楊天偉，李 濤，張 霽，李杰慶，劉鴻高，王元忠,*

紫外光譜結(jié)合歐氏距離和主成分分析法快速鑒別牛肝菌

楊天偉1，李 濤2，張 霽3，李杰慶1，劉鴻高1，王元忠3,*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.玉溪師范學(xué)院資源環(huán)境學(xué)院，云南 玉溪 653100；3.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所，云南 昆明 650223）

采用紫外光譜技術(shù)建立快速鑒別不同產(chǎn)地、種類(lèi)食用牛肝菌的方法。通過(guò)確定最佳提取試劑（0.5 mol/L NaOH溶液），最適稱(chēng)樣量（0.100 0 g）和最佳提取時(shí)間（40 min），制備牛肝菌樣品測(cè)試液；采用夾角余弦、歐氏距離和主成分分析法對(duì)牛肝菌樣品的指紋圖譜進(jìn)行相似度比較。結(jié)果表明，牛肝菌樣品NaOH提取液在10 h內(nèi)穩(wěn)定性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）在0.06%～2.33%之間，重復(fù)性RSD在0.09%～1.81%之間，精密度RSD在0.11%～1.92%之間。樣品間的 夾角余弦值最大為0.999、最小為0.823，夾角余弦值相差較小，不適于鑒別牛肝菌。歐氏距離最大值為873.17，最小值為31.36，樣品間距離差異明顯；主成分分析的前3 個(gè)主成分累積貢獻(xiàn)率達(dá)到93.626%，能夠反映樣品的主要信息，說(shuō)明歐氏距離和主成分分析法可用于不同產(chǎn)地、種類(lèi)牛肝菌的快速鑒別和質(zhì)量控制。

紫外光譜；牛肝菌；夾角余弦；歐氏距離；主成分分析；鑒別

牛肝菌為肉質(zhì)中大型真菌，是菌物界中大型擔(dān)子菌的重要類(lèi)群[1]，也是目前最具經(jīng)濟(jì)價(jià)值、應(yīng)用前景較廣闊的真菌之一[2]。我國(guó)牛肝菌種質(zhì)資源非常豐富，種類(lèi)多達(dá)390 種以上，其中199 種可食用；云南是我國(guó)牛肝菌種類(lèi)較為豐富的地區(qū)之一，已知牛肝菌種類(lèi)有224 種，其中可食用的有144 種[1]，分別約占我國(guó)牛肝菌種類(lèi)的57.4%和72.3%。牛肝菌子實(shí)體味道鮮美，富含蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、多糖類(lèi)物質(zhì)和鈣、磷、鐵等多種礦質(zhì)元素[3-7]，其中多糖和堿性蛋白提取物具有增強(qiáng)人體免疫力，抗腫瘤、抗病毒等功能[8-9]。

長(zhǎng)期以來(lái)，人們對(duì)如此眾多復(fù)雜的牛肝菌種類(lèi)憑借經(jīng)驗(yàn)，根據(jù)牛肝菌的外表特征、生長(zhǎng)特性、孢子型貌等理化指標(biāo)和色、香、味等感官指標(biāo)來(lái)進(jìn)行分類(lèi)及品質(zhì)評(píng)價(jià)[10]。然而很多牛肝菌外表型貌極其相似，如茶褐牛肝菌（Boletus brunneissimus）和深褐牛肝菌（Boletus obscureumbrinus）[11]，依靠感官不易作出正確的分類(lèi)和評(píng)價(jià)。尤其是經(jīng)過(guò)烘干的牛肝菌很難通過(guò)以上方法作出種類(lèi)的判斷，難以鑒別；部分不良商販為獲取利潤(rùn)將不同品質(zhì)、種類(lèi)的牛肝菌混合出售，甚至收購(gòu)有毒牛肝菌，如類(lèi)鉛紫粉牛肝菌（Tylopilus plumbeoviolaceoides）干燥后混入其他可食牛肝菌中出售[11]。因此，尋求能夠快速、準(zhǔn)確鑒別牛肝菌種類(lèi)及作出品質(zhì)評(píng)價(jià)的方法顯得重要。目前，對(duì)食用菌種類(lèi)鑒別的研究主要集中在紅外光譜法，如周在進(jìn)等[10,12]利用傅里葉變換紅外光譜結(jié)合分層抽樣、聚類(lèi)分析等方法對(duì)牛肝菌科、雞油菌科和紅菇科的幾種不同屬蘑菇進(jìn)行鑒別研究；劉剛等[13]根據(jù)食用菌傅里葉變換紅外光譜的峰形、峰高等特征對(duì)部分食用菌進(jìn)行了鑒別研究，但這種鑒別需要具有豐富的經(jīng)驗(yàn)，難以形成完整的鑒別體系。

