古再麗努爾·阿爾肯，劉 然，侯俊峰，艾散江·艾海提，關(guān) 明*

基于高效薄層色譜法的胡麻卵磷脂質(zhì)量分析

古再麗努爾·阿爾肯，劉 然，侯俊峰，艾散江·艾海提，關(guān) 明*

（新疆師范大學化學化工學院，污染監(jiān)測與控制重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830054）

目的：建立胡麻卵磷脂的高效薄層色譜質(zhì)量分析方法。方法：將卵磷脂供試品及磷脂酰膽堿標準品溶于氯仿-甲醇（3∶2，V/V），以氯仿-甲醇-水（65∶25∶4，V/V）為展開系統(tǒng)，考察不同顯色劑、展開系統(tǒng)、點樣量、薄層板、檢視方式、溫度、相對濕度對卵磷脂供試品中不同組分分離的影響，進行高效薄層色譜定性分析；在確定的色譜條件下，將卵磷脂供試品及磷脂酰膽堿標準品進行展開，掃描磷脂酰膽堿峰面積，繪制標準曲線，外標法測定卵磷脂供試品中磷脂酰膽堿的含量。結(jié)果：卵磷脂供試品各組分分離情況良好，適于定性分析；卵磷脂供試品中磷脂酰膽堿的含量為63.33%，板間、板內(nèi)精密度實驗相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）分別為1.82%和3.73%，穩(wěn)定性實驗RSD為1.60%，加標平均回收率為98.5%。結(jié)論：建立的方法快速準確、重復性好，可為卵磷脂質(zhì)量分析提供新的技術(shù)參考。

卵磷脂；高效薄層色譜法；磷脂酰膽堿；質(zhì)量分析

卵磷脂是磷脂類混合物，既能促進膽固醇及脂肪的代謝，又有調(diào)節(jié)高級神經(jīng)組織活動的作用，可用于減肥、護膚及延緩衰老等方面的應(yīng)用。除此外，卵磷脂還可表面活性劑、乳化劑等在食品工業(yè)中用途更為廣泛[1-2]。我國高純度卵磷脂主要依賴大量進口，以高純度藥用卵磷脂研制的抗癌新藥“139”針劑，在國內(nèi)醫(yī)藥行業(yè)市場更是供不應(yīng)求，其開發(fā)是我國醫(yī)藥科技“十五”計劃及2010年發(fā)展規(guī)劃的重要任務(wù)[3]。卵磷脂的質(zhì)量分析方法主要有分光光度法[4-8]、紅外光譜法[9]、薄層色譜法[10-12]、高效液相色譜法[13-19]、高效毛細管電泳法[20]、柱層析法[21]、氧彈燃燒-灰化分光光度法[22]、以及核磁共振光譜法等[23-24]。目前，主要采用薄層色譜法和高效液相色譜法對卵磷脂中的主要成分磷脂酰膽堿（phosphatidyl choline，PC）進行定性定量分析。高效液相色譜法具有快速、自動化等特點，但試劑及色譜柱較為昂貴，實驗成本相對較高；薄層色譜法實驗成本相對較低，分離條件易掌握，而且結(jié)果直觀[10]。

新疆地區(qū)在生產(chǎn)胡麻植物油的同時也生產(chǎn)出了胡麻油腳等副產(chǎn)品，油腳是生產(chǎn)卵磷脂的主要原料，胡麻油腳中PC的含量高，可與大豆油腳相媲美[9]，但缺乏深度開發(fā)與利用。本實驗采用高效薄層色譜法，對從胡麻油腳中制備的卵磷脂進行PC的定性、定量分析，并進行了方法學考察與耐受性實驗，旨在為新疆胡麻資源的綜合利用、胡麻油腳原材料的精深加工及胡麻油腳卵磷脂產(chǎn)品的質(zhì)量分析與控制提供參考依據(jù)，以期提高新疆地區(qū)油脂類食品工業(yè)經(jīng)濟效益。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

