肖 洪，黃先智，沈以紅，丁曉雯,，秦櫻瑞，曾藝濤，楊 娟，丁順杰，商 桑

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶市農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室，重慶 400715；2.家蠶基因組生物學(xué)國家重點實驗室，重慶 400715）

響應(yīng)面法優(yōu)化提高發(fā)酵桑葉茶中1-脫氧野尻霉素含量工藝

肖 洪1，黃先智2，沈以紅2，丁曉雯1,*，秦櫻瑞1，曾藝濤1，楊 娟1，丁順杰1，商 桑1

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶市農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室，重慶 400715；2.家蠶基因組生物學(xué)國家重點實驗室，重慶 400715）

為優(yōu)化提高發(fā)酵桑葉茶中1-脫氧野尻霉素含量工藝，采用響應(yīng)面分析法，以發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間及接種量為自變量，1-脫氧野尻霉素含量為響應(yīng)值，設(shè)計三因素三水平響應(yīng)面回歸分析。結(jié)果表明：提高發(fā)酵桑葉茶中1-脫氧野尻霉素含量工藝的最佳工藝條件為發(fā)酵溫度30 ℃、發(fā)酵時間5.6 h、黑曲霉：日本根霉：綠色木霉=2：1：2菌液接種量3.75×107CFU/100 g，在此條件下發(fā)酵桑葉茶中1-脫氧野尻霉素含量為133.882 mg/100 g。

發(fā)酵；桑葉茶；1-脫氧野尻霉素；響應(yīng)面分析

桑葉茶是由桑葉加工制作而成的新型茶品，目前一般采用直接烘干或自然發(fā)酵的方式生產(chǎn)。桑葉綠茶甘醇香甜；桑葉烏龍茶爽口醇和，有淡淡的花香；桑紅茶甘甜醇厚，有近似香蕉的果香味[1]。但桑葉綠茶普遍存在湯色發(fā)黑，豆腥味重，感官品質(zhì)不佳的問題，為此，人們嘗試開發(fā)桑葉烏龍茶、紅茶等產(chǎn)品。桑葉茶的主要功能成分包括γ-氨基丁酸[2-3]、褪黑激素[4]、黃酮苷[5-6]、α-葡萄糖苷酶和酪氨酸酶抑制劑[7]，以及生物堿、茶多酚、花青素、綠原酸、白藜蘆醇、氧化芪三酚、β-胡蘿卜素等生物活性成分[8-9]。黃酮類物質(zhì)具有降血壓、抗氧化、防癌、抗炎、抗過敏、利尿、解痙、鎮(zhèn)咳、降血脂等生理作用[10]。桑葉中含有的多糖具有顯著的降血糖作用[11]，可以抑制α-葡萄糖苷酶和豬胰液α-淀粉酶的活性[12]等作用。桑葉茶的礦物元素含量比茶葉高出3～6 倍；總糖、酚類物質(zhì)、氨基酸含量都較高；同時桑葉葉面較薄，比茶葉易溶解出更多的有效成分，有利于人體的吸收[13]。

1-脫氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，1-DNJ）是一種極性含N化合物，其化學(xué)名稱為3,4,5-三羥基-2-羥甲基四氫吡啶，分子式為C6H13NO4，相對分子質(zhì)量為163[14-15]，是一種α-葡萄糖苷酶抑制劑，具有降血糖[16-17]、降血脂[18-19]、抗腫瘤[20]、抑制變形鏈球菌生長[21]、抗病毒[22]等功效。桑葉是植物中1-DNJ含量比較高的，但不同葉位、加工工藝等諸多因素都可能影響到桑葉茶中1-DNJ的含量[23-24]。

前期實驗研究發(fā)現(xiàn)黑曲霉、日本根酶、綠色木霉復(fù)合發(fā)酵得到的桑葉茶綜合品質(zhì)好，且菌種比例為黑曲霉：日本根霉：綠色木霉=2：1：2時發(fā)酵桑葉茶品質(zhì)最優(yōu)。本實驗旨在研究不同發(fā)酵條件對發(fā)酵桑葉茶中1-DNJ含量的影響，并用響應(yīng)曲面優(yōu)化提高發(fā)酵桑葉茶中1-DNJ的工藝條件，為桑葉的深度開發(fā)利用提供數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌種

