王 晶，吳燕燕，李來(lái)好，楊賢慶

（1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510300；2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306）

響應(yīng)面法優(yōu)化微波輔助酶解合浦珠母貝蛋白工藝

王 晶1,2，吳燕燕1,*，李來(lái)好1，楊賢慶1

（1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510300；2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306）

研究微波對(duì)酶解合浦珠母貝蛋白的影響，以水游離氨態(tài)氮含量和抗氧化活性為指標(biāo)，選擇較好的作用酶，通過(guò)單因素試驗(yàn)確定料液比、加酶量（E/S）、微波溫度、微波功率及時(shí)間和后續(xù)水浴時(shí)間等因素水平，以水解度和DPPH自由基清除率為響應(yīng)值，響應(yīng)面法優(yōu)化酶解合浦珠母貝蛋白工藝條件。結(jié)果表明，微波輔助蛋白酶酶解合浦珠母貝蛋白工藝條件為微波溫度58 ℃、微波功率300 W、微波時(shí)間17 min、加酶量5 000 U/g，后續(xù)在58 ℃條件下再水浴1.5 h。預(yù)測(cè)響應(yīng)值為0.224 4，水解度達(dá)到26.15%，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)證明與響應(yīng)優(yōu)化模型預(yù)測(cè)值誤差不大，二次多元擬合度較好。

合浦珠母貝蛋白；微波輔助酶解；抗氧化活性；響應(yīng)面法

合浦珠母貝，又稱(chēng)馬氏珠母貝，是我國(guó)南海近海的主要養(yǎng)殖品種，也是我國(guó)主要的產(chǎn)珠貝種。但是采珠后會(huì)產(chǎn)生的大量珍珠貝肉，在市面上的加工利用率低且應(yīng)用面窄[1]。研究發(fā)現(xiàn)合浦珠母貝肉不僅具有很高的食用價(jià)值，還富含蛋白質(zhì)、多種不飽和脂肪酸、礦物質(zhì)和維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[2-3]。同時(shí)其酶解產(chǎn)物還具有抗氧化功能、較強(qiáng)的清除自由基能力[4-7]。珍珠的抗衰老特性已得以證明，合浦珠母貝因其在海洋中的特殊生長(zhǎng)環(huán)境，其貝肉中還有豐富的抗氧化肽[8-10]，因此為從海洋資源中提取天然抗氧化劑提供了新途徑。

微波是指頻率在300 MHz～300 GHz的高頻電磁波，目前學(xué)術(shù)界對(duì)微波加速有機(jī)反應(yīng)的機(jī)理有兩種觀點(diǎn)：微波熱效應(yīng)和分子振動(dòng)降低反應(yīng)活化能的非熱效應(yīng)[11]。但微波技術(shù)最大的特點(diǎn)是可以縮短酶解時(shí)間，從而提高提取效率、降低成本[12-13]。

本實(shí)驗(yàn)利用微波輔助蛋白酶水解合浦珠母貝蛋白，以期縮短蛋白水解時(shí)間，提高蛋白質(zhì)水解度，為酶解合浦珠母貝蛋白制備抗氧化肽提供資源和工業(yè)化生產(chǎn)提供新思路和技術(shù)支持，為進(jìn)一步純化抗氧化肽提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

合浦珠母貝購(gòu)自海南養(yǎng)殖基地。

Alcalase 2.4L蛋白酶（2×105U/g） 丹麥諾維信公司；木瓜蛋白酶（8×105U/g，CAS：9001-7 3-1，生物試劑）、酸性蛋白酶（5×1 05U/g，C A S：9 0 0 1-7 5-6，生物試劑）、風(fēng)味蛋白酶（2×104U/g，生物試劑） 廣州市齊云生物技術(shù)公司；胰蛋白酶（2.5×105U/g，CAS：9002-07-3，生物試劑）、復(fù)合蛋白酶（1.2×105U/g，生物試劑） 廣州菲博生物科技公司；枯草蛋白酶（1.1×105U/g，食品級(jí)） 無(wú)錫市雪梅酶制劑科技有限公司；DPPH（CAS：1898-66-4，分析純） 美國(guó)Sigma公司；甲醛以及其他試劑（均為分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DS-1高速組織搗碎機(jī) 上海標(biāo)本模型廠；DK-S24型恒溫水浴鍋 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司；3K30型高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司；MAS-Ⅱ 微波儀 上海新儀微波化學(xué)科技有限公司；Kjeltel2300凱氏定氮儀 丹麥FOSS儀器有限公司；Delta320精密pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Akku-drive電子滴定儀 德國(guó)赫施曼公司；SUNRISE酶標(biāo)儀 奧地利Tecan公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

