葉 雷，陳慶森,，閻亞麗,，趙林森，葛春美，趙 培，劉 芳，董宇坤

（1.天津市食品生物技術(shù)重點實驗室，天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134；2.河北一然生物科技有限公司， 河北 石家莊 050800）

流式細胞術(shù)快速檢測直投式發(fā)酵劑菌體活力

葉 雷1，陳慶森1,*，閻亞麗1,*，趙林森2，葛春美2，趙 培1，劉 芳1，董宇坤1

（1.天津市食品生物技術(shù)重點實驗室，天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134；2.河北一然生物科技有限公司， 河北 石家莊 050800）

利用熒光染料標記直投式發(fā)酵劑菌體細胞并結(jié)合流式細 胞術(shù)快速檢測和分析菌體細胞的活力以及生存狀態(tài)，對 科學(xué)地評 價各種微生物發(fā) 酵劑的品質(zhì)具有現(xiàn)實意義。研究選用保加利亞 乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）和嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）兩種直投式發(fā) 酵劑以及制備的新鮮菌體細胞和熱處理菌體 細胞作為分析檢測對象，利 用流式細胞術(shù)結(jié)合羧基熒光素雙乙酸酯（5-（6）-carboxyfluoresceindiacetate，5（6）-cFDA）和碘化丙啶（兩種熒光染料檢測了這些菌體的細胞活力。研究結(jié)果表明，5（6）-cFDA和PI雙染色方法適合檢測L. bulgaricus直投式發(fā)酵劑中菌體的存活力，該發(fā)酵劑中菌體存活率僅為4.7%，活力較低；而利用5（6）-cFDA單染色方法檢測S. thermophilus直投式發(fā)酵劑中菌體存活力的效果較好，其菌體存活力接近于90%，活力較強；同時，發(fā)酵活力驗證也得到了相同的結(jié)果；另外，研究證實了PI不能很好地區(qū)分S. thermophilus的死活細胞。因此，流式細胞術(shù)可作為直投式發(fā)酵劑生產(chǎn)行業(yè)快速檢測評價產(chǎn)品質(zhì)量的可靠方法。

熒光染料；流式細胞術(shù)；直投式發(fā)酵劑；存活力

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）作為益生菌在維持人體和動物的腸道健康方面具有重要作用，如今LAB在食品工業(yè)領(lǐng)域被廣泛用于發(fā)酵乳制品如益生菌酸奶、益生菌發(fā)酵乳飲料、益生菌奶酪等，另外在功能性食品配料、食品添加劑和飼料微 生態(tài)制劑方面也有廣泛應(yīng)用。通常根據(jù)發(fā)酵劑菌株的 存活力、凝乳能力、酸化能力、發(fā)酵產(chǎn)物的口感、質(zhì)地以及防腐性能來篩選發(fā)酵菌株。常用的發(fā)酵菌種大多為乳酸菌，如保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）、嗜熱鏈球菌（Streptococcus the rmophilus）、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）、瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）、雙歧桿菌（Bifi dobacterium）等，這些益生菌具有維持宿主微生態(tài)平衡[1-3]、增強腸黏膜屏障功能[4-6]、降低膽固醇[7-9]、緩解乳糖不耐癥以及腸道相關(guān)疾病[10-13]等作用。目前，乳品工業(yè)中發(fā)酵乳制品的生產(chǎn)，通常利用冷凍干燥技術(shù)將這些乳酸菌制備成接種量少、保質(zhì)期長、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，可以直接投入發(fā)酵生產(chǎn)的多功能直投式發(fā)酵劑。保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌和雙歧桿菌直投式發(fā)酵劑就是乳制品工業(yè)中 成功應(yīng)用的典型實例。然而，直投式發(fā)酵劑質(zhì)量優(yōu)劣與目標產(chǎn)品質(zhì)量的好壞有極為密切的關(guān)系，發(fā)酵劑中發(fā)酵菌株的存活力 不僅決定了發(fā)酵的成敗，而且影響發(fā)酵周期以及產(chǎn)品的獨特風(fēng)味和質(zhì)地。

