李加興，陳 選，鄧佳琴，吳 越，劉玲玲，涂 媛，周炎輝

（1.吉首大學(xué)食品科學(xué)研究所，湖南 吉首 416000；2.湖南奇異生物科技有限公司，湖南 長沙 410008）

黃秋葵黃酮的提取工藝和體外抗氧化活性研究

李加興1，陳 選2，鄧佳琴2，吳 越2，劉玲玲2，涂 媛2，周炎輝2

（1.吉首大學(xué)食品科學(xué)研究所，湖南 吉首 416000；2.湖南奇異生物科技有限公司，湖南 長沙 410008）

研究黃秋葵黃酮的超聲輔助提取工藝和體外抗氧化活性。在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化黃秋葵黃酮的超聲輔助提取工藝，并以VC為對照，對其還原力及羥自由基（·OH）、超氧陰離子自由基（）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除能力進行探討。結(jié)果表明，在超聲功率250 W的條件下，最佳提取工藝為料液比1：25 （g/mL）、提取時間21 min、提取溫度75 ℃、乙醇體積分數(shù)50%，此條件下黃酮得率的驗證實驗平均值為4.85%，與預(yù)測值4.88%相近，最佳工藝切實可行，制得的黃秋葵黃酮對·OH、DPPH自由基的IC50分別為6.00、3.28、2.98 mg/mL，最大清除率分別達31.49%、64.40%、62.22%，且具有較強的還原力，表現(xiàn)出較好的體外抗氧化活性。

黃秋葵；黃酮；超聲輔助提取；響應(yīng)面；抗氧化

黃秋葵為錦葵科（Malvaceae）秋葵屬（Abelmoschus Medic）的一年生草本植物，又名秋葵、補腎草、咖啡葵等，在國外被譽為“綠色人參”、“植物偉哥”。黃秋葵的果實、葉、芽、花均可食用，嫩果富含蛋白質(zhì)、氨基酸、纖維素、碳水化合物和維生素、礦物質(zhì)等眾多營養(yǎng)成分，同時還含有黃酮、多糖等活性成分，具有抗疲勞、增強免疫力、溫腎壯陽等功效，既可以作為高檔蔬菜，又可以開發(fā)成新型保健食品[1-3]。

生物類黃酮是具有較強清除自由基和抗氧化能力的一種物質(zhì)，一些生物類黃酮物質(zhì)的抗氧化作用甚至數(shù)倍于VC、VE。而眾多的生物類黃酮因其結(jié)構(gòu)的不同，有的表現(xiàn)出生物活性，有的則沒有生物活性[4]。黃秋葵是一種富含黃酮的植物，黃酮含量約為2.8%，同時還含有多糖、維生素等抗氧化活性物質(zhì)[5-7]。目前，關(guān)于黃秋葵活性物質(zhì)的研究大多集中于不同極性成分的分析上[8-11]，而針對其黃酮的研究較少。因此，本實驗以乙醇為提取溶劑，采用超聲波輔助提取黃秋葵中的黃酮，并通過響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，同時對黃秋葵黃酮的體外抗氧化性進行探討，以期為黃秋葵中黃酮類化合物的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃秋葵，湖南湘純農(nóng)業(yè)科技有限公司瀏陽栽培基地提供，采摘于7月份，瀏陽本地品種。

亞硝酸鈉、硝酸鋁、VC、三氯乙酸、三羥甲基氨基甲烷、三氯化鐵、鄰二氮菲、硫酸亞鐵、1,1-二苯基-2-三硝基苦肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、鄰苯三酚、雙氧水、鄰二氮菲、蘆丁標準品等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ-250E醫(yī)用超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；AM-0895分析天平 上海民新精密科學(xué)儀器有限公司；TDL-40C低速臺式離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠；QL-901型漩渦混合器 江蘇其林貝爾儀器有限公司；722可見分光光度計 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器廠。

1.3 方法

1.3.1 黃秋葵黃酮的提取工藝流程

黃秋葵鮮果→洗凈→干燥→粉碎過篩→加入乙醇→超聲輔助浸提（功率250 W）→離心→過濾→蒸發(fā)濃縮→冷凍干燥→黃酮

1.3.2 影響黃秋葵黃酮得率的單因素試驗

1.3.2.1 料液比對黃酮得率的影響

固定乙醇體積分數(shù)70%、提取時間25 min、提取溫度55 ℃，探討料液比（1：10、1：15、1：20、1：25、1：30，g/mL）對黃酮得率的影響。