黑曲霉（Aspergillus niger，GSICC 60108） 甘肅省微生物菌種保藏中心；日本根霉（Rhizopus japonicus Vuillemin，GIM3.119）、綠色木霉（Trichoderma viride，GIM3.443） 廣東省微生物研究所微生物菌種保藏中心；以上3 種菌種的安全等級均高，其生物危害程度為4 類，在通常情況下不會引起人類或者動物疾病。

1.1.2 實驗樣本

采摘的桑品種為湖桑，種植與于西南大學(xué)桑園；人工發(fā)酵桑葉茶由本實驗室自制。

1.2 試劑與儀器

1-DNJ標(biāo)準(zhǔn)品 北京德威鈉生物技術(shù)有限公司；甘氨酸（Gly）、9-芴基氯甲酸甲酯（9-fluorenylmethyl chloroformate，F(xiàn)MOC） 美國Sigma公司；乙腈（色譜純） 天津市四友精細化學(xué)品有限公司；其他常用試劑均為分析純。

1525高效液相色譜儀 美國Waters公司；5810型臺式高速離心機 德國Eppendorf公司；旋渦混合器 上海精科實業(yè)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵桑葉茶的制備

采摘從頂芽往下數(shù)4～10 片的新鮮桑葉，去柄，切為4 cm×4 cm的小葉片，混勻后稱取100 g葉片用微波殺青90 s，揉捻，研究發(fā)酵條件（發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、菌接種量）對黑曲霉＋日本根酶＋綠色木霉菌液10 mL，復(fù)揉，不同溫度條件下發(fā)酵不同時間，微波干燥，制得桑葉茶。

本實驗開始的時間為2012年11月上旬，因為桑葉的季節(jié)性，在每年11月底需要對桑樹進行剪枝，且桑葉在4 ℃保存時間較短，在-18 ℃保存解凍后會造成大量的汁液流失，導(dǎo)致單因素試驗中所用原料湖桑桑葉采摘時間為2012年11月初，而工藝優(yōu)化所用原料湖桑桑葉采摘時間為2013年5月初。

1.3.2 1-DNJ的HPLC法測定

準(zhǔn)確稱取20 mg 1-DNJ標(biāo)準(zhǔn)品，將其在燒杯中溶于少量水中，移入25 mL容量瓶，沖洗燒杯和玻璃棒5 次并移入容量瓶，加超純水定容至25 mL，即得0.8 mg/mL的1-DNJ標(biāo)準(zhǔn)溶液。用時將1-DNJ標(biāo)準(zhǔn)液配制成質(zhì)量濃度為60、120、180、240、300、480 μg/mL備用。

1-DNJ的提?。壕_稱取待測樣品0.5 g，加入35 mL超純水，80 ℃水浴浸提2 h（每20 min搖勻一次），抽濾后，用超純水定容至50 mL，即得樣品提取液。

1-DNJ衍生化：取1-DNJ提取液（或1-DNJ標(biāo)準(zhǔn)液）300 μL于5.0 mL的離心管，加入0.4 mol/L硼酸鉀緩沖液（pH 8.5）300 μL，再加入5 mmol/L的FMOC-Cl（溶解于乙腈中）600 μL，混勻后，25 ℃水浴20 min。加入1 mol/L的甘氨酸300 μL中和剩余的FMOC-Cl以終止反應(yīng)，加入體積分數(shù)1%的醋酸液300 μL及超純水1 200 μL稀釋，8 000 r/min離心20 min，以0.45 μm微孔濾膜過濾器過濾，收集濾過液備測。

空白實驗：以蒸餾水代替樣品，空白對照衍生化反應(yīng)以蒸餾水代替進行衍生化反應(yīng)。

色譜條件：色譜柱：C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；紫外檢測器；檢測波長：254 nm；流動相：乙腈-0.1%醋酸（50：50，V/V）；流速：1.0 mL/min；柱溫：25 ℃；進樣量：10 μL。

1.3.3 響應(yīng)面試驗

提高發(fā)酵桑葉茶中1-DNJ工藝優(yōu)化響應(yīng)面分析試驗因素與水平設(shè)計見表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素水平表Table1 Independent variables and their coded values tested in response surface analysis

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

各實驗至少重復(fù)3 次以上，實驗數(shù)據(jù)用Excel和Design Expert 8.05b進行統(tǒng)計處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 1-DNJ標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)及色譜圖

按照1.3.2節(jié)的實驗方法，對不同質(zhì)量濃度1-DNJ標(biāo)準(zhǔn)溶液進行測定，以峰面積y為縱坐標(biāo)，1-DNJ質(zhì)量濃度x（μg/mL）為橫坐標(biāo)，得到1-DNJ的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為y=15 776x-70 392，相關(guān)系數(shù)r=0.999 6。