直投式發(fā)酵劑的優(yōu)劣一般通過發(fā)酵劑中菌體存活力和代謝活力進行衡量，對于菌體存活力的檢測人們常習(xí)慣于傳統(tǒng)的平板活菌計數(shù)法，然而這種方法具有耗時長且只能檢出可培養(yǎng)菌體，而對 那些活的非可培養(yǎng)菌體則無法檢出等缺點。所以尋找能夠靈敏快速的檢測直投式發(fā)酵劑中菌體存活力的方法對科學(xué)地評價各種微生物發(fā)酵劑的品質(zhì)具有現(xiàn)實意義。近些年，應(yīng)用熒光染色技術(shù)結(jié)合流式細胞儀評價微生物的存活力和細胞活性有了一些報道，該方法是利用細胞表面特性和結(jié)構(gòu)的不同而產(chǎn)生的不同熒光特性以及散光特性來區(qū)分具有不同細胞活力的菌體，可以快速靈敏的檢測細胞的存活力[14-16]。用于分析評價細菌菌體活性的染料第一類為羧基熒光素雙乙酸酯（5-（6）-carboxyfluorescein diaceta te，5（6）-cFDA），它本身無熒光，在細胞的非特異性脂酶的催化下，5（6）-cFDA生成熒光素，后者經(jīng)480 nm激光激發(fā)出波長530 nm左右的綠色熒光。死細胞的細胞膜不完整，生成的熒光素很快擴散出細胞，不能檢測到帶有綠色熒光的細胞，所以該染 料用于檢測活細胞。另一類為核酸染料碘化丙錠（propidium iodide，PI），它不能進入具有完整細胞膜的活細胞，當菌體細胞死亡或細胞膜不完 整時，PI進入細胞與DNA相結(jié)合，在488 nm的激光激發(fā)下，在波長660 nm左右檢測到紅色熒光，所以該染料用于檢測死細胞[17]。

已有研究表明5（6）-cFDA和PI染色并結(jié)合流式細胞儀的分析技術(shù)能夠靈敏有效的測定細菌的存活力和生存狀態(tài)[17-20]。然而，該方法在分析評價直投式發(fā)酵劑中菌體細胞存活力方面的應(yīng)用目前還未有報道，因此本研究以L. bulgaricus和S. thermophilus兩種直投式發(fā)酵劑以及制備的新鮮菌體細胞和熱處理菌體細胞作為分析檢測對象，首先驗證流式細胞術(shù)檢測發(fā)酵劑中菌體存活力方法的可靠性，然后應(yīng)用這種快速檢測的方法來評價和比較乳品工業(yè)中常用的L. bulgaricus和S. thermophilus直投式發(fā)酵劑中菌體的存活力，為該技術(shù)的廣泛應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

L. bulgaricus直投式發(fā)酵劑 某益 生菌制劑公司；S. thermophilus直投式發(fā)酵劑 河北一然生物科技有限公司；乳酸細菌肉湯培養(yǎng)基 北京奧博星生物技術(shù)有限公司；羧基熒光素雙乙酸酯（5（6）-cFDA）、碘化丙錠（PI） 美國Sigma公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO） 北京索萊寶科技有限公司；0.2 μm膜過濾的磷酸鹽（phosphate buffer solution，PBS）緩沖液。

1.2 儀器與設(shè)備

FACS Ca libur型流式細胞儀（雙激光配置） 美國Becton，Dickinson and Company；ECLIPSE E200普通光學(xué)顯微鏡 日本Nikon公司、血球計數(shù)板 鹽城市恒泰玻璃儀器廠；3k15生化離心機 美國Sigma公司；紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；高壓滅菌鍋 日本三洋公司；微型漩渦混合儀 上海滬西分析儀器廠有限公司。