將合浦珠母貝去殼和臟器，然后直接用組織搗碎機(jī)將貝肉絞碎待用。

1.3.2 常規(guī)水解合浦珠母貝蛋白

稱(chēng)取貝肉12 g若干份，每個(gè)樣品以料液比3：2（g/mL）加0.2 mol/L磷酸緩沖溶液（pH 7.0）8 mL，再按照4 000 U/g加酶量加入Alcalase 2.4L蛋白酶，混勻后置于60 ℃水浴鍋。依次水浴1、2、3、4 h和5 h取出樣品[14]，在100 ℃條件下滅酶10 min，10 000 r/min 離心10 min，取上清液測(cè)定其游離氨態(tài)氮含量和DPPH自由基清除率。

1.3.3 微波輻射輔助蛋白酶水解合浦珠母貝蛋白

對(duì)處理過(guò)的樣品采用微波儀微波輔助酶解，在設(shè)定功率條件下達(dá)到設(shè)定的溫度后，會(huì)自動(dòng)以最低功率100 W保持樣品的溫度。其他按照以下條件處理：稱(chēng)取經(jīng)前處理的貝肉12 g，料液比3：2（g/mL）加0.2 mol/L 磷酸緩沖液（pH 7.0），加酶量4 000 U/g、微波功率300 W，在60 ℃條件下微波10 min后，取出繼續(xù)在60 ℃條件下水浴1.5 h，再經(jīng)滅酶，離心，測(cè)定其水解度（degree of hydrolysis，DH）和DPPH自由基清除率。以此條件為基準(zhǔn)，對(duì)比先加酶后微波水浴與先微波后加酶水浴的效果，再選擇最佳作用酶，并考察料液比、加酶量（E/S）、微波溫度、微波功率以及時(shí)間和后續(xù)水浴時(shí)間等單因素的影響，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)建立數(shù)學(xué)模型，以DH和DPPH自由基清除率作為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面分析，確定微波輔助酶解的工藝條件。

1.3.3.1 酶的選擇

將Alcalase 2.4L蛋白酶（pH 7.0，60 ℃）、木瓜蛋白酶（pH 6.5，60 ℃）、胰蛋白酶（pH 8.0，40 ℃）、酸性蛋白酶（pH 3.0，50 ℃）、枯草蛋白酶（pH 8.0，50 ℃）、風(fēng)味蛋白酶（pH 7.0，50 ℃）和復(fù)合蛋白酶（pH 6.5，50 ℃）編號(hào)為1～7，從中選擇最佳微波輔助酶解的酶類(lèi)，根據(jù)其各自的最佳pH值和溫度結(jié)合以上基準(zhǔn)條件處理樣品，并測(cè)定其游離氨態(tài)氮含量和DPPH自由基清除率。

1.3.3.2 酶解工藝條件對(duì)微波輔助酶解的影響

其他條件同1.3.3.1節(jié)，設(shè)置料液比3：1、3：2、1：1、2：3和1：3（保持系列料液總量不變來(lái)稱(chēng)取樣品的質(zhì)量）；加酶量2 000、4 000、8 000、12 000、16 000、20 000 U/g；微波溫度30、40、50、60、70 ℃；微波功率200、300、400、600、800、900 W；微波處理時(shí)間1、3、5、10、15、30、45、60 min；水浴時(shí)間0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，考察酶解工藝條件對(duì)微波輔助酶解的影響，選擇最優(yōu)比例，測(cè)定其游離氨態(tài)氮含量和DPPH自由基清除率。

以上實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，用到微波處理中的樣品量較小時(shí)會(huì)造成較大的實(shí)驗(yàn)處理誤差，推測(cè)是微波爐腔內(nèi)微波處理分布不均勻，那么平行組在相同的設(shè)定條件下頁(yè)會(huì)有相對(duì)較大的誤差，所以，為了減小實(shí)驗(yàn)中不穩(wěn)定性因素的影響和減小實(shí)驗(yàn)誤差，在處理過(guò)程中加有500 mL去離子水的玻璃容器于微波腔中，每次將處理組放在玻璃容器的水中處理。