將空白、1-DNJ標(biāo)準(zhǔn)品、桑葉茶樣品經(jīng)衍生化后上高效液相色譜儀進行測定，分別得到如圖1所示色譜圖。

圖1 空白（a）、1--DNJ標(biāo)準(zhǔn)品（b）和桑葉茶樣品（c）色譜圖Fig.1 Chromatograms of blank sample (a), 1-DNJ standard(b) and mulberry leaf tea sample (c)

由色譜圖1可知，在本實驗條件下，1-DNJ衍生物DNJ-FMOC的保留時間為2.731 min，與Gly-FMOC和FMOC-OH的峰間距分別相差2.719 min和4.243 min，表明這兩種物質(zhì)均不干擾1-DNJ的測定。

2.2 1-DNJ的檢測分析

對實驗中所用的3 種菌種單一和復(fù)合接種于不添加桑葉的馬鈴薯培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基中未檢測到1-DNJ。2013年5月初做響應(yīng)面優(yōu)化試驗時測得桑葉中1-DNJ含量為119.986 mg/100 g。

2.3 單因素對發(fā)酵桑葉茶中1-DNJ含量的影響

2.3.1 發(fā)酵溫度

取100 g桑葉分別在25、30、35、40、45、50 ℃條件下加入107CFU的黑曲霉：日本根霉：綠色木霉=2：1：2的菌液10 mL發(fā)酵5 h生產(chǎn)桑葉茶，探究發(fā)酵桑葉茶中1-DNJ含量的變化。

由圖2可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，發(fā)酵桑葉茶中的1-DNJ含量先增加后降低，然后又略有增加，在25～50 ℃條件下，隨著溫度的變化，1-DNJ含量沒有規(guī)律性的變化，可能與使用3 種菌種進行復(fù)合發(fā)酵有關(guān)，因為不同菌種的最適生長溫度略有差別。桑葉茶發(fā)酵的一種可能是以酶為催化劑的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)過程，合適的發(fā)酵溫度才能確保酶促反應(yīng)的順利進行，溫度過低會降低酶的活性，溫度過高會使酶失活。溫度為30 ℃時發(fā)酵桑葉茶中1-DNJ含量最高，這可能是因為30 ℃為3 種復(fù)合菌種的最適生長和產(chǎn)酶溫度，更利于1-DNJ的產(chǎn)生；但在發(fā)酵溫度為40 ℃以后1-DNJ含量略有增加，但沒有0 ℃時得到的1-DNJ含量高，這可能是高溫一定程度的抑制了菌種的生長和酶活，另外可能是桑葉為微生物生長提供所需的碳源或氮源。由此確定發(fā)酵溫度為30 ℃最佳。

圖2 不同發(fā)酵溫度條件下發(fā)酵桑葉茶中1--DNJ含量Fig.2 Effect of fermentation temperature on the 1-DNJ content of fermented mulberry leaf tea

2.3.2 發(fā)酵時間

取100 g桑葉分別在25 ℃條件下加入107CFU的黑曲霉：日本根霉：綠色木霉=2：1：2的菌液10 mL發(fā)酵1、2、3、4、5、6、7 h、生產(chǎn)桑葉茶，探究其1-DNJ含量的變化。

圖3 不同發(fā)酵時間條件下發(fā)酵桑葉茶中1--DNJ含量Fig.3 Effect of fermentation time on the 1-DNJ content of fermented mulberry leaf tea

由圖3可知，隨著發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵桑葉茶中的1-DNJ呈現(xiàn)出先緩慢增加然后降低的趨勢，在發(fā)酵6 h時發(fā)酵桑葉茶中的1-DNJ含量最高，之后1-DNJ含量又逐漸降低，所以選擇發(fā)酵時間為6 h較為合適。

2.3.3 菌接種量

取100 g桑葉分別在25 ℃條件下加入0.5×107、1×107、2×107、4×107、6×107、8×107、10×107CFU的黑曲霉：日本根霉：綠色木霉=2：1：2的菌液10 mL發(fā)酵5 h生產(chǎn)桑葉茶，探究其1-DNJ含量的變化。