1.3 方法

1.3.1 直投式發(fā)酵劑的菌懸液制備

分別將兩種直投式發(fā)酵劑菌株（L. bulgaricus和S. thermophilus）室溫下解凍5～10 min，并將解凍的菌體分別用PBS緩沖液懸浮，制備的菌懸液以備使用。

1.3.2 流式細胞術(shù)分析的菌體樣品的制備

1.3.2.1 直投式發(fā)酵劑菌株的新鮮菌體的制備

分別將1.3.1節(jié)中制備的菌體懸浮液以1%的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)至對數(shù)期，4 000×g，4 ℃離心10 min，用PBS緩沖液反復(fù)洗滌兩次，獲得新鮮菌體。將離心獲得菌體懸浮于PBS緩沖液使菌體數(shù)接近于106CFU/mL。

1.3.2.2 5（6）-cFDA和PI熒光染色雙陰性對照菌體樣品的制備

分別取1 mL上述制備新鮮菌體懸浮液不進行任何染色，作為雙陰性對照，用于流式細胞儀檢測消除背景。

1.3.2.3 5（6）-cFDA單陽性對照菌體樣品的制備

取1 mL兩種新鮮菌體懸浮液，分別加入10 μL 5（6）-cFDA染液（5 mg/mL），37 ℃避光孵育10 min，熒光染色過程均在暗室中操作（下同），14 000×g，4 ℃離心1 min，1 mL PBS緩沖液重懸，用于5（6）-cFDA染液對兩種活菌染色效果的評價。

1.3.2.4 PI單陽性對照菌體樣品的制備

取1 mL兩種新鮮菌體懸浮液80 ℃水浴30 min，熱處理殺死所有菌體，分別加入30 μL PI染液（1 mg/mL），37 ℃避光孵育30 min，用于PI染液對兩種滅活的菌染色效果的評價。

1.3.2.5 PI/5（6）-cFDA雙染色菌體樣本的制備

分別取0.5 mL兩種新鮮菌體懸浮液80 ℃水浴30 min，熱處理殺死所有菌體，與0.5 mL新鮮菌體懸浮液混合，然后分別加入1 mL PI染液37 ℃避光孵育20 min，再加入1 mL 5（6）-cFDA染液37 ℃避光孵育10 min，14 000×g，4 ℃離心1 min，1 mL PBS緩沖液重懸，用于評價兩種染液區(qū)分死活細菌的效果。

1.3.2.6 待測發(fā)酵劑菌體樣品的制備

分別取1 mL 1.3.1節(jié)中制備的兩種菌體懸浮液，稀釋至菌體數(shù)接近于106CFU/mL，按上述染色劑量和染色時間進行PI和5（6）-cFDA染色。

1.3.3 流式細胞（flow cytometry，F(xiàn)CM）儀檢測

將上述1.3.2節(jié)制備的各種菌體樣品在充分混勻的前提下進行流式細胞儀分析檢測。FCM檢測光源為氬離子激光，氬離子激發(fā)光波長488 nm，發(fā)射光光波長大于630 nm，檢測器FL1檢測波長530 nm，檢測器FL3檢測波長670 nm，每個樣品收集30 000個細胞。以未進行5（6）-cFDA和PI熒光染色的菌體樣品作為雙陰性對照，以前向散射角（forward scatter，F(xiàn)SC）和側(cè)向散射角（side scatter，SSC）建立FSC-SSC點圖，設(shè)R1“門”以圈定待測的目標細胞；5（6）-cFDA和PI兩種熒光染液分別用 來檢測活細胞和死細胞，5（6）-cFDA進入FL1熒光通道，PI進入FL3熒光通道，獲取FL1-FL3點圖或者FL1-H、FL3-H柱狀圖。

1.3.4 平板菌落計數(shù)