1.3.3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

考慮微波處理對(duì)酶的影響，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇微波溫度、微波功率、微波時(shí)間以及加酶量4 個(gè)因素作為響應(yīng)變量，其編碼為A、B、C和D。利用Design Expert v 8.0.6.1軟件按照Box-Behnken原理進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)，優(yōu)化微波輔助蛋白酶水解合浦珠母貝肉工藝。各試驗(yàn)組的編碼與水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table1 Variables and levels in the three-level, four-variable Box-Behnken experimental design

1.3.4 指標(biāo)測(cè)定

樣品總氮含量測(cè)定參照凱氏定氮法[15]，氨基態(tài)氮含量測(cè)定參照甲醛-電位滴定法[16]。DH[17-18]按式（1）計(jì)算。

式中：N1為水解液中氨基氮含量；N2為原料中粗蛋白氮含量。

抗氧化活性測(cè)定：以對(duì)DPPH自由基的清除能力驗(yàn)證酶解液的抗氧化活性狀況，參考文獻(xiàn)[19-20]，并稍作修改，具體如下：取1 mL樣品酶解液于10 mL的離心管，再依次加入1 mL去離子水，1 mL DPPH溶液（2×10-4mol/L，DPPH溶于無(wú)水乙醇），混勻后在室溫條件下避光反應(yīng)20 min，10 000 r/min離心10 min，于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度Ai，實(shí)驗(yàn)空白組為1 mL無(wú)水乙醇代替DPPH自由基溶液加入1 mL去離子水測(cè)定吸光度為Aj，對(duì)照組為1 mL去離子水代替1 mL樣品在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A0，并以等體積去離子水和無(wú)水乙醇混合液空白調(diào)零，DPPH自由基清除率按公式（2）計(jì)算。

式中：A0為對(duì)照組吸光度；Ai為樣品組吸光度；Aj為空白組吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 水浴與微波酶解合浦珠母貝蛋白效果

為了表征微波輔助酶解處理合浦珠母貝肉的效果，設(shè)立了不同的處理組，先加酶后微波10 min，再水浴酶解1.5 h和微波10 min，再加酶水浴酶解1.5 h，討論微波輔助酶解的功效大小。各組處理樣品經(jīng)過(guò)滅酶離心后，取上清液，測(cè)定其游離氨態(tài)氮含量和DPPH自由基清除率，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 微波輔助酶解和水浴酶解處理組的游離氨態(tài)氮含量和DPPH自由基清除率結(jié)果Table2 Effect of enzymatic hydrolysis alone or sequentially combined with microwave treatment on free ammonia nitrogen content and DPPH radical scavenging rate

2.2 酶的選擇

圖1為微波輔助7 種酶處理合浦珠母貝肉的游離氨態(tài)氮含量和DPPH自由基清除率結(jié)果，不同的酶以料液比3：2在各自最適的pH值環(huán)境和微波處理溫度中作用于底物，微波處理10 min后，水浴1.5 h。不同的酶受微波條件的影響大小也不同[21]，由圖1可見(jiàn)，DPPH自由基清除率較高的是木瓜蛋白酶＞Alcalase 2.4L＞復(fù)合蛋白酶，水解度較好的是枯草蛋白酶＞風(fēng)味蛋白酶＞Alcalase 2.4L，綜合考慮游離氨態(tài)氮含量和DPPH自由基清除率，保證水解度和活性較高，1號(hào)酶分別達(dá)到3.488 6 mg/g貝肉和81.303%，即Alcalase 2.4L蛋白酶效果最佳，因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇該酶進(jìn)行微波處理。

圖1 7種不同的酶對(duì)合浦珠母貝肉微波輔助酶解的效果Fig.1 Effect of different enzymes on the hydrolysis of Pinctada martensii muscle proteins

2.3 單因素試驗(yàn)

2.3.1 料液比對(duì)微波輔助酶解的影響

圖2 料液比對(duì)微波輔助酶解的影響Fig.2 Effect of material/liquid ratio on the microwave-assisted enzymolysis of Pinctada martensii muscle proteins