胡麻卵磷脂供試品（課題組精制）；甲醇、丙酮、冰醋酸 天津市福晨化學試劑廠；氯仿、無水乙醇天津市富宇精細化工有限公司；三乙胺、硫酸（均為分析純） 西安化學試劑廠；PC標準品（批號P3556，純度≥99%） 美國Sigma公司；磷鉬酸 北京化工廠；碘 西安化學試劑廠；重鉻酸鉀 天津市光復精細化工研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

高效薄層色譜儀（Linomat 5點樣儀、TLC Scanner 3薄層色譜掃描儀、Reprostar 3薄層色譜攝像儀、TLC Plate Heater Ⅲ 薄層板加熱器） 瑞士Camag公司；100 μL微量進樣針、雙槽展開缸（15 cm×10 cm×20 cm）；硅膠G高效板（規(guī)格（長×寬）：20 cm×10 cm；厚度：0.20～0.25 mm） 青島譜科分離材料有限公司；硅膠G板（規(guī)格（長×寬）：20 cm×10 cm；厚度：0.20～0.25 mm） 青島海洋化工廠；硅膠G板（規(guī)格（長×寬）：20 cm×10 cm；厚度：0.20～0.25 mm）、硅膠GF254板（規(guī)格（長×寬）：20 cm×10 cm；厚度：0.20～0.25 mm） 自制。

1.3 方法

1.3.1 標準品溶液的制備

準確稱取PC標準品10 mg，溶于1 mL氯仿-甲醇（3∶2，V/V）中，制得質(zhì)量濃度為10 mg/mL的標準品溶液。

1.3.2 供試品溶液的制備

準確稱取卵磷脂供試品10 mg，溶于1 mL氯仿-甲醇（3∶2，V/V）中，制得質(zhì)量濃度為10 mg/mL的供試品溶液。

1.3.3 薄層色譜條件

采用課題組自制硅膠G板，以氯仿-甲醇-水（65∶25∶4，V/V）為展開系統(tǒng)，室溫、室內(nèi)進行展開，以5%磷鉬酸-乙醇溶液為顯色劑，標準品和供試品的點樣量分別為2 μL和4 μL，可見光下檢視、拍照。含量測定波長為235 nm，狹縫寬度0.8 mm×0.8 mm，采用背景校正，掃描速率25 mm/s。

2 結(jié)果與分析

2.1 薄層色譜條件的確定

2.1.1 展開系統(tǒng)的選擇

吸取標準品2 μL與供試品溶液4 μL，點于同一薄層板上，分別以氯仿-甲醇-水（65∶25∶4，V/V）、氯仿-甲醇-冰醋酸（24∶18∶0.04，V/V）、氯仿-無水乙醇-三乙胺-水（10∶13∶5∶3，V/V）、氯仿-甲醇-冰醋酸-丙酮-水（35∶25∶4∶14∶2，V/V）為展開系統(tǒng)，展開8 cm，取出，晾干，顯色，105 ℃加熱5 min至斑點清晰，可見光下檢視、照相，結(jié)果見圖1。

圖1 不同展開系統(tǒng)的薄層色譜圖Fig.1 Thin-layer chromatogram using different developing systems

由圖1可見，A板中PC斑點清晰、大小適中、無明顯拖尾，與相鄰斑點保持較好的分離度，分離效果較好；B板展開的PC斑點距離下沿較近，除PC斑點外其他斑點顏色較淺，不便于觀察；C板展開顯色后未見PC斑點，不利于分析；D板除PC斑點外其他斑點顏色較淺，不便于觀察。通過觀察PC斑點的分離與拖尾情況，最終確定氯仿-甲醇-水（65∶25∶4，V/V）為最佳展開系統(tǒng)。

2.1.2 顯色劑的選擇

取5 張展開后的薄層板進行顯色，薄層板A放置于充滿飽和碘蒸氣的密閉容器中，其余薄層板分別噴以4%磷鉬酸-乙醇溶液、5%磷鉬酸-乙醇溶液、8%磷鉬酸-乙醇溶液、55%硫酸（含6%重鉻酸鉀）溶液顯色劑后，105 ℃加熱5 min至斑點清晰，可見光下檢視、照相，結(jié)果見圖2。