對1.3.1節(jié)中得到的菌懸液用無菌PBS緩沖液進行梯度稀釋，于MRS固體平板上37 ℃培養(yǎng)48 h后，進行菌落計數(shù)，每個稀釋度做3 個平行，計數(shù)結(jié)果與FCM結(jié)果進行比較。

1.4 數(shù)據(jù)分析與處理

利用FACS Calibur型流式細胞儀專用的數(shù)據(jù)分析軟件CELL Quest program 6.0對實驗數(shù)據(jù)進行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 L. bulgaricus直投式發(fā)酵劑菌體細胞存活力的檢測

2.1.1 PI和5（6）-cFDA單染色區(qū)分 L. bulgaricus死菌和活菌效果的評價

研究按方法1.3.2.2、1.3.2.3和1.3.2.4節(jié)的方法制備待分析樣品，利用流式細胞儀分析檢測，其結(jié)果如圖1所示。

從圖1可以看出，PI和5（6）-cFDA能夠很好的區(qū)分L. bulgaricus的死菌和活菌。圖1a建立的FSC-SSC點圖用于圈定待測目標菌體；圖1b是雙陰性菌體的FL1-FL3熒光點圖，用于去除背景熒光。從圖1c可以看到有94%熱處理后的L. bulgaricus染上紅色熒光并分布在熒光點圖的左上區(qū)域，熒光強度接近102；相反，從圖1d可以看到有97%新鮮的L. bulgaricus染上綠色熒光，熒光強度接近103，集中分布在熒光點圖右下區(qū)域。雖然在圖1c和圖1 d中PI和5（6）-cFDA染色會有少量偏差，這可能是由于熱處理未完全致死菌體細胞，或者是由于實驗中產(chǎn)生的受損菌體和細胞碎片干擾所造成，但這并不影響PI和5（6）-cFDA區(qū)分L. bulgaricus的死菌和活菌效果。

圖1 1L. bulgariiccuuss PI和5（6）-cFDA染色熒光信號散點圖Fig.1 Dot plots representing PI and 5(6)-cFDA fluorescent signals of L. bulgaricus

2.1.2 PI/5（6）-cFDA雙染色區(qū)分L. bulgaricus死菌和活菌效果的評價

為了確認PI/5（6）-cFDA雙染色對于殺滅的和新鮮的L. bulgaricus菌體同時存在下的區(qū)分效果，按1.3.2.5節(jié)中的方法將50%的熱處理菌體和50%新鮮菌體混合，PI/5（6）-cFDA雙染色得到的熒光信號點圖如圖2所示。分析結(jié)果可知，5（6）-cFDA和PI標記上的菌體在FL1-FL3熒光信號點圖中可以很好的被區(qū)分開，根據(jù)染色特征菌體被分在4個不同的區(qū)域。位于熒光信號點圖左下區(qū)域的未染色菌體和細胞碎片僅占計數(shù)群體的0.2%，位于熒光信號點圖左上區(qū)域被PI標記的死菌數(shù)和右下區(qū)域被5（6）-cFDA標記的活菌數(shù)分別占計數(shù)群體的42%和44%；而位于熒光信號點圖右上區(qū)域被PI和5（6）-cFDA同時標記上的菌體數(shù)占計數(shù)群體的12%，這部分菌體細胞膜受損但是仍具有酯酶活性。結(jié)果顯示，PI/5（6）-cFDA雙染色可以很好的區(qū)分3種不同生理狀態(tài)下的L. bulgaricus菌體，進一步確認了PI/5（6）-cFDA雙染色用于檢測L. bulgaricus直投式發(fā)酵劑中菌體存活力的準確性。

圖2 2L. bulgariiccuuss 新鮮菌體（50%）和熱處理菌體（50%）混合后PI/5（6）-cFDA雙染色熒光信號散點圖Fig.2 Dot plots representing PI/5(6)-cFDA fluorescent signals of a mixture containing heat-killed (50%) and freshly harvested (50%) cells of L. bulgaricus

