史艷宇，劉金華，王 瑩，邴 煒，華 蕾，劉曉暉，王 穎，周 亮，王 瀟

（1.吉林省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院，吉林 長春 130022；2.吉林出入境檢驗(yàn)檢疫局，吉林 長春 130062）

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)快速檢測畜肉食品中鴨源性成分

史艷宇1，劉金華2，王 瑩1，邴 煒1，華 蕾1，劉曉暉1，王 穎1，周 亮1，王 瀟1

（1.吉林省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院，吉林 長春 130022；2.吉林出入境檢驗(yàn)檢疫局，吉林 長春 130062）

目的：建立一種快速、特異、靈敏的鴨源性成分檢測方法。方法：以鴨細(xì)胞色素C氧化酶Ⅲ（COⅢ）基因序列為靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增，建立鴨源性成分檢測方法；以常見畜禽肉，包括羊肉、牛肉、雞肉、鵝肉、豬肉、兔肉、馬肉、鹿肉等參考動(dòng)物物種進(jìn)行特異性檢測；以50 mg/kg羊肉DNA作為稀釋液，對鴨肉DNA進(jìn)行梯度稀釋，檢測靈敏度。結(jié)果：該方法能夠有效的對鴨源性成分進(jìn)行快速檢測，具有較強(qiáng)的特異性，靈敏度較高（0.1 μg/kg），且羊肉成分的存在對鴨肉靈敏度檢測沒有影響，可以快速、準(zhǔn)確檢測畜肉食品中摻雜的鴨源性成分。

鴨源性成分；細(xì)胞色素C氧化酶Ⅲ基因；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；檢測

市售牛羊肉及肉制品中，很多都摻雜鴨肉以冒充牛羊肉進(jìn)行銷售；為彌補(bǔ)羊肉味不足，有些不法商家甚至摻入羊肉粉、羊肉精膏等添加劑來粉飾其摻假行為。為了確定畜肉食品的真實(shí)性，已經(jīng)有很多動(dòng)物源性成分鑒別的方法，包括物理、化學(xué)、免疫學(xué)和分子生物學(xué)等方法，其中尤以分子生物學(xué)方法中聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）最為快速且靈敏[1-16]，其中相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)也很多，涵蓋牛、羊、豬、狗、雞、馬、驢、鹿、兔、駱駝等動(dòng)物種類[17-22]，但尚無對鴨源性成分鑒別檢測的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，滿足不了檢測需求。

研究中建立的畜肉食品中鴨源性成分鑒別檢測方法，采用主要選擇鴨細(xì)胞色素C氧化酶Ⅲ（COⅢ）DNA作為研究對象，設(shè)計(jì)了PCR特異性引物，建立了PCR技術(shù)鑒別檢測鴨源性成分的方法，適用于不同類型的樣品檢測，操作簡便，準(zhǔn)確可靠，靈敏度高，實(shí)用性強(qiáng)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

家鴨（雁形目鴨亞科河鴨屬的綠頭鴨[23]）、羊肉、牛肉、雞肉、鵝肉、豬肉、兔肉、馬肉、鹿肉均購于長春市地方市場；冰凍羊肉卷、肉板、醬鴨脖、醬鴨腸等畜肉加工食品購于長春市超市。

AxyPrepTMDNA提取試劑盒 美國Axygen公司；Ex TaqDNA聚合酶、dNTP（各10 mmol/L）、10×緩沖液、6×Loading buffer、100 bp DNA Ladder Marker、PCR引物合成 寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Microfuge 22R高速冷凍離心機(jī) 美國Beckman公司；IKA M20食物研磨器 德國IKA公司；Biometra T gradient-96PCR擴(kuò)增儀 德國Biometra公司；BioSpecmini DNA/RNA/蛋白分析儀 日本島津公司；SAVANT PS500A電泳儀 美國Axygen公司；EDAS290凝膠成像系統(tǒng) 美國柯達(dá)公司；HH-S恒溫水浴鍋 上海博珍儀器設(shè)備制造廠。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