1.3.2.2 提取時間對黃酮得率的影響

固定乙醇的體積分數(shù)70%、提取溫度55 ℃、料液比1：20（g/mL），探討提取時間（15、20、25、30、35 min）對黃酮得率的影響。

1.3.2.3 提取溫度對黃酮得率的影響

固定乙醇體積分數(shù)70%、料液比1：20（g/mL）、提取時間25 min，探討提取溫度（45、55、65、75、85 ℃）對黃酮得率的影響。

1.3.2.4 乙醇體積分數(shù)對黃酮得率的影響

固定料液比1：20（g/mL）、提取時間25 min、提取溫度65 ℃，探討乙醇體積分數(shù)（50%、60%、70%、80%、90%）對黃酮得率的影響。

1.4 超聲輔助提取工藝的響應(yīng)面優(yōu)化試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，用Design-Expert 8.0.6.1軟件設(shè)計Box-Behnken試驗，試驗因素與水平設(shè)計見表1。

表1 試驗因素與水平設(shè)計Table1 Factors and levels for response surface analysis

1.5 蘆丁標準曲線的繪制

準確稱取蘆丁標準品1 g，以質(zhì)量分數(shù)為30%的無水乙醇定容到100 mL；從中取出5 mL定容到100 mL，得到質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的蘆丁標準溶液；分別精確量取0、1、2、3、4、5、6 mL的蘆丁標準液于25 mL的比色管中，用質(zhì)量分數(shù)為30%的乙醇溶液稀釋到10 mL，加入質(zhì)量分數(shù)為5%的NaNO20.7 mL，混勻后靜置6 min，加入質(zhì)量分數(shù)為10%的Al(NO3)30.7 mL，混勻后靜置6 min，加入質(zhì)量分數(shù)為4%的NaOH 5 mL，用質(zhì)量分數(shù)為30%的乙醇定容到25 mL，混勻，靜置15 min后于510 nm處測吸光度，同時用試劑空白作為參比液。以蘆丁質(zhì)量濃度為X軸、吸光度為Y軸，繪制標準曲線；標準曲線的回歸方程為：Y=0.386X＋0.007，R2=0.999 3。

1.6 黃酮得率的測定

取10 mL方法1.3.1節(jié)中的濾液，用25 mL的比色管定容，然后按1.5節(jié)的方法于510 nm處測其吸光度，通過回歸方程和稀釋倍數(shù)計算提取液中的黃酮含量，然后按下式計算黃秋葵黃酮的得率：

1.7 黃秋葵黃酮體外抗氧化活性實驗

以最優(yōu)工藝制備的黃秋葵黃酮為原料進行體外抗氧化活性實驗，還原力的測定采用鐵氰化鉀還原法[12]；·OH清除率的測定采用鄰二氮菲法[13]；DPPH自由基清除率的測定采用DPPH法[14]；O-2·清除率的測定采用鄰苯三酚自氧化法[15]。

1.8 半抑制濃度（half maximal （50%） inhibitory concentration，IC50）的計算

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 料液比對黃酮得率的影響

圖1 料液比對黃酮得率影響Fig.1 Effect of solid-to-liquid ratio on the yield of flavonoids

由圖1可知，隨著溶劑體積的增大，黃酮得率提高。這主要是由于溶劑中溶質(zhì)的質(zhì)量濃度小，所以溶劑能夠溶解的物質(zhì)質(zhì)量在不斷增大所致。當料液比達到1：20 （g/mL）時，再增大提取溶劑用量，黃酮得率提高并不顯著，反而會增加后續(xù)濃縮的難度和成本[16]。綜合考慮，選取料液比為1：20（g/mL）較為合適。

2.1.2 提取時間對黃酮得率的影響

圖2 提取時間對黃酮得率的影響Fig.2 Effect of extraction time on the yield of flavonoids

由圖2可知，隨著提取時間的變化，黃酮得率呈先增加后降低的趨勢，當提取時間為25 min時，黃酮得率達最大值。提取時間過短，黃酮提取不完全；提取時間過長，能耗增加，同時黃酮類物質(zhì)的穩(wěn)定性將變差，并會隨著提取溶劑的不斷蒸發(fā)而損失或分解，從而導(dǎo)致得率降低[17-18]。因此，提取時間選擇為25 min較為適宜。

