李添寶，吳 越，羅 敬

利用核磁共振法定量分析植物油中多種脂肪酸及水含量

李添寶，吳 越，羅 敬

（湖南師范大學化學與化工學院，湖南 長沙 410081）

采用核磁共振波譜分析技術(shù)，歸屬了植物油中亞麻酸、亞油酸、油酸等不飽和脂肪酸甘油酯、飽和脂肪酸甘油酯及水的核磁共振質(zhì)子譜的主要特征峰。在無需預處理條件下，以苯甲酸作為內(nèi)標，對植物油中各種脂肪酸及水進行定量分析，加標回收率可達98%～102%。亞麻酸、亞油酸、油酸、總飽和脂肪酸、水的精密度分別為0.11%、0.12%、0.68%、0.70%、2.65%。該法取樣量少、無需昂貴的標樣，可直接快速定量，結(jié)果準確，可為植物油的質(zhì)量標準研究提供一種簡單可行的新方法。

核磁共振；不飽和脂肪酸；飽和脂肪酸；水

市場上常見的植物油主要是由多種不飽和脂肪酸和飽和脂肪酸混合脂肪酸的甘油酯組成，在測定植物油里各脂肪酸含量的方法中，最常用的方法有氣相色譜法[1-4]，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[5-8]，但這些方法存在許多問題，比如：測定之前繁瑣的甲酯化預處理，長鏈碳的酯不容易氣化，不飽和脂肪酸酯的熱不穩(wěn)定性，繪制標準曲線的復雜，標準樣品的昂貴等，這些都造成了在檢測食用油中脂肪酸時步驟繁多，樣品用量大，耗時長，結(jié)果也不一定準確。

目前，利用核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）定量分析植物油中亞麻酸、亞油酸、油酸等不飽和脂肪酸、總飽和脂肪酸以及水含量的方法研究很少[9-15]。本實驗通過核磁共振技術(shù)，在對原料無需任何預處理的情況下，通過分析各種植物油的1H-NMR譜，歸屬了植物油中亞麻酸、亞油酸、油酸等不飽和脂肪酸、飽和脂肪酸以及水等的質(zhì)子特征峰，并且以苯甲酸為內(nèi)標，測定了以上各種物質(zhì)的含量及方法的精密度，通過加標回收率驗證方法的準確性。同時增加對比實驗，利用氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用儀檢測各種植物油，通過面積歸一化法測出各植物油中亞麻酸、亞油酸、油酸和飽和脂肪酸的含量，也驗證了該方法準確可靠。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

9 種常見植物油（紫蘇籽油、芝麻油、大豆油、菜籽油、橄欖油、玉米油、花生油、茶油、葵花籽油）、氘代氯仿 青島騰龍微波科技有限公司；苯甲酸 成都化學試劑廠；油酸甲酯 美國Sigma公司；無水乙醇、甲醇、苯（均為分析純） 湖南師范大學化學試劑廠；無水Na2SO4（分析純） 上海山浦化工有限公司；石油醚（60～90 ℃、分析純）、KOH（分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；NaHSO4（自制）。

1.2 儀器與設(shè)備

AVANCE 500 MHz超導傅里葉變換核磁共振儀 瑞士Brüker公司；5 mm核磁共振樣品管、電子分析天平、GC/MS-QP2010氣質(zhì)聯(lián)用儀 日本島津公司；電熱干燥箱 武漢市無線電元件廠；恒溫磁力攪拌器 上海司樂儀器有限公司；電子調(diào)溫電熱套 天津市泰斯特儀器有限公司；自動雙重純水蒸餾器 上海亞太技術(shù)玻璃公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的1H-NMR測定

由于市場上無法購買到純的三亞麻酸甘油酯、三亞油酸甘油酯、三油酸甘油酯標準樣品，但亞麻酸甲酯、亞油酸甲酯和油酸甲酯與其對應的脂肪酸甘油酯化學位移基本相同，故實驗選取了油酸甲酯標樣、以及自制的亞油酸甲酯和亞麻酸甲酯樣品對各種不飽和脂肪酸甘油酯的質(zhì)子峰進行了歸屬。

稱取約70 mg植物油至5 mm的核磁共振樣品管中，再加入約0.6 mL氘代氯仿，用于繪制植物油的核磁譜圖。

將制好的樣品充分振搖，每次測定都進行調(diào)諧、勻場；測定條件控制在：溫度297.3 K；500 MHz核磁共振儀的頻率500.13 MHz；氫譜譜寬10 330.578 Hz；掃描16 次；空掃2 次；每個核磁樣品管測量6 次；譜圖處理時以四甲基硅烷定位。

