才能獲得較好的分離效果，而離子對試劑會對質譜產生損害，所以無法應用。在CR色譜柱上，由于其分子結構中含有氨基活性基團，保留時間相對較長，峰型較好，而且，可以通過調節(jié)流動相pH值調節(jié)烏洛托品在色譜柱上的保留時間。相對于標準SN/T 2226—2008《進出口動物源性食品中烏洛托品殘留量的檢測方法：液相色譜-質譜-質譜法》中推薦使用的HILIC色譜柱，實驗組對峰型也進行了比較，二者相差不多。因此，本實驗最終選擇使用CR色譜柱進行分離。

2.2 質譜條件的優(yōu)化

同時考察了不同溶劑對烏洛托品質譜響應的影響，包括V（水）：V（乙腈）=9：1、0.1%（體積分數(shù)）乙酸水溶液-乙腈、10 mmol/L乙酸銨溶液（pH 4.5）-乙腈等溶液對質譜響應的影響，結果證明采用10 mmol/L乙酸銨溶液（pH 4.5）-乙腈體系時烏洛托品的響應最強，同時考慮到烏洛托品在酸性溶液中較為穩(wěn)定，因此采用10 mmol/L乙酸銨溶液（pH 4.5）-乙腈體系作為流動相，以體積分數(shù)0.1%乙酸水溶液-乙腈水溶液作為樣品定容溶液。

采用10 μg/mL烏洛托品標準溶液以針泵直接進樣的方式，分別在正負離子模式下進行母離子掃描，以確定烏洛托品的準分子離子，烏洛托品在正離子模式下靈敏度比負離子模式下響應要高，且穩(wěn)定性好。然后再以準分子離子m/z 141.1作為母離子，對其子離子進行全掃描。對碰撞能量、去簇電壓等質譜條件優(yōu)化后得到子離子m/z 112.1和m/z 85.1，選取干擾小、豐度強的離子對141.1/85.1作為定量離子對，優(yōu)化后的質譜參數(shù)見表2。

2.3 固相萃取小柱的選擇

本實驗研究了SN/T 2226—2008中的樣品前處理方法[13]，發(fā)現(xiàn)該方法相對繁瑣，且在處理豆制品樣品時油脂較難去除干凈，所以選擇采用水相提取的辦法。分別選用乙腈、甲醇和體積分數(shù)0.4%高氯酸溶液進行提取效率實驗，結果表明三者提取效率均能滿足要求，其中用乙腈、甲醇提取樣品基質時，樣品中油脂較多，對接下來進行的凈化和儀器測定有一定的影響，體積分數(shù)0.4%高氯酸溶液提取時，溶出雜質少，對大分子基質具有一定的沉降作用，同時可以簡化操作步驟，最終采用體積分數(shù)0.4%高氯酸溶液作為提取溶劑。

表3 3種固相萃取小柱的回收率精密度實驗（n=5）Table3 Effect of solid-phase extraction cartridges on the recovery and precision (n=5)

質譜MRM模式下，樣品基質對測定的干擾較大，故在實驗設計時考慮采用SPE小柱對樣品進行凈化[14-18]。采用相同的提取方法，分別采取Strata-SCX、SepPak C18和Cleanert PCX固相萃取小柱對樣品進行凈化，通過對回收率及RSD的比較，選擇出最佳的處理方案。通過反復試驗，對確定凈化操作的淋洗和洗脫條件進行了優(yōu)化，確定步驟為用3.0 mL體積分數(shù)0.1%乙酸、1.0 mL甲醇淋洗，用6.0 mL V（氨水）：V（甲醇）=5：95洗脫，洗脫液在40 ℃下用氮吹儀濃縮至近干，用1.0 mL V（體積分數(shù)0.1%乙酸）：V（乙腈）=8：2溶解殘渣。這樣操作，一方面可以最大程度地降低基質干擾，另一方面保證了較好的回收率及重復性。通過比較，發(fā)現(xiàn)C18柱效果較差；在使用Strata-SCX和Cleanert PCX固相萃取小柱時，回收率都相對較高，3種固相萃取小柱的回收率結果見表3。這是由于烏洛托品在C18小柱硅膠基的硅烷化填料上保留時間很短，極易被洗脫，所以整個凈化過程也較難控制，烏洛托品的回收率較差。烏洛托品分子結構中帶有氨基，呈弱堿性，利用其在酸性條件下帶正電，具有陽離子交換特性，選擇帶有強陽離子交換反相吸附劑的固相萃取柱進行選擇性交換吸附，再通過氨化甲醇將其替換洗脫下來，能夠取得更好的富集濃縮效果。但相比較而言，Strata-SCX檢測時，其采用的填料過細，極易堵塞，不適合批量樣品檢測；而Cleanert PCX操作簡便，因此更加適用于豆制品中烏洛托品殘留量的檢測工作。