由圖4可知，適宜的接種量以4×107CFU/100 g為宜。在接種量低于4×107CFU/100 g時，發(fā)酵桑葉茶中的1-DNJ含量隨接種量的增加呈上升的趨勢，接種量超過4×107CFU/100 g時，發(fā)酵桑葉茶中的1-DNJ含量明顯降低。這可能是由于在接種量較低時，菌種自身繁殖代謝慢，發(fā)酵不徹底，發(fā)酵桑葉茶中的1-DNJ含量低；但當(dāng)接種量大于6×107CFU/100 g時，隨著接種量的增大，發(fā)酵桑葉茶中的1-DNJ含量又略有增加，這可能與使用3 種菌種進行復(fù)合發(fā)酵有關(guān)，具體原因需要進一步的探究。所以選擇接種量為4×107CFU/100 g。

圖4 不同菌接種量下發(fā)酵桑葉茶中活性成分含量Fig.4 Effect of inoculum amount on the 1-DNJ content of fermented mulberry leaf tea

2.4 回歸模型的建立及顯著性檢驗

按照表1試驗方案進行三因素三水平試驗，結(jié)果見表2。將所得的試驗數(shù)據(jù)采用Design Expert 8.05b軟件進行多元回歸擬合，得到以1-DNJ含量為目標(biāo)函數(shù)的二次回歸方程。1-DNJ含量對發(fā)酵溫度X1、發(fā)酵時間X2、接種量X3二次多項回歸方程為：

Y=-100.947 10＋12.583 29X1＋16.005 43X2＋2.579 05X3＋0.358 10X1X2＋0.370 93X1X3-0.768 38X2X3-0.271 50-2.116 40-1.229 54

為檢驗方程的有效性，對1-DNJ含量的數(shù)學(xué)模型進行方差分析，結(jié)果見表3。由表3可知，一次項X1、X2、X3中X2、X3極顯著（P＜0.01），說明發(fā)酵時間、接種量對發(fā)酵桑葉茶中1-DNJ含量有極顯著影響。交互項X1X2、X1X3、X2X3均顯著（P＜0.05）說明發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度和接種量、發(fā)酵時間和接種量對發(fā)酵桑葉茶中1-DNJ含量有顯著影響。二次項、、X均具有極顯著差異（P＜0.01）。二次回歸模型的F值為44.57，P＜0.01，說明該模型極顯著，失擬項P值大于0.05，表明失擬不顯著，模型的修正相關(guān)系數(shù)平方0.960 8，說明該模型能反映96.08% 響應(yīng)值的變化，因而該模型擬合程度較好，試驗誤差小，較好地反映了1-DNJ含量與發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、接種量的關(guān)系，因此可以用此模型對發(fā)酵桑葉茶中1-DNJ含量進行分析和預(yù)測。

表2 1-DNJ工藝優(yōu)化響應(yīng)面分析試驗設(shè)計及結(jié)果Table2 Experimental design and corresponding results for response surface analysis

表3 1-DNJ含量回歸方程方差分析表Table3 Analysis of variance for the regression model for 1-DNJ content

2.5 各因素交互作用響應(yīng)面分析

圖5 發(fā)酵時間與發(fā)酵溫度交互作用對1-DNJ含量影響Fig.5 Interactive effects of fermentation time and temperature on the 1-DNJ content of fermented mulberry leaf tea

從圖5可以看出，當(dāng)接種量為4×107CFU/100 g時，發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間的交互作用顯著影響發(fā)酵桑葉茶中1-DNJ含量。在發(fā)酵時間一定的情況下，隨著發(fā)酵溫度的升高，發(fā)酵桑葉茶中1-DNJ含量均呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢。發(fā)酵溫度大于30 ℃時，隨著發(fā)酵溫度的升高發(fā)酵桑葉茶中1-DNJ含量降低，可能30 ℃是3 種復(fù)合菌種的最適生長和產(chǎn)酶溫度。

圖6 接種量與發(fā)酵溫度交互作用對1--DNJ含量影響Fig.6 Interactive effects of inoculum amount and fermentation temperature on the 1-DNJ content of fermented mulberry leaf tea

從圖6可知，當(dāng)發(fā)酵時間為6 h時，發(fā)酵溫度和接種量的交互作用顯著影響發(fā)酵桑葉茶中1-DNJ含量。在發(fā)酵溫度一定的情況下，隨著菌接種量的提高，發(fā)酵桑葉茶中1-DNJ含量均呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢。菌接種量大于4×107CFU/100 g時，隨著菌接種量的增加發(fā)酵桑葉茶中1-DNJ含量降低，這可能是接種量過大時，菌種繁殖旺盛，需要消耗大量桑葉中的營養(yǎng)成分和生物活性物質(zhì)分來完成自身代謝。