2.1.3 提取溫度對黃酮得率的影響

圖3 提取溫度對黃酮得率的影響Fig. 3 Effect of extraction temperature on the yield of flavonoids

由圖3可知，開始時隨著提取溫度升高，黃酮得率隨之增加，當溫度到達65 ℃時，黃酮得率出現(xiàn)一個峰值，之后由于過高的溫度對黃酮類物質(zhì)產(chǎn)生破壞[19]，黃酮得率反而降低。因此，以提取溫度為65 ℃較為適宜。

2.1.4 乙醇體積分數(shù)對黃酮得率的影響

圖4 乙醇體積分數(shù)對黃酮得率的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on the yield of flavonoids

由圖4可知，黃酮得率隨著乙醇體積分數(shù)的增加呈先上升后下降的趨勢，在乙醇體積分數(shù)為60%時，黃酮得率達到最大值。這是由于不同體積分數(shù)的乙醇極性不同，黃酮類化合物具有較高的極性，根據(jù)相似相溶原理，黃秋葵黃酮在乙醇體積分數(shù)為60%時溶出效果較好[20]。因此，選擇乙醇體積分數(shù)為60%較為合適。

2.2 響應(yīng)面分析及黃秋葵黃酮提取工藝的優(yōu)化

表2 響應(yīng)面分析方案及結(jié)果Table2 Experimental design and results for response surface analysis

表3 方差分析Table3 Analysis of variance

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，依據(jù)Box-Behnken試驗原則，安排料液比、提取時間、提取溫度、乙醇體積分數(shù)對得率影響的響應(yīng)面試驗，并采用響應(yīng)面法對提取工藝條件進行優(yōu)化。響應(yīng)面設(shè)計方案和試驗結(jié)果見表2，包括24 個析因試驗，5 個中心試驗，用來估算試驗誤差。

用Design-Expert 8.0.6.1軟件對表2的數(shù)據(jù)進行處理，其方差分析結(jié)果見表3，并對響應(yīng)值與各個因素進行回歸擬合，其擬合方程為：

R=3.58＋0.16A-0.094B＋3.333×10-3C-0.35D-0.01AB＋0.34AC-0.053AD＋5.0×10-3BC＋0.12BD-0.14CD-0.081A2-0.10B2-0.17C2-0.075D2

由表3的方差分析可知，回歸方程模型極顯著（P＜0.01），方程失擬項不顯著，表明該回歸模型與實測值能較好地擬合?；貧w系數(shù)R2=0.965 3＞0.9，表明該模型相關(guān)度好。各項的方差分析表明，A、D、AC、C2對黃酮得率有極顯著的影響。根據(jù)各影響因素標準回歸系數(shù)的大?。篋＞A＞B＞C，可知各因素對黃酮得率的影響大小順序為：乙醇體積分數(shù)＞料液比＞提取時間＞提取溫度。在交互項對黃酮得率的影響中，AC即料液比和提取溫度的交互作用對黃酮得率有較大影響，其響應(yīng)面和等高線見圖5。由于其他因素的交互作用對黃酮得率的影響較小所以未列出。

圖5 料液比和提取溫度對黃酮得率影響的響應(yīng)面和等高線Fig.5 Response surface and contour plots showing the effects of solidto-liquid ratio and temperature on the extraction yield of flavonoids

根據(jù)回歸方程模型，得到預(yù)測的最優(yōu)工藝條件為料液比1：25（g/mL）、提取時間20.77 min、提取溫度75 ℃、乙醇體積分數(shù)50%，在此條件下黃酮得率的預(yù)測值可達4.87%。為便于實驗操作，將最佳工藝條件修正為料液比1：25 （g/mL）、提取時間21 min、提取溫度75 ℃、乙醇體積分數(shù)50%，并進行3次平行驗證實驗，得到的黃酮得率實際平均值為4.85%。該實際值和預(yù)測值大小相近，因此利用響應(yīng)面法優(yōu)化所得的工藝條件具有可行性。