取500 mg固體樣品加入50 mL離心管，加入約2 倍體積的雙蒸水，充分混勻，12 000 r/min離心5 min并棄去上清液，重復(fù)1次，必要時(shí)用三氯甲烷清洗樣品1次。醬汁等懸乳濁或濁狀的液體食品樣品可以通過添加電解質(zhì)（無機(jī)酸、堿、鹽類）等物理方式破壞膠體穩(wěn)定性再分離、濃縮。取500 mg樣品加入2 mL離心管，12 000 r/min離心5 min并棄去上清液，再次加入500 mg樣品，12 000 r/min離心5 min并棄去上清液，必要時(shí)用三氯甲烷清洗樣品1 次。

1.3.2 DNA提取

按試劑盒說明書提取DNA，并用DNA分析儀檢測其純度及濃度。

十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyltrimethylammon iumbromide，CTAB）法提取DNA：取200 mg研磨成粉狀的樣品于1.5 mL離心管中，加入600 μL CTAB、15 μL蛋白酶K、65 ℃溫育30 min；加入500 μL酚-氯仿-異戊醇（25：24：1，V/V）混合液劇烈振蕩，12 000 r/min離心15 min；吸取上清液加入等體積異丙醇，劇烈振蕩后12 000 r/min離心10 min，棄上清液；用70%乙醇洗滌2～3次，棄上清液；用200 μL TE緩沖液溶解；加等體積氯仿-異戊醇（24：1，V/V）重復(fù)上述步驟純化DNA。用DNA分析儀檢測其純度及濃度。

1.3.3 引物設(shè)計(jì)

在GenBank中檢索到的1個(gè)潛鴨族基因全序列（accession AF090337）、其綠頭鴨的mtDNA部分序列（accession L22476、L16770、L22477）及家鴨線粒體COⅢ基因序列（accession DQ655706）。用Lasergene軟件中的MegAlign對基因序列進(jìn)行序列同源性比較分析，根據(jù)基因序列中同源性較高部分用Primer Express 3.0設(shè)計(jì)引物。在GeneBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/ BLAST）中，經(jīng)BLAST軟件對相似序列搜索后，篩選出一套最優(yōu)且與常見畜禽肉無交叉反應(yīng)的引物。正向引物：5’-CATCTATCCTGCTAGCCGCC-3’，反向引物：5’-GGCTTGAGTGGAAGAATGCC-3’，擴(kuò)增片段201 bp。

1.3.4 反應(yīng)體系和反應(yīng)條件

反應(yīng)體系（共25 ?L）：10×Ex Taq Buffer（Mg2+plus）2.5 ?L，dNTP s Mixture（各10 mmol/L）0.5 ?L，上下游引物（10 ?mol/L）各1 ?L，Ex Taq（5 U/?L）0.2 ?L，模板DNA 2 ?L，補(bǔ)水至25 ?L。

反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。

1.3.5 特異性實(shí)驗(yàn)

分別用羊肉、牛肉、雞肉、鵝肉、豬肉、兔肉、馬肉、鹿肉等對引物進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn)。

1.3.6 靈敏度實(shí)驗(yàn)

用羊肉DNA（50 mg/kg）溶液對鴨肉DNA進(jìn)行10倍梯度稀釋，使羊肉DNA中分別含有100、10、1 mg/kg和100、10、1、0.1 ?g/kg的鴨肉DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，觀察該方法靈敏度及羊肉成分的存在對鴨肉檢測靈敏度的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物特異性

在優(yōu)化好的PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件下，以羊肉、牛肉、雞肉、鵝肉、豬肉、兔肉、馬肉、鹿肉等DNA為特異性實(shí)驗(yàn)對照進(jìn)行PCR檢測。電泳結(jié)果顯示，僅有家鴨被擴(kuò)增出條帶，而其他對照以及空白對照均未擴(kuò)增出條帶（圖1）。