2.4 方法線性范圍和定量限

以空白豆腐皮作為基質空白，將烏洛托品配制成相應濃度的系列標準溶液添加到空白樣品當中，以烏洛托品的峰面積作為縱坐標，烏洛托品的質量濃度2.0、10.0、50.0、100.0、200.0、500.0 ?g/L作為橫坐標進行線性回得方程y=397x-976，結果表明烏洛托品在2.0～500.0 ?g/L時，相關系數(shù)為0.999，相關系數(shù)良好。根據(jù)3 倍信噪比確定該方法的檢出限為2 μg/kg，10倍信噪比確定該方法的定量限為5 ?g/kg。烏洛托品的50.0 μg/L基質標準溶液總離子流圖見圖1。

圖1 烏洛托品總離子流圖Fig.1 TIC chromatogram of urotropine standard solution at 50.0 μg/L

2.5 回收率、精密度實驗

分別進行5.0、50.0 μg/kg的回收率實驗，每份樣品重復測定3 次，結果見表4。從表4可知，其平均回收率分別為76.0%～83.6%，相對標準偏差均小于6%。

表4 回收率精密度實驗（n=6）Table4 Average recoveries and precision (RSD) of urotropine in real samples (n=6)

2.6 實際樣品的測定

通過對昆明市場上的30個樣品進行測定，并未發(fā)現(xiàn)陽性樣品，結果表明昆明市場上豆制品未發(fā)現(xiàn)非法添加烏洛托品的違法行為。

3 結 論

本方法采用Cleanert PCX固相萃取小柱對樣品進行處理，超高效液相色譜-串聯(lián)質聯(lián)用方法檢測豆制品中的烏洛托品。本方法具有分析速度快、操作簡單、高選擇性和高靈敏度的特點。

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Determination of Urotropine Residue in Processed Soybean Products by Ion Exchange Solid-Phase Extraction Coupled with Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

MA Xue-tao, NIU Zhi-rui, FENG Lei, TAN Jian-lin
(Yunnan Institute of Product Quality Supervision and Inspection, Kumming 650223, China)

An analytical method for the determination of urotropine residue in processed soybean products was developed using ion exchange solid-phase extraction coupled with ultra performance liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry (UPLC-MS-MS). Samples were extracted with 0.4% perchloric acid followed by clean-up using solid-phase extraction. The analysis was carried out under negative electrospray ionization mode using multiple reaction monitoring. Cleanert PCX cartridge showed better clean-up and enrichment than Strata-SCX and SepPak C18cartridges for urotropine residue. The average recoveries of urotropine in three kinds of processed soybean products at spiked levels of 5.0 and 50.0 μg/kg ranged from 76.0% to 83.6% with relative standard deviations (RSDs) smaller than 6%. This method is rapid, sensitive, accurate, repeatable and suitable for routine analysis of large-scale samples.

urotropine; ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS-MS); processed soybean products

O657.63；O657.7

A

1002-6630（2014）10-0166-04

10.7506/spkx1002-6630-201410031

2013-09-16

國家質檢總局科技計劃項目（2013QK078）

馬雪濤（1974—），女，高級工程師，碩士，研究方向為食品安全檢測。E-mail：mxt_1926@163.com