由圖2可知，處理樣品時(shí)通過(guò)維持料液總量不變來(lái)稱(chēng)取各組的樣品量，以減小實(shí)驗(yàn)誤差。隨著貝肉比例的減少，DPPH自由基清除率逐漸降低，而游離氨態(tài)氮的含量在3：2時(shí)最高為3.535 mg/g貝肉。綜合考慮活性和水解量，料液比為3：2的處理結(jié)果較好。

2.3.2 加酶量對(duì)微波輔助酶解的影響

由圖3可知，不同加酶量對(duì)微波處理的影響較大，加酶量為4 000～8 000 U/g范圍時(shí)[22]，無(wú)論是DPPH自由基清除率還是游離氨態(tài)氮的含量都明顯高于其他的酶加量的結(jié)果，最高為4.248 mg/g貝肉和80.505%。說(shuō)明酶與底物的平衡結(jié)合量在這個(gè)范圍內(nèi)，可以使酶解達(dá)到最佳狀態(tài)。

圖3 加酶量對(duì)微波輔助酶解的影響Fig.3 Effect of E/S ratio on the hydrolysis of Pinctada martensii muscle proteins

2.3.3 微波溫度對(duì)微波輔助酶解的影響

圖4 微波溫度對(duì)微波輔助酶解的影響Fig.4 Effect of microwave temperature on the hydrolysis of Pinctada martensii muscle proteins

由圖4可見(jiàn)，樣品在50～60 ℃條件下微波10 min后水浴1.5 h的處理樣液，其DPPH自由基清除率還是游離氨態(tài)氮的含量都較高，因此在此范圍內(nèi)可以有效同時(shí)保證高水解度和活性。

2.3.4 微波功率對(duì)微波輔助酶解的影響

圖5 微波功率對(duì)微波輔助酶解的影響Fig.5 Effects of microwave power on the hydrolysis of Pinctada martensii muscle proteins

從圖5可知，隨著微波功率加大，DPPH自由基清除率還是游離氨態(tài)氮的含量總體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。酶自身結(jié)果和活力在不同的微波功率下會(huì)受到一定的影響，目前的機(jī)理雖然尚不明確，但一致認(rèn)為較大的功率會(huì)破壞酶活力。所以需要在較低的功率條件下找到快速處理的平衡點(diǎn)[23-24]。綜合實(shí)驗(yàn)對(duì)水解度和DPPH自由基清除率的要求，微波功率300 W左右處理樣品較好，分別達(dá)到3.55 mg/g貝肉和83.811%。

2.3.5 微波處理時(shí)間對(duì)微波輔助酶解的影響

圖6 微波時(shí)間對(duì)微波輔助酶解的影響Fig.6 Effect of microwave time on the hydrolysis of Pinctada martensii muscle proteins

根據(jù)已選擇較好的微波功率，在此條件下加熱處理樣品時(shí)間過(guò)長(zhǎng)也會(huì)影響酶的活力情況[25-26]。由圖6可知，隨著微波處理時(shí)間延長(zhǎng)，DPPH自由基清除率在10～45 min內(nèi)較高。而游離氨態(tài)氮的含量大體呈遞增趨勢(shì)，30 min后曲線變的平緩，可能是酶的活性位點(diǎn)長(zhǎng)時(shí)間在微波作用下被破壞，造成酶活性下降的緣故。

2.3.6 水浴處理時(shí)間對(duì)微波輔助酶解的影響

由于微波對(duì)酶也存在一定的負(fù)面影響，應(yīng)該選擇在能夠保證較高的水解度和活性條件下，可以快速達(dá)到處理要求作用于樣品，后續(xù)需要結(jié)合水浴，達(dá)到總體過(guò)程時(shí)間低于全水浴的處理結(jié)果。圖7為微波處理后不同水浴時(shí)間的影響，隨著水浴時(shí)間延長(zhǎng)，游離氨態(tài)氮的含量也隨之增加，而DPPH自由基清除率在1.5～2 h表現(xiàn)較突出，本著節(jié)省能源縮短處理時(shí)間的目的，實(shí)驗(yàn)選擇1.5 h水浴時(shí)間較佳。