1.3.2 各種脂肪酸及水的含量測定

分別稱取約70 mg 9 種植物油，分別添加約18 mg苯甲酸，充分搖勻后待測。

1.3.3 回收率測定

實驗采用油酸甲酯標準品作為內(nèi)標的添加物來測定方法的回收率。

選取其中1 種食用油（大豆油），稱取約70 mg，添加約28～78 mg油酸甲酯標準樣品，約18 mg苯甲酸作為內(nèi)標，充分搖勻后待測。

1.3.4 精密度測定

選取其中1 種食用油（大豆油），稱取約70 mg，添加約18 mg苯甲酸，充分搖勻后測量6 次。

1.3.5 利用GC-MS測定植物油中各種脂肪酸的含量

取食用油10 g于平底燒瓶中，加入0.4 mol/L KOHCH3OH溶液；于60 ℃恒溫磁力攪拌器中攪拌回流1 h，至溶液澄清；待冷卻到室溫后加入NaHSO4溶液，調(diào)至pH值為2～3；溶液分層，用分液漏斗分出上層油相。

將上層油相物轉(zhuǎn)移到三頸燒瓶中，加入2 g NaHSO4固體，少量水將其溶解，2 mL苯，20 mL甲醇；三頸瓶口分別裝上溫度計、分水器，磨口塞；然后將三頸瓶放置恒溫磁力攪拌器上加熱攪拌，保持反應物微沸，加熱回流1 h，直到分水器中水液面不再上升即可；將生成物冷卻至室溫后轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，蒸餾水洗滌5～6 次，石油醚萃取上層油相，用無水Na2SO4干燥，過濾后放入烘箱中烘干溶劑，得到混合脂肪酸甲酯；最后進行GC-MS檢測得到總離子流圖。

色譜柱：Rtx-wax 彈性石英毛細管柱；升溫程序：柱溫100 ℃；進樣口溫度250 ℃；初始溫度100 ℃保持1min，以15 ℃/min升到175 ℃保持12 min；再以2 ℃/min升到245 ℃保持2 min；離子源溫度250 ℃；進樣量0.5 μL；不分流；柱前壓67.9 kPa；質(zhì)量掃描范圍33～500 u；溶劑延遲時間3.5 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 脂肪酸甘油酯1H-NMR譜特征峰的確認

植物油中不飽和脂肪酸甘油酯主要成分為亞麻酸、亞油酸、油酸和飽和脂肪酸混合脂肪酸的甘油酯，對應結(jié)構(gòu)和化學位移（圖1）。

圖1 脂肪酸甘油酯結(jié)構(gòu)及化學位移Fig.1 Structures and chemical shifts of fatty acids

其中脂肪酸部分按照從左到右依次給氫原子號為1～8，化學位移相同的H編號一致，由于1 mol甘油醇只能結(jié)合3 mol脂肪酸，故圖中總飽和脂肪酸結(jié)構(gòu)未畫出，但其化學位移類似，只有2.25、1.60、1.29、0.854組峰。以紫蘇籽油為例，來確認其1H-NMR譜中各脂肪酸的特征峰（圖2）。

圖2 紫蘇籽油的1H--NMR譜Fig.21H-NMR spectrum of perilla seed oil

紫蘇籽油中從高場到低場分別為：δ=5.32歸屬為所有脂肪酸中雙鍵上的5號H；δ=5.30為甘油醇上次甲基的H；δ=4.29和δ=4.14歸屬為甘油醇上亞甲基的2 個H；δ=2.78歸屬為亞油酸和亞麻酸上位于2 個—C=C雙鍵之間的亞甲基6號H；δ=2.25歸屬為和—C=O直接相連的亞甲基上的1號H；δ=2.02歸屬為與—C=C雙鍵相鄰的亞甲基上的4號H；δ=1.60歸屬為與—C=O相隔一個—CH2的亞甲基上的2號H，其油中微量水的質(zhì)子峰也在該處；δ=1.29為—CH2上的3號H；因為受到雙鍵個數(shù)的影響，δ=0.96歸屬為亞麻酸末端—CH3上的7 H，而δ=0.85為其余的脂肪酸末端—CH3上的8號H[16]。

芝麻油、大豆油、菜籽油、橄欖油、玉米油、花生油、茶油、葵花籽油1H-NMR圖譜見圖3。

圖3 8 種植物油的1H--NMR譜Fig.31H-NMR spectra of eight kinds of vegetable oils

2.2 脂肪酸及水含量的計算

利用吸收峰面積與氫質(zhì)子數(shù)成正比，通過加入苯甲酸作為內(nèi)標能準確算出亞麻酸、亞油酸、油酸、飽和脂肪酸及水的含量。根據(jù)上述對各質(zhì)子峰的歸屬，可以看出δ=0.96的7號H的為亞麻酸末端—CH3的特征峰；δ=2.78的6號H包含了亞油酸和亞麻酸；δ=5.32的5號H包含了油酸、亞油酸和亞麻酸。