紫外指紋圖譜技術(shù)是一種靈敏可靠、簡(jiǎn)便快速的檢測(cè)技術(shù)，其原理是不同物質(zhì)體系成分的含量及不飽和程度不同，導(dǎo)致其紫外吸收光譜曲線的峰形、峰高、峰面積有一定的差異[14]。將不同物質(zhì)體系紫外吸收?qǐng)D譜的指紋特性進(jìn)行比較，即可對(duì)物質(zhì)體系進(jìn)行分析與鑒別[15]。紫外指紋圖譜技術(shù)已被廣泛用于中藥鑒別[16]、真假酒鑒別[17]、食品質(zhì)量控制[18-19]等多個(gè)領(lǐng)域，而在食用牛肝菌種類(lèi)鑒別方面的應(yīng)用尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用紫外光譜法測(cè)定了14 種采自云南不同產(chǎn)地、不同種類(lèi)食用牛肝菌的紫外圖譜，對(duì)所得圖譜進(jìn)行3 組平均、八點(diǎn)平滑和一次微分處理校準(zhǔn)和消除干擾，用夾角余弦、歐氏距離和主成分分析（principal component analysis，PCA）法，對(duì)牛肝菌樣品紫外指紋圖譜進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)和鑒別分析。為快速、準(zhǔn)確鑒別不同產(chǎn)地、不同種類(lèi)食用牛肝菌和牛肝菌品質(zhì)評(píng)價(jià)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

14 種牛肝菌樣品采于2012年7月，來(lái)源見(jiàn)表1，經(jīng)云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院劉鴻高教授鑒定。

表1 樣品名稱(chēng)與來(lái)源Table 1 Specices and sources of bolete samples

1.2 試劑與儀器

氫氧化鈉、氯仿（均為分析純） 西隴化工股份有限公司；無(wú)水乙醇（分析純） 云南汕滇藥業(yè)有限公司。

UV-2550雙通道紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（配有UV probe工作站） 日本島津公司；KQ5200型超聲波清洗機(jī) 昆明市超聲儀器有限公司；AR1140型萬(wàn)分之一分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；FW-100型高速粉碎機(jī) 天津市華鑫儀器廠；100目標(biāo)準(zhǔn)篩盤(pán)浙江上虞市道墟五四儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 紫外光譜測(cè)試液制備及測(cè)定條件

樣品采集后，清洗干凈，50 ℃烘干，粉碎、過(guò)100 目篩，保存于自封袋中備用。準(zhǔn)確稱(chēng)取0.100 0 g牛肝菌樣品于25 mL比色管中，加入10 mL 0.5 mol/L NaOH溶液，超聲提取40 min，經(jīng)三層濾紙過(guò)濾得NaOH提取液。以0.5 mol/L NaOH溶液為參比液進(jìn)行紫外指紋圖譜測(cè)定，設(shè)定掃描波長(zhǎng)為190～600 nm，重復(fù)3 次，狹縫1.0 nm，采樣間隔0.2 nm。

1.3.2 紫外光譜處理

對(duì)NaOH提取液所測(cè)得的原始光譜進(jìn)行3 組總平均，8 點(diǎn)平滑和1 次微分處理，以消除噪音干擾和基線漂移，提高光譜分辨率，使圖譜清晰[16]。

1.3.3 紫外指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)

紫外指紋圖譜的相似度是指圖譜的整體相關(guān)性，參考色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)方法，把紫外指紋圖譜的重疊率和共有峰的峰強(qiáng)度相結(jié)合[20]，應(yīng)用Excel 2007軟件和SPSS 17.0軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，分別用以下3 種方法分析圖譜整體相關(guān)性。

夾角余弦法：將第i個(gè)樣品的n個(gè)測(cè)定值（x1i, x2i, …, xni）和第j個(gè)樣品的n個(gè)測(cè)定值（x1j, x2j, …, xnj）作為n維向量空間的兩個(gè)向量，這兩個(gè)向量夾角的余弦值為兩個(gè)樣品的相似系數(shù)；當(dāng)余弦值接近1時(shí)兩樣品相似度高，當(dāng)余弦值接近0時(shí)兩個(gè)樣品差別較大[21]。以每個(gè)樣品圖譜吸收波長(zhǎng)計(jì)算夾角余弦值，其計(jì)算公式為（1）[21]。

歐氏距離法：歐氏距離能反映樣品間的親疏程度，距離越小相似度越大，距離越大的相似度越小，樣品差異越大。以每個(gè)樣品圖譜吸收波長(zhǎng)計(jì)算歐氏距離計(jì)算公式為（2）[21]。

式（1）、（2）中：Cij為夾角余弦；dij為歐式距離；Xik為第i個(gè)供試品的n個(gè)測(cè)定值（x1i, x2i, …, xni）；Xkj為第j個(gè)供試品的n個(gè)測(cè)定值（x1j, x2j, …, xnj）。