2.1.3 L. bulgaricus直投式發(fā)酵劑中菌體存活力的檢測

圖3 直投式發(fā)酵劑中L. bulgariiccuuss PI/5（6）-ccFDA雙染色熒光信號散點圖Fig.3 Dot plots representing PI/5(6)-cFDA fluorescent signals of L. bulgaricus in Direct Vat Set starter

PI/5（6）-cFDA雙染色用于檢測直投式發(fā)酵劑中L. bulgaricus的存活力，圖3為發(fā)酵劑中L. bulgaricus菌體PI/5（6）-cFDA雙染色熒光信號點圖。從圖3可以看到，發(fā)酵劑中菌體大部分被PI所標記，集中分布在左上區(qū)域，死菌數(shù)目比較多。研究為了證實方法的可靠性，對該直投式發(fā)酵劑又進行了3次平行檢測分析，結(jié)果均與圖3顯示的結(jié)果類似，表1中總結(jié)了4次檢測的結(jié)果。研究采用PI/5（6）-cFDA雙染色后，經(jīng)流式細胞儀檢測得到該直投式發(fā)酵劑中L. bulgaricus菌體存活力較弱，處于熒光點圖右下區(qū)域，具有顯著活性的菌體僅占總菌體數(shù)的4.7%；而被PI標記的處于左上區(qū)域的死菌占菌體總數(shù)的63.9%；另外，處于熒光點圖右上區(qū)域的菌體也超過了24%，表明受損細胞也較多。

表1 L. bulgaricus直投式發(fā)酵劑菌體活力FCM檢測結(jié)果Table1 Viability of L. bulgaricus in direct vat set starter obtained by flow cytometry

2.2 S. thermophilus直投式發(fā)酵劑中菌體存活力的檢測

2.2.1 PI和5（6）-cFDA染色區(qū)分S. thermophilus死菌和活菌效果的評價

圖4 4S. thermophiilluuss 5(6)-cFDA染色熒光信號柱狀圖Fig.4 Histogram representing 5(6)-cFDA fluorescent signals of S. thermophilus

從圖4a～4c可以看出，5（6）-cFDA染色能夠很好的區(qū)分熱處理和新鮮的S. thermophilus菌體。通過圖4a中陰性菌體劃定界限，M1區(qū)域表示FL1熒光信號弱或者無熒光信號的菌體，即未標記上5（6）-cFDA的菌體；M2區(qū)域表示FL1信號強的菌體，即標記上5（6）-cFDA的活菌。圖4b建立的FL1-H柱狀圖中處于M2區(qū)域內(nèi)活菌菌體數(shù)達到94%，且熒光信號超過103，菌體活力較強；雖然檢測結(jié)果與實驗設(shè)計存在部分偏差，這可能是由于樣品制備過程中產(chǎn)生少量死菌造成。另外，從圖4c分析結(jié)果可知，處于M1區(qū)域的具有較弱熒光或者無熒光的菌體占總數(shù)的50.69%，而處于M2區(qū)域被5（6）-cFDA標記上的有活力菌體數(shù)也達到了49.31%，熒光強度超過103；并且兩個區(qū)域內(nèi)峰型較好，細胞群在空間上分群非常明顯，幾乎無偏差。因此，利用5（6）-cFDA染色標記區(qū)分S. thermophilus的死菌和活菌的效果非常好，可以用于發(fā)酵劑中菌體存活力的檢測。

然而，從圖4d～4f的分析結(jié)果顯示，PI染色區(qū)分S. thermophilus死菌和活菌的效果不好。雖然圖4e中顯示熱處理后的菌體有超過98%的菌體被PI標記，但圖4f顯示的新鮮菌體（50%）和熱處理菌體（50%）混合后有85%的菌體被PI標記，僅15%的菌體未被標記，這與研究設(shè)計的檢測結(jié)果產(chǎn)生較顯著的偏離；另外，兩個區(qū)域的峰形較差，細胞群體沒有明顯界限，所以利用PI染色區(qū)分S. thermophilus死菌和活菌的效果不好。