2.3 黃秋葵黃酮的體外抗氧化活性

圖6 黃秋葵黃酮的還原力及·OH、?、DPPH自由基清除率Fig.6 Reducing power and hydroxyl, superoxide anion and DPPH radical scavenging activities of okra flavonoids

由圖6可知，在所考查的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，黃秋葵黃酮和VC的還原力均隨著質(zhì)量濃度的增加而增加，并且呈現(xiàn)出較好的量效關(guān)系，其中3.2 mg/mL的黃秋葵黃酮的還原力與250 μg/mL的VC相當。黃秋葵黃酮對·OH、O2-·、DPPH自由基均具有清除效果，且存在劑量效應(yīng)，當黃秋葵黃酮質(zhì)量濃度為4 mg/mL時，其最大清除率分別達31.49%、64.40%、62.22%，表現(xiàn)出良好的抗氧化活性。對黃秋葵黃酮的·OH、O2-·、DPPH自由基清除率與濃度進行線性擬合，其線性擬合方程分別為：Y（·OH）= 0.096 7X-0.080 2，R2=0.994 1；Y（O2-·）=0.179 6X-0.088 9，R2=0.995 5；YDPPH自由基=0.152 1X＋0.047，R2=0.993 8，均呈現(xiàn)出良好的線性量效關(guān)系；由此可計算出黃秋葵黃酮的·OH、O2-·、DPPH自由基的IC50分別為6.00、3.28、2.98 mg/mL。

3 結(jié) 論

黃秋葵作為營養(yǎng)保健型的綠色蔬菜，正日益受到消費者喜愛，其研究和開發(fā)也在逐步深入。本實驗采用超聲輔助法提取黃秋葵中的黃酮，并探討了其體外抗氧化活性，對黃秋葵黃酮類化合物的開發(fā)利用具有較大指導(dǎo)意義。經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化，在超聲功率250 W條件下，黃秋葵黃酮的最佳提取工藝為料液比1：25 （g/mL）、提取時間21 min、提取溫度75 ℃、乙醇體積分數(shù)50%，此條件下黃酮得率的實際平均值可達4.85%，與預(yù)測值4.88%相近，該最佳工藝切實可行，制得的黃秋葵黃酮對·OH、、DPPH自由基的IC50分別為6.00、3.28、2.98 mg/mL，最大清除率分別達31.49%、64.40%、62.22%，且具有較強的還原力，表現(xiàn)出較好的體外抗氧化活性。

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Extraction and Antioxidant Activity in vitro of Okra Flavonoids

LI Jia-xing1, CHEN Xuan2, DENG Jia-qin2, WU Yue2, LIU Ling-ling2, TU Yuan2, ZHOU Yan-hui2
(1. Institute of Food Science, Jishou University, Jishou 416000, China; 2. Hunan Amazing Grace BiotechnologyLimited Company, Changsha 410008, China)

This paper reports the results obtained for the ultrasonic-assisted extraction and antioxidant activity in vitro of flavonoids from fresh okras. The extraction process was optimized using response surface methodology. The evaluation of antioxidant activity was carried out by reducing power, hydroxyl, superoxide anion and DPPH radical scavenging assays in comparison to VC. The optimum extraction conditions were determined as 250 W, 1:25 (g/mL), 21 min, 75 ℃ and 50% for ultrasonic power, solid-to-solvent ratio, extraction time, temperature and ethanol concentration, respectively. The experimentally observed yield of flavonoids under the optimized conditions was 4.85% on average, which approximated the predicted value of 4.88%, showing the reliability of the optimized process. In hydroxyl, superoxide anion and DPPH radical scavenging assays, the IC50of the flavonoids extracted from okra were 6.00, 3.28 and 2.98 mg/mL, and the maximum scavenging rates were 31.49%, 64.40% and 62.22%, respectively. Moreover, strong reducing power was observed. These results support strong antioxidant activity in vitro for okra flavonoids.

okra; flavonoids; ultrasound-assisted extraction; response surface methodology; antioxidant activity

201.2

A

1002-6630（2014）10-0121-05

10.7506/spkx1002-6630-201410022

2014-01-14

李加興（1969—），男，教授，博士，研究方向為植物資源開發(fā)利用與功能性食品。E-mail：jslijiaxing@sohu.com