圖7 水浴時(shí)間對(duì)微波輔助酶解的影響Fig.7 Effect of subsequent water-bath heating time on on the hydrolysis of Pinctada martensii muscle proteins

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.4.1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)和顯著性分析

運(yùn)用Design Expert v 8.0.6.1軟件使用編碼單位對(duì)試驗(yàn)進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)設(shè)計(jì)，見(jiàn)表3，優(yōu)化試驗(yàn)綜合考慮酶解液的高DH和DPPH自由基清除率，設(shè)立以DH×DPPH自由基清除率為響應(yīng)值，試驗(yàn)共29 組，其中包含24 個(gè)析因點(diǎn)和5 個(gè)零點(diǎn)，5 次零點(diǎn)試驗(yàn)做誤差估計(jì)。數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，回歸方程的方差分析、各項(xiàng)的方差分析和參數(shù)估計(jì)及顯著性分析的主要結(jié)果歸納分別見(jiàn)表4。

表3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table3 Arrangement and results of the three-level, four-variable Box-Behnken experimental design

利用軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合微波輔助酶解合浦珠母貝蛋白方程如下：

響應(yīng)值= 0.22＋2.683×10-3A-0.017B＋4.450×10-3C ＋0.025D＋4.325×10-3AB-3.850×10-3AC-0.012AD＋3.650×10-3BC - 0.013BD - 6.300×10-3CD - 0.061A2-0.038B2- 0.020C2- 0.026D2

如表4所示，二次多元回歸擬合方程的方差分析，B、D、A2、B2和D2項(xiàng)為極顯著影響因素，其中AD項(xiàng)和BD項(xiàng)交互影響顯著，其他項(xiàng)不顯著，說(shuō)明各項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值的影響并非線性關(guān)系。整體二次多元擬合的模型的校正決定系數(shù)R2Adj= 93.02%，P＜0.000 1，表明試驗(yàn)所選用的二次項(xiàng)模型具有極顯著性。失擬項(xiàng)P=0.181 8＞0.05，差異不顯著說(shuō)明殘差均是由隨機(jī)誤差引起的，而R2=96.51%說(shuō)明響應(yīng)值有96.51%取決于所選的因素變量。所以用此模型可以較好地預(yù)測(cè)和優(yōu)化微波輔助酶解合浦珠母貝蛋白。

表4 回歸方程的方差分析Table4 Analysis of variance for the regression equation

2.4.2 響應(yīng)面結(jié)果分析

圖8 兩兩交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響Fig.8 Interactive effects of experimental conditions on the hydrolysis of Pinctada martensii muscle proteins

由圖8等高線可以看出，各因素間的交互影響較好，基本呈現(xiàn)橢圓形。圖8b固定微波溫度，改變微波時(shí)間，其響應(yīng)值變化較小，呈平緩的弧線，說(shuō)明微波時(shí)間影響不及微波溫度影響大。圖8e和8f中，各自固定微波功率和時(shí)間，響應(yīng)值隨著加酶量的增大而增大，起初變化較大，但后面變化平緩甚至有些許滑低，可能是底物已被飽和催化的緣故。

對(duì)模型發(fā)成求導(dǎo)得出最優(yōu)條件為A=58.31、B=272.65、C=17.22、D=5 016.84，即微波溫度58.31 ℃、微波功率272.65 W、微波時(shí)間17.22 min、加酶量5 016.84 U/g，此時(shí)預(yù)測(cè)的響應(yīng)值為0.224 4，DH為26.15%。

2.5 模型驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)及活性測(cè)定

為了進(jìn)一步檢驗(yàn)響應(yīng)面優(yōu)化條件的可靠性，結(jié)合實(shí)際操作，將實(shí)驗(yàn)條件A、B、C和D修正為58 ℃、300 W、17 min和5 000 U/g進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到DH為（25.04±0.46）%，響應(yīng)值為0.217 3±0.070 0。

3 結(jié) 論

3.1 本實(shí)驗(yàn)采用微波輔助酶解合浦珠母貝肉有效可行，通過(guò)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)證明微波能夠促進(jìn)貝肉水解，節(jié)省資源和時(shí)間，按照優(yōu)化條件進(jìn)行酶解的結(jié)果相當(dāng)于常規(guī)水浴3 h（水解度（22.74±0.08）%）與4 h（水解度（26.95±0.03）%）之間，于是微波輔助酶解可以將水浴酶解時(shí)間縮短約一半。