2.2.2 S. thermophilus直投式發(fā)酵劑中菌體存活力的檢測

基于2.2.1節(jié)中的分析結(jié)果，利用5（6）-cFDA單染色來檢測直投式發(fā)酵劑中S. thermophilus的活力狀態(tài)，圖5為直投式發(fā)酵劑中S. thermophilus 5（6）-cFDA染色熒光信號柱狀圖。

圖5 直投式發(fā)酵劑中嗜熱鏈球菌5（6）-cFDA染色熒光信號柱狀圖Fig.5 Histogram representing 5(6)-cFDA fluorescent signals of S. thermophilus in Direct Vat Set starter

從圖5可以看出，發(fā)酵劑中S. thermophilus菌體大部分被5（6）-cFDA標記，集中分布在M2區(qū)域，且熒光強度均在103左右，菌體活力較強。為了證實分析結(jié)果的可靠性，對直投式發(fā)酵劑又進行了3次平行驗證實驗，結(jié)果與圖5顯示的結(jié)果一致，將4次實驗的結(jié)果歸納在表2。研究提示采用5（6）-cFDA單染色標記菌體細胞，經(jīng)流式細胞儀檢測獲得該直投式發(fā)酵劑中有接近90%的S. thermophilus菌體被5（6）-cFDA標記，處于柱狀圖的M2區(qū)域，且熒光強度均較強，發(fā)酵劑中菌體存活力強。

表2 S. thermophilus直投式發(fā)酵劑菌體活力FCM檢測結(jié)果Table2 Viability of S. thermophilus in Direct Vat Set obtained by flow cytometry

2.3 FCM技術(shù)和平板菌落計數(shù)法檢測效果的比較

比較傳統(tǒng)的平板菌落計數(shù)法和FCM技術(shù)檢測發(fā)酵劑中菌體細胞活性的效果，結(jié)果如表3所示。結(jié)果顯示，F(xiàn)CM技術(shù)檢測發(fā)酵劑中菌體細胞活性的結(jié)果與傳統(tǒng)的平板菌落計數(shù)的結(jié)果基本一致，并略高于傳統(tǒng)的平板菌落計數(shù)結(jié)果，說明FCM技術(shù)在檢測菌體細胞活性時具有更高的靈敏度和精確度。

表3 FCM技術(shù)和平板菌落計數(shù)法檢測發(fā)酵劑中菌體細胞活性的結(jié)果比較Table3 Comparison of cell viability in direct vat set starters evaluated by flow cytometry and plate count experiments

3 結(jié)論與討論

由于傳統(tǒng)的平板計數(shù)法具有耗時長且對細菌存活力檢測偏低等缺點，所以應(yīng)用能反映細胞內(nèi)酶活性的染料5（6）-cFDA以及能與核酸結(jié)合的熒光染料PI，雙染色或者單染色標記后，經(jīng)流式細胞儀快速檢測和評價L. bulgaricus和S. thermophilus直投式發(fā)酵劑中菌體的存活力和生存狀態(tài)。Amor等[18]利用5（6）-cFDA和PI雙染色結(jié)合流式細胞儀評價了雙歧桿菌對膽汁酸的敏感性，并根據(jù)染色情況將菌體分成活細胞、受損細胞和死細胞3 種不同生理狀態(tài)下的細胞，發(fā)現(xiàn)流式細胞術(shù)能夠快速靈敏的評價益生菌在應(yīng)激狀態(tài)下的生理狀態(tài)和穩(wěn)定性；汪清美等[19]利用這種方法成功的評價了保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌對模擬人體胃酸和膽汁鹽的耐受力。