圖2 不同顯色劑的薄層色譜圖Fig.2 Thin-layer chromatogram using different chromogenic agents

由圖2可見，A板采用碘蒸氣為顯色劑，顯色后斑點呈藍色，但所需顯色時間較長，邊緣模糊，不利于分析；B板采用55%硫酸（含6%重鉻酸鉀）溶液為顯色劑，顯色后斑點呈土黃色，除PC斑點外其他斑點顏色較淺，不便于觀察；C板采用4%磷鉬酸-乙醇溶液為顯色劑，顯色后斑點呈深藍色，除PC斑點外其他斑點顏色較淺，邊緣模糊，不利于分析；D板采用5%磷鉬酸-乙醇溶液為顯色劑，顯色后斑點呈深藍色，且斑點清晰；E板采用8%磷鉬酸-乙醇溶液為顯色劑，顯色后斑點呈深藍色，且斑點較為清晰，與D板效果接近。通過觀察斑點顏色和清晰度，最終確定5%磷鉬酸乙醇溶液為最佳顯色劑。

2.1.3 點樣量的選擇

分別吸取標準品與供試品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 μL點樣于同一薄層板上，展開顯色后，可見光下檢視、照相。結(jié)果表明：點樣量過大時斑點面積過大，顏色過深，拖尾較嚴重；點樣量過小時，斑點顏色過淺，不便于觀察。通過觀察PC斑點的分離與拖尾情況，最終確定標準品和供試品的點樣量分別為2 μL和4 μL。

2.2 耐用性實驗

2.2.1 薄層板的考察

分別吸取標準品2 μL與供試品溶液4 μL，點于不同薄層板上，展開顯色后，可見光下檢視、照相。結(jié)果見圖3。A板為自制硅膠G板，圖中顯示PC斑點清晰、大小適中、無明顯拖尾，與相鄰斑點保持較好的分離度，分離效果較好；B板為青島海洋硅膠G板，硅膠較薄，斑點偏向邊緣，且部分斑點堆積在距離上沿較近處，不利于分析；C板為自制硅膠GF254板，斑點面積較大，距離上沿過近，不利于分析；D板為青島譜科高效板，硅膠較薄，分離效果與A板接近。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在相同的展開系統(tǒng)、顯色劑及點樣量條件下，不同薄層板薄層色譜圖中卵磷脂樣品各組分的斑點均得到較好分離，分離效果接近，表明薄層板對斑點分離影響不大，重復性較好，自制硅膠G板完全可以滿足實驗要求。

圖3 不同薄層板的薄層色譜圖Fig.3 Thin-layer chromatograms using different thin layer plates

2.2.2 檢視方式的考察

分別吸取標準品2 μL與供試品溶液4 μL，點于同一薄層板上，展開顯色后，分別在可見光、紫外光254 nm和366 nm波長處檢視、照相。結(jié)果見圖4。

圖4 不同檢視方式的薄層色譜圖Fig.4 Thin-layer chromatograms observed at different wavelengths

由圖4可見，不同檢視情況下，色譜圖中的斑點呈現(xiàn)未見明顯差別，比較而言，可見光下檢視的斑點更為清晰，對比度更明顯，表明不同檢視方式對色譜分析影響不大，重復性較好，選擇可見光下檢視效果更好。

2.2.3 溫度考察

分別吸取標準品2 μL與供試品溶液4 μL，點于同一薄層板上，于4 ℃、室溫（約20 ℃）、35 ℃條件下，展開顯色后，可見光下檢視、照相。結(jié)果見圖5及表1。A板在4 ℃條件下展開，板上沿產(chǎn)生波紋，斑點出現(xiàn)較為明顯的拖尾，不利于分析，而且4 ℃這一環(huán)境并不便于在任何季節(jié)隨時創(chuàng)造；B板在室溫條件下展開，展開后PC斑點清晰、大小適中、無明顯拖尾，與相鄰斑點保持較好的分離度，分離效果較好；C板在35 ℃條件下展開，斑點邊緣模糊，展開距離較長，不利于分析。通過觀察斑點分離情況并計算PC斑點的Rf，結(jié)果表明，在4～35 ℃范圍內(nèi)，溫度對各組分的分離有一定影響，選擇在室溫條件下展開效果更好。