3.2 實(shí)驗(yàn)中對(duì)比了加酶和不加酶以及先加酶和后加酶微波處理的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)微波前加酶較好，說(shuō)明微波在一定程度上也是可以促進(jìn)酶的作用。

3.3 響應(yīng)優(yōu)化的二次多元擬合度較好，對(duì)各因素的影響進(jìn)行顯著性分析，并優(yōu)化出的最佳工藝條件為微波溫度58 ℃、微波功率300 W、微波時(shí)間17 min、加酶量5 000 U/g，后續(xù)在58 ℃條件下再水浴1.5 h。在此條件下酶解合浦珠母貝肉能夠在一定程度上為工業(yè)化提供方向，并為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究提供一定的參考依據(jù)。

[1] 郝記明, 章超樺, 郭順堂. 酶解制備馬氏珠母貝肉ACEIP的工藝研究[J].食品科學(xué), 2007, 28(5): 128-131.

[2] 刁石強(qiáng), 李來(lái)好, 陳培基, 等. 馬氏珠母貝肉營(yíng)養(yǎng)成分分析及評(píng)價(jià)[J].浙江海洋學(xué)院學(xué)報(bào), 2000, 19(l): 42-46.

[3] 吳燕燕, 李來(lái)好, 楊賢慶, 等. 柵欄技術(shù)優(yōu)化即食調(diào)味珍珠貝肉工藝的研究[J]. 南方水產(chǎn), 2008, 4(6): 56-62.

[4] 胡雪瓊, 周盛華, 夏杏洲, 等. 馬氏珠母貝肉酶解產(chǎn)物清除自由基活性的研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2009, 30(5): 97-99.

[5] WU Yanyan, TIAN Qian, LI Laihao, et al. Inhibitory effect of antioxidant peptides derived from Pinctada fucata protein on ultraviolet-induced photoaging in mice[J]. Journal of Functional Foods, 2013, 5(2): 527-538.

[6] 吳燕燕, 田倩, 尚軍, 等. 合浦珠母貝抗氧化肽的性質(zhì)及應(yīng)用研究[J].食品工業(yè)科技, 2011, 32(11): 123-126; 130.

[7] 田倩, 吳燕燕, 李來(lái)好, 等. 合浦珠母貝肉酶解液中抗氧化肽的分離及活性研究[J]. 食品科學(xué), 2011, 32(增刊1): 144-148.

[8] WU Yanyan, LI Laihao, DUAN Zhenhua, et al. Application of response surface methodology to optimise preparation high antioxidantactivity product from pinctada fucata muscle[J]. Advanced Materials Research, 2012, 396-398: 1341-1348.

[9] 尚軍, 李來(lái)好, 吳燕燕, 等.響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助蛋白酶水解合浦珠母貝肉的條件研究[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(18): 44-49.

[10] 吳燕燕, 尚軍, 李來(lái)好, 等. 合浦珠母貝肉短肽的分離及其抗氧化活性研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2012, 33(7): 123-126.

[11] 左繼紅. 微波輔助蛋白酶水解反應(yīng)工藝和反應(yīng)器的研究[D]. 無(wú)錫:江南大學(xué), 2008.

[12] 曹光輝, 黃誠(chéng), 尹紅, 等. 微波輔助酶法水解草魚(yú)魚(yú)鱗的工藝條件[J].吉首大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2010(2): 101-104.

[13] 曹川, 包建強(qiáng). 響應(yīng)面法優(yōu)化微波輔助提取貽貝蛋白的工藝研究[J].食品工業(yè)科技, 2012, 33(5): 258-261.

[14] 尚軍. 合浦珠母貝肉寡肽的制備及其抗氧化活性研究[D]. 湛江: 廣東海洋大學(xué), 2010.

[15] GB 5009.5—2010 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定[S].

[16] ZBX 66038—1987 氨基態(tài)氮測(cè)定法[S].

[17] NIELSEN P M, PETERSEN D, DARNBMANN C. Improved method for determining food protein degree of hydrolysis[J]. Journal Food Science, 2001, 66(5): 642-646.