本研究通過設(shè)計的雙陰性對照、制備活菌與死菌、單標記和雙標記染色等方案，利用流式細胞技術(shù)全面地檢測并評價了兩種直投式發(fā)酵劑中菌體細胞的活力狀態(tài)。結(jié)果顯示，評價的L. bulgaricus直投式發(fā)酵劑中菌體的活力很低，這可能是因為直投式L. bulgaricus對冷凍條件較為敏感，在發(fā)酵劑生產(chǎn)過程中，冷凍干燥工藝使得菌體受損甚至死亡，造成發(fā)酵劑中菌體細胞活力下降；也可能是由于直投式發(fā)酵劑在生產(chǎn)過程中添加的冷凍保護劑效果不佳，冷凍保存時間過長使得菌體細胞受損嚴重，活力顯著降低。Rault等[20]的研究證實了L. bulgaricus在經(jīng)過冷凍干燥后菌體活力下降了10%～50%，并且受到冷凍保存時間的影響，充分證實直投式發(fā)酵劑生產(chǎn)過程中的冷凍干燥技術(shù)的把握對菌體的活力影響很大，所以本研究提示在生產(chǎn)高效力發(fā)酵劑時，尋找有效的冷凍保護劑來維持菌體細胞的活力是必須的。

綜上所述，一種快速分析、評價發(fā)酵菌劑活力及菌體細胞完整性的流式細胞術(shù)的技術(shù)方法具有很高的可靠性，這為各種微生物發(fā)酵菌劑優(yōu)劣的科學(xué)評價提供一條具有實用以及推廣價值的方法。

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Rapid Assessment of Bacterial Viabi lity by Flow Cytometry in Direct Vat Set Yogurt Starter

YE Lei1, CHEN Qing-sen1,*, YAN Ya-li1,*, ZHAO Lin-sen2, GE Chun-mei2, ZHAO Pei1, LIU Fan g1, DONG Yu-kun1
(1. Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science, Tianjin University of Commerce,
Tianjin 30 0134, China; 2. Hebei Inatural Biotechnology Co. Ltd., Shijiazhuang 050800, China)

Direct labeling of starter cells with the fluorescent dye in combination with flow cytome try for rapid assessment of cell viability and survival status has practical significance for the scientific evaluation of the quality of various microbial fermentation starters. Direct vat set yogurt starter consisting of either Lactobacillus bulgaricus or Streptococcus thermophilus as well as their freshly harvested cells and heat-killed cells were evaluated for their viability using flow cytometry combined with staining with two sp ecific fluorescent dyes, 5(6)-cFDA and propidium iodide (PI). Double staining with 5(6)-cFDA and PI was suitable for evaluating the cell viability of L. bulgaricus in dir ect vat set starter, which was low, only 4.7%, while staining with 5(6)-cFDA alone could more effectively evaluate the viability of S. thermophilus in direct vat set culture, which was almost 90%. Also, the same results were observed in confirmatory experiments. Finally, our results also showed that PI did not give clear live/dead discrimination for S. thermophilus. Consequently, flow cytome try is a reliable tool to rapidly evaluate the via bility of direct vat set starter cultur es in dairy industry.

fluorescent dye; flow cytometry; direct vat set starter; viability

Q939.99

A

1002-6630（2014）10-0139-06

10.7506/spkx1002-6630-201410025

2013-12-08

國家自然科學(xué)基金面上項目（31071522）

葉雷（1989—），男，碩士研究生，研究方向為生物活性物質(zhì)研究與健康。E-mail：yelei20081020@126.com

*通信作者：陳慶森（1957—），男，教授，碩士，研究方向為發(fā)酵生物技術(shù)、蛋白資源開發(fā)與應(yīng)用。E-mail：chqsen@tjcu.edu.cn

閻亞麗（1962—），女，副教授，碩士，研究方向為發(fā)酵生物技術(shù)、微生物學(xué)。E-mail：yyali@tjcu.edu.cn