圖5 不同溫度的薄層色譜圖Fig.5 Thin-layer chromatograms at different temperatures

表1 不同溫度對PC比移值的影響Table 1 Effect of different temperatures on Rf of phosphatidylcholine

2.2.4 不同相對濕度的考察

分別吸取標準品2 μL與供試品溶液4 μL，點于同一薄層板上，于室內(nèi)環(huán)境（相對濕度（relative humidity，RH）約為22%～26%）、RH 42%和65%條件下，展開顯色后，可見光下檢視，照相。結(jié)果見圖6和表2。A板在室內(nèi)環(huán)境下展開，展開后PC斑點清晰、大小適中、無明顯拖尾，與相鄰斑點保持較好的分離度，分離效果較好；B板在RH 42%條件下展開，展開系統(tǒng)受濕度影響在板上沿產(chǎn)生波紋，斑點形狀不規(guī)則，拖尾較明顯，不利于分析；C板在RH 65%下展開，斑點堆積，不利于分析。通過觀察斑點分離情況并計算PC斑點的Rf，結(jié)果表明，濕度對各組分的分離影響較大，選擇在室內(nèi)環(huán)境下展開可以滿足實驗要求。

圖6 不同相對濕度的薄層色譜圖Fig.6 Thin-layer chromatograms at different humidity levels

表2 不同相對濕度對PC比移值的影響Table 2 Effect of different humidity levels on Rf of phosphatidylcholine

2.3 系統(tǒng)驗證

以最佳色譜條件進行系統(tǒng)驗證。即采用課題組自制硅膠G板，以氯仿-甲醇-水（65∶25∶4，V/V）為展開系統(tǒng)，室溫、室內(nèi)環(huán)境下展開，以5%磷鉬酸-乙醇溶液為顯色劑，標準品和供試品的點樣量分別為2 μL和4 μL，可見光下進行檢視、拍照。結(jié)果見圖7。結(jié)果表明，供試品中的PC在與標準品相應(yīng)的位置上，顯示相同顏色的斑點，而且分離效果良好，可以滿足定性、定量分析的要求。

圖7 系統(tǒng)驗證色譜圖Fig.7 Thin-layer chromatogram from the system verification

2.4 PC含量測定

2.4.1 標準曲線的繪制

準確吸取標準品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 μL分別點于薄層板上，展開，紫外燈下定位，掃描PC斑點峰面積。以PC含量（x）為橫坐標，PC峰面積（y）為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程：y=817.54x＋102.35，r=0.999 9。結(jié)果表明，在5.0～30.0 μg范圍內(nèi)PC含量與其斑點峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.4.2 精密度實驗

準確吸取供試品溶液4 μL，依次于同一薄層板上點5 次供試品溶液，重復操作5 次，制得5 塊薄層板，分別展開，紫外燈下定位，掃描測定PC斑點峰面積，分別計算板內(nèi)、板間相同位置PC斑點峰面積的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD），板內(nèi)及板間精密度RSD分別為1.82%和3.73%，表明儀器具有良好的精密度和重復性。

2.4.3 穩(wěn)定性實驗

準確吸取供試品溶液4 μL，點于同一薄層板上，展開，紫外燈下定位，每隔10 min掃描測定一次PC斑點峰面積，計算1 h內(nèi)峰面積的RSD，結(jié)果表明，RSD為1.60%，卵磷脂在1 h內(nèi)測定結(jié)果穩(wěn)定。