[18] 敬思群, 熱那汗·買(mǎi)買(mǎi)提, 蘭雁. 加酶超聲提取核桃抗氧化肽工藝優(yōu)化[J]. 食品工業(yè)科技, 2012, 37(3): 94-98.

[19] WU Huichun, CHEN Huaming, SHIAU C Y. Free amino acids and peptides related to antioxidant properties in protein hydrolysates of mackerel (Scomber austriasicus)[J]. Food Research International, 2003, 36(9/10): 949-957.

[20] RAJAPAKSE N, MENDIS E, JUNG W K, et al. Purification of a radical scavenging peptide from fermented mussel sauce and its antioxidant properties[J]. Food Research International, 2005, 38: 175-182.

[21] IZQUIERDO F J, PE?AS E, BAEZA M L, et al. Effects of combined microwave and enzymatic treatments on the hydrolysis and immunoreactivity of dairy whey proteins[J]. International Dairy Journal, 2008, 18(9): 918-922.

[22] LIU D, LI X N, QIN Z J, et al. Study on the processing technique of enzyme hydrolysis Eupolyphaga sinensis peptide and innunoregulatory effect[J]. Journal of Chinese Medicinal Materials, 2012, 35(9): 1382-1385.

[23] 曹光輝, 黃誠(chéng), 尹紅. 微波輔助酶法水解草魚(yú)魚(yú)鱗的工藝條件[J]. 吉首大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2010, 31(2): 101-104.

[24] IZQUIERDO F J, PE?AS E, BAEZA M L, et al. Effects of high pressure and microwave on pronase and α-chymotrypsin hydrolysis of β-lactoglobulin[J]. Food Chemistry, 2005, 92: 713-719.

[25] 李磊, 陳均志, 張海平. 微波復(fù)合酶水解植物蛋白制取小分子多肽的研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2007, 35(19): 5655- 5656; 5660.

[26] IZQUIERDO F J, PE?AS E, BAEZA M L, et al. Microwave-assisted digestion of β-lactoglobulin by pronase, α-chymotrypsin and pepsin[J]. International Dairy Journal, 2007, 17: 465-470.

Optimization of Conditions for Microwave-Assisted Enzymolysis of Pinctada martensii Muscle Proteins Using Response Surface Methodology

WANG Jing1,2, WU Yan-yan1,*, LI Lai-hao1, YANG Xian-qing1
(1. Key Laboratory of Aquatic Product Processing, Ministry of Agriculture, South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 510300, China; 2. College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

The microwave-assisted enzymatic hydrolysis of Pinctada martensii muscle proteins was optimized by response surface methodology. Alcalase 2.4L was chosen as the best enzyme to hydrolyze Pinctada martensii muscle proteins based on free ammonia nitrogen content and DPPH radical scavenging activity of hydrolsates. The levels of operating parameters such as substrate concentration, E/S ratio, solvent temperature, microwave power, radiation time and water bath heating time were established by single-factor experiments for response surface Box-Behnken design. Based on the mathematical product of degree of hydrolysis (DH) and DPPH radical scavenging rate, the optimal hydrolysis conditions were determined as a solvent temperature of 58 ℃, microwave treatment at 300 W for 17 min after addition of 5 000 U/g Alcalase 2.4L, and subsequent water bath heating at 58 ℃ for 1.5 h. Under these conditions, the maximum predicted DH was 26.15%, which was multiplied by DPPH radical scavenging rate to obtain 0.224 4. The small difference from the actual values observed in verification experiments suggested a high degree of fitting.

Pinctada martensii muscle proteins; microwave-assisted enzymolysis; antioxidant activity; response surface methodology

TS254.9

A

1002-6630（2014）10-0011-07

10.7506/spkx1002-6630-201410003

2013-07-03

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAD28B05）；海南省重點(diǎn)科技項(xiàng)目（ZDXM20100005）；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2011B031200009）；國(guó)家海洋局海洋公益性行業(yè)科研專(zhuān)項(xiàng)（2013418018）

王晶（1987—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)楹Ｑ螽a(chǎn)物資源利用。E-mail：wjing8816@163.com

*通信作者：吳燕燕（1969—），女，研究員，博士，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品加工與安全控制。E-mail：wuyygd@163.com