按公式（1）計算亞麻酸的峰面積：

按公式（2）計算亞油酸的峰面積：

按公式（3）計算油酸的峰面積：

按公式（4）計算所含水的峰面積：δ=1.60的峰面積為6 個2號H的面積和微量水的氫的面積之和，所以總面積減去6后，剩下的為水的峰面積。

式中：mS為樣品質(zhì)量/g；AS為樣品質(zhì)子吸收峰面積；nS為樣品吸收峰所包含質(zhì)子數(shù)；mR為內(nèi)標物質(zhì)量/g；AR內(nèi)標物吸收峰面積；nR為內(nèi)標物吸收峰所包含質(zhì)子數(shù)；MS為樣品摩爾質(zhì)量/（g/mol）；MR為內(nèi)標物摩爾質(zhì)量/（g/mol）；S為脂肪酸；R為苯甲酸。

按公式（8）、（9）計算各種植物油中各脂肪酸及水的含量：

根據(jù)上述計算方法，分別計算出各種植物油中各脂肪酸及水的含量，結(jié)果見表1。

表1 植物油中各種脂肪酸及水的含量Table 1 Contents of fatty acids and water in vegetable oils %

從表1得到，在常見的植物油里紫蘇籽油中亞麻酸和飽和脂肪酸含量最高，葵花籽油中亞油酸最高，茶油中油酸含量最高，其中大豆油中水的含量最高。

2.3 回收率

稱取大豆油約70 mg，分別添加28.2、62.4、77.5 mg油酸甲酯標準樣品，約18 mg苯甲酸作為內(nèi)標，充分搖勻后測定，通過計算油酸甲酯的量與實際添加的量進行比較，得出回收率，結(jié)果見表2。

表2 回收率實驗結(jié)果Table 2 Results of recovery tests

3 次測得的回收率分別為98.26%、101.81%、98.23%，回收率較高，表明該方法能夠準確地測量出樣品的含量，結(jié)果可靠。

2.4 精密度

表3 精密度計算結(jié)果Table 3 Results of precision tests

由表3可以得出，各種脂肪酸和水含量的精密度均小于3%，說明該方法的重復性和準確度較好。

2.5 GC-MS檢測各種植物油脂肪酸的含量

為了進一步驗證上述核磁方法的準確性，本實驗還利用GC-MS手段，通過面積歸一化法對各種植物油中的飽和與不飽和脂肪酸的含量進行了檢測，結(jié)果見表4。

表4 植物油中各種脂肪酸的含量Table 4 Contents of fatty acids in vegetable oils %

從表4可以看出，采用GC-MS手段通過面積歸一化法得到的各種脂肪酸含量與表2中核磁結(jié)果相差不大，說明利用核磁共振儀加入內(nèi)標的方法檢測植物油中亞麻酸甘油酯、亞油酸甘油酯、油酸甘油酯和飽和脂肪酸甘油酯的含量結(jié)果可靠。

3 結(jié) 論

核磁共振法測定植物油中脂肪酸含量的方法不僅避免了傳統(tǒng)氣相色譜檢測法中繁瑣的前處理和色譜條件的摸索，且在定量分析中可以快速計算出其中各種脂肪酸和水的含量[17-20]。其中的回收率和精密度都在允許范圍內(nèi)，為研究脂肪酸含量的測定提供了有效可靠的新方法。

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Quantitative Analysis of Fatty Acids and Water in Vegetable Oils by Nuclear Magnetic Resonance

LI Tian-bao, WU Yue, LUO Jing
(College of Chemistry and Chemical Engineering, Hunan Normal Uinversity, Changsha 410081, China)

The main characteristic peaks of linolenic, linoleic, oleic acid, saturated fatty acids and water in vegetable oils were analyzed by1H-NMR spectroscopy. Benzoic acid was selected as an internal standard to quantify the contents of linolenic, linoleic, oleic acid, saturated fatty acids and water in vegetable oils by this method without any pretreatment. The recoveries were 98%-102% with RSD of 0.11%, 0.12%, 0.68%, 0.70% and 2.65% for linolenic, linoleic, oleic acid, total saturated fatty acids and water, respectively. The contents of linolenic, linoleic, oleic acid, total saturated fatty acids and water can be determined directly and accurately with less sample consumption and without using expensive standards. This new method is simple and applicable for studying quality standards for vegetable oils.

nuclear magnetic resonance (NMR); unsaturated fatty acid; saturated fatty acids; water

O65

A

1002-6630（2014）16-0212-05

10.7506/spkx1002-6630-201416041

2013-10-21

李添寶（1965—），男，副教授，博士，研究方向為色譜與波譜分析。E-mail：ltbsir@yahoo.com.cn