2.4.4 樣品測定

分別準確吸取標準品溶液和供試品溶液各2 μL，點于同一薄層板上，按標準曲線項下展開，用外標法計算供試品中PC含量。結(jié)果見表3，供試品中PC含量為63.33%，RSD為3.72%。

表3 樣品測定結(jié)果（n=5）Table 3 Results of replicate determinations of PC in the sample (n=5)

2.4.5 回收率實驗

準確吸取3 份供試品溶液1.0 μL，在供試品溶液中分別加入0.8、1.0、1.2 μL標準品溶液，平行操作3 次，分別展開，紫外燈下定位，掃描測定PC斑點峰面積，用外標法計算。結(jié)果見表4，平均回收率為98.5%，RSD為3.89%，表明本實驗回收率良好，方法準確度高。

表4 回收率實驗結(jié)果Table 4 Results of recovery tests

3 結(jié) 論

利用高效薄層色譜法，在考察不同展開系統(tǒng)、顯色劑、點樣量、薄層板、檢視方式、溫度、相對濕度等條件對卵磷脂不同組分薄層色譜分離影響的基礎(chǔ)上，篩選確定了最佳展開條件，對卵磷脂供試品進行了較為系統(tǒng)的質(zhì)量分析，建立了胡麻油腳卵磷脂質(zhì)量分析的新方法。與高效液相色譜法[13-19]及高效毛細管電泳法[20]相比，本實驗建立的方法色譜分離條件易掌握，實驗成本明顯降低。與薄層色譜分析[10]對比，本實驗獲得的薄層色譜圖各組分分離情況吻合，且PC與其他組分分離效果較好，斑點清晰，結(jié)果直觀，便于定性分析；比較薄層掃描法[11-12]，本實驗的高效薄層定量分析方法更為簡便快捷，且精密度及穩(wěn)定性良好、準確度高，為高效薄層色譜法應(yīng)用于磷脂類混合物的定量分析提供了技術(shù)參考。

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Quality Analysis of Flax Lecithin Based on High Performance Thin Layer Chromatography

GUZAILINUER Aerken, LIU Ran, HOU Jun-feng, AISANJIANG Aihaiti, GUAN Ming*
(Key Laboratory of Pollution Monitoring and Control, College of Chemistry and Chemical Engineering, Xinjiang Normal University, ürümqi 830054, China)

Objective: To establish a method for the quality analysis of lecithin extracted from flax by high performance thin layer chromatography (HPTLC). Methods: Test samples of lecithin and phosphatidylcholine standard were dissolved separately in chloroform-methanol (3:2, V/V) before analysis by HPTLC. The developing system consisted of chloroform, methanol and water (65:25:4, V/V). The effects of chromogenic agents, developing systems, amounts of spotted sample, thin layer chromatography plates, temperature and relative humidity on the separation of each component in sample were investigated. Under the best chromatography condition, the lecithin in the sample and the standard were developed, and the peak area of phosphatidylcholine was scanned. A standard curve was established and phosphatidylcholine in sample was quantified by an external standard method. Results: The separation of each component in sample was suitable for qualitative analysis. The average content of phosphatidylcholine in lecithin sample was 63.33% with plate-to-plate and within-plate precision (relative standard deviation, RSD) of 1.82% and 3.73%, respectively, and stability (RSD) of 1.60%, and the average recovery was 98.5%. Conclusion: The method is rapid, accurate and reproducible, which can provide a new technical reference for the quality analysis of lecithin.

lecithin; high performance thin layer chromatography; phosphatidylcholine; quality analysis

TS207.3

A

1002-6630（2014）16-0160-05

10.7506/spkx1002-6630-201416031

2013-10-19

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學基金項目（2011211A031）；新疆師范大學研究生科技創(chuàng)新項目

古再麗努爾·阿爾肯（1990—），女，碩士研究生，研究方向為天然產(chǎn)物分離與分析。E-mail：657301650@qq.com

*通信作者：關(guān)明（1974—），男，教授，博士，研究方向為資源植物化學。E-mail：guanm@xjnu.edu.cn