圖1 PCR特異性檢測結(jié)果Fig.1 Specificity of the PCR method

2.2 靈敏度

圖2 PCR靈敏度檢測結(jié)果Fig.2 Sensitivity of the PCR method

對用羊肉DNA溶液稀釋的各質(zhì)量濃度鴨肉DNA進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果顯示，設(shè)計(jì)的引物對鴨肉的檢測敏感度可達(dá)到0.1 ?g/kg。同時(shí)，高質(zhì)量濃度羊肉DNA的存在并不影響鴨肉的檢測靈敏度（圖2）。

2.3 市售羊肉卷和肉板中鴨源性成分的檢測

應(yīng)用特異引物對2份市售的羊肉卷及肉板（經(jīng)證明已摻入鴨肉）進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果表明該方法能有效檢測出試樣中摻入的鴨源性成分（圖3）。

圖3 檢測樣品中的鴨源性成分Fig.3 Qualitative detection of duck-derived materials in commercial meat products

2.4 市售加工肉制品中鴨源性成分的檢測

加工肉制品由于需要經(jīng)過高溫處理或添加鹽類等調(diào)料制品，這些處理方式對DNA的提取效果均有影響。應(yīng)用特異性引物對市售的鴨脖、鴨腸制品進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果表明樣品通過洗滌方式去除樣品中的鹽、糖和色素后，經(jīng)PCR擴(kuò)增仍能夠檢測出鴨源性成分（圖4）。

圖4 檢測加工制品中的鴨源性成分Fig.4 Qualitative detection of duck-derived materials in processed meat products

3 結(jié) 論

本研究根據(jù)鴨COⅢ基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，成功建立了鴨源性成分的PCR檢測方法，填補(bǔ)了鴨源性成分檢測方法及標(biāo)準(zhǔn)的空白。

在本研究中，對所設(shè)計(jì)引物進(jìn)行特異性預(yù)測及實(shí)際檢驗(yàn)，結(jié)果表明所用引物與常見畜禽物種間無同源性，引物具有較高的特異性。另外，采用50 mg/kg羊肉DNA溶液對鴨肉DNA進(jìn)行稀釋，結(jié)果表明較高質(zhì)量濃度羊肉DNA的存在不影響鴨肉檢測的靈敏度（0.1 μg/kg），能夠滿足實(shí)際檢測需要。另外，肉制品經(jīng)加工等工序后，DNA會(huì)受到影響，特別是加熱時(shí)DNA片段會(huì)變短，因此要求引物擴(kuò)增的目的片段較短[24-25]。本研究中設(shè)計(jì)的引物所擴(kuò)增的目的片段為201 bp，適于加工的肉制品中鴨源性成分的檢測。本研究中所采用方法可應(yīng)用于肉制品摻假診斷、食品生產(chǎn)環(huán)節(jié)污染監(jiān)控及食品監(jiān)督部門檢測等各個(gè)領(lǐng)域，為檢測食品中摻假、造假提供技術(shù)支持，同時(shí)為食品安全工作順利開展打下良好技術(shù)基礎(chǔ)。

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A Polymerase Chain Reaction Method for Rapid Detection of Duck-Derived Materials in Meat Products

SHI Yan-yu1, LIU Jin-hua2, WANG Ying1, BING Wei1, HUA Lei1, LIU Xiao-hui1, WANG Ying1, ZHOU Liang1, WANG Xiao1
(1. Jilin Product Quality Supervision Inspection, Changchun 130022, China; 2. Jilin Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Changchun 130062, China)

This report describes a rapid polymerase chain reaction (PCR) method to detect duck-derived DNA by using primers corresponding to the duck COⅢ gene. The method was duck specific, free from interference from lumb DNA (50 mg/kg). Its sensitivity was sufficient to detect as low as 0.1 μg/kg duck-derived materials. It can provide a rapid and accurate way to identify duck-derived materials adulteration in meat products without interference of mutton DNA.

duck-derived materials; cytochrome oxidase Ⅲ (COⅢ) gene; polymerase chain reaction (PCR); detection

S853.74

A

1002-6630（2014）08-0163-03

10.7506/spkx1002-6630-201410030

2013-07-10

國家質(zhì)檢總局科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012QK169）

史艷宇（1977—），女，高級工程師，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：shiyanyu219@163.com