圖7 接種量與發(fā)酵時間交互作用對1--DNJ含量影響Fig.7 Interactive effects of inoculum amount and fermentation time on the 1-DNJ content of fermented mulberry leaf tea

從圖7可以看出，當(dāng)發(fā)酵溫度為30 ℃時，發(fā)酵時間和菌接種量的交互作用顯著影響發(fā)酵桑葉茶中1-DNJ含量。當(dāng)發(fā)酵時間大于6 h時，隨著發(fā)酵時間的增加發(fā)酵桑葉茶中1-DNJ含量降低。

2.6 最佳工藝條件的確定和實驗驗證

通過對二次回歸模型的分析，可以確定提高發(fā)酵桑葉茶中1-DNJ含量的最佳工藝條件為發(fā)酵溫度29.41 ℃、發(fā)酵時間5.59 h、接種量3.74×107CFU/100 g，在該工藝條件下，模型預(yù)測的發(fā)酵桑葉茶中1-DNJ含量為133.689 mg/100 g。為便于實際應(yīng)用，取發(fā)酵溫度30 ℃、發(fā)酵時間5.6 h、接種量3.75×107CFU/100 g，在此條件下進行驗證實驗，得發(fā)酵桑葉茶中1-DNJ含量為133. 882 mg/100 g，此數(shù)值與模型預(yù)測值的相對誤差為1.443%，預(yù)測精度較高，說明此模型可靠。

3 結(jié) 論

響應(yīng)面法獲得的提高發(fā)酵桑葉茶中1-DNJ含量的最佳工藝參數(shù)為發(fā)酵溫度30 ℃、發(fā)酵時間5.6 h、接種量3.75×107CFU/100 g，發(fā)酵桑葉茶中1-DNJ含量為133.882 mg/100 g，與桑葉中1-DNJ含量（119.986 mg/100 g）比較，經(jīng)發(fā)酵后桑葉茶中的1-DNJ含量有一定的提高，發(fā)酵所得的桑葉茶營養(yǎng)豐富，開發(fā)前景廣闊。

由于桑葉的季節(jié)性，對本實驗結(jié)果造成了一些誤差；其次，與桑葉對比可知經(jīng)發(fā)酵后桑葉茶中1-DNJ含量增加不是特別顯著，在今后的研究中本課題組會用更多的菌種進行實驗，以期能得到提高發(fā)酵桑葉茶中1-DNJ含量的優(yōu)勢菌種。

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Optimization of Fermentation Conditions for Enhanced 1-Deoxynojirimycin Content in Fermented Mulberry Leaf Tea by Response Surface Methodology

XIAO Hong1, HUANG Xian-zhi2, SHEN Yi-hong2, DING Xiao-wen1,*, QIN Ying-rui1, ZENG Yi-tao1, YANG Juan1, DING Shun-jie1, SHANG Sang1
(1. Chongqing Key Laboratory of Agricultural Product Processing, College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China; 2. State Key Laboratory of Silkworm Genome Biology, Chongqing 400715, China)

Response surface methodology was used to optimize the fermentation conditions for producing fermented mulberry leaf tea with higher 1-deoxynojirimycin (1-DNJ) content. The 1-DNJ content was investigated with respect to fermentation temperature, fermentation time and inoculum amount by response surface regression analysis. The optimum fermentation conditions that provided a 1-DNJ content of 133.882 mg/100 g dry weight of fermented mulberry leaf tea were determined as 30 ℃, 5.6 h, a ratio of Aspergillus niger to Rhizopus japonicus Vuillemin to Trichoderma viride of 2:1:2, and an inoculum amount of 3.75×107CFU/100 g.

fermentation; mulberry leaves; 1-deoxynojirimycin (1-DNJ); response surface analysis

S886.9

A

1002-6630（2014）10-0046-06

10.7506/spkx1002-6630-201410009

2013-07-03

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（蠶業(yè)）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項（CARS-22-ZJ0503）；重慶市科委應(yīng)用技術(shù)項目（cstc，2012gg-yyjs80022）

肖洪（1989—），男，碩士研究生，研究方向為食品安全與質(zhì)量控制。E-mail：xiaohong463108359@163.com

*通信作者：丁曉雯（1963—），女，教授，博士，研究方向為食品安全與功能食品。E-mail：xiaowend@sina.com