主成分分析法：主成分分析法是將多個(gè)指標(biāo)綜合為少數(shù)幾個(gè)指標(biāo)，用幾個(gè)綜合因子（主成分）來(lái)替代多個(gè)原始變量，使這些綜合因子盡可能地反映原始變量的信息，簡(jiǎn)化分析過(guò)程[21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛肝菌特征成分提取條件的確定

2.1.1 最優(yōu)提取溶劑的選擇

以樣品3為考察對(duì)象，準(zhǔn)確稱(chēng)取0.100 0 g樣品分別加入10 mL 0.5 mol/L NaOH溶液、無(wú)水乙醇、氯仿、蒸餾水，每組平行3 次；超聲提取30 min后用3 層濾紙過(guò)濾，經(jīng)190～600 nm紫外光譜測(cè)定，以圖譜吸收峰數(shù)考察不同溶劑對(duì)牛肝菌提取率的響應(yīng)。不同溶劑提取的紫外指紋圖譜見(jiàn)圖1，從圖1可知，用氯仿提取的紫外吸收峰數(shù)目最少，用NaOH提取牛肝菌紫外吸收峰數(shù)明顯多于其他溶劑提取的吸收峰數(shù)。

圖1 不同溶劑提取牛肝菌的紫外指紋圖譜Fig.1 UV fingerprint spectra of boletes sample No.3 extracted with different solvents

圖2 不同NaOH濃度提取牛肝菌的紫外指紋圖譜Fig.2 UV fingerprint spectra of boletes sample No.3 extracted with different concentrations of NaOH

準(zhǔn)確稱(chēng)取0.100 0 g樣品分別加入10 mL 0.1、0.5、1.0、1.5 mol/L NaOH溶液，超聲提取30 min后用3 層濾紙過(guò)濾，進(jìn)行紫外光譜測(cè)定，考察不同NaOH濃度對(duì)牛肝菌樣品提取率的影響。由圖2可看出，不同NaOH濃度對(duì)牛肝菌樣品的提取效果有一定影響，0.1 mol/L NaOH提取液測(cè)得的紫外光譜吸收峰數(shù)較少，吸光度小；0.5 mol/L NaOH提取液測(cè)得的紫外吸收峰數(shù)較多，且吸光度適中，所以用0.5 mol/L NaOH溶液作為提取溶劑。

2.1.2 最適稱(chēng)樣量的確定

以樣品3為考察對(duì)象，準(zhǔn)確稱(chēng)取0.100 0、0.150 0、0.200 0、0.300 0 g樣品分別加入10 mL 0.5 mol/L NaOH溶液，超聲提取30 min，3 層濾紙過(guò)濾，進(jìn)行紫外光譜測(cè)定。由圖3可知，不同稱(chēng)樣量的紫外吸收峰數(shù)基本一致，故選取0.100 0 g為實(shí)驗(yàn)稱(chēng)樣量。

圖3 不同稱(chēng)樣量的牛肝菌紫外指紋圖譜Fig.3 UV fingerprint spectra of boletes sample No.3 with different sample sizes

2.1.3 最佳提取時(shí)間

圖4 不同提取時(shí)間的牛肝菌紫外指紋圖譜Fig.4 UV fingerprint spectra of boletes samples with different extraction times

以樣品3為考察對(duì)象，準(zhǔn)確稱(chēng)取0.100 0 g樣品，加入10 mL 0.5 mol/L NaOH溶液，分別超聲提取20、30、40、60 min，3 層濾紙過(guò)濾，進(jìn)行紫外光譜測(cè)定。由圖4可看出，提取20 min時(shí)牛肝菌樣品的紫外吸收峰主要集中在190～350 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)；提取40 min時(shí)吸收峰數(shù)較多，因此，選擇40 min為超聲提取時(shí)間。

2.2 重復(fù)性、精密度和穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

以樣品3為考察對(duì)象，稱(chēng)取0.100 0 g樣品5 份，同1.3.1節(jié)制取測(cè)試液并進(jìn)行紫外光譜掃描，光譜數(shù)據(jù)經(jīng)1.3.2節(jié)處理后以吸收波長(zhǎng)計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）在0.09%～1.81%之間，表明該方法重復(fù)性好。

取一份樣品3的提取液重復(fù)測(cè)定10 次，光譜數(shù)據(jù)經(jīng)1.3.2節(jié)處理后以吸收波長(zhǎng)計(jì)算的RSD在0.11%～1.92%之間，表明該方法精密度良好。

取一份樣品3提取液分別在2、4、6、8、10 h時(shí)進(jìn)行紫外光譜測(cè)定，光譜數(shù)據(jù)經(jīng)1.3.2節(jié)處理，以吸收波長(zhǎng)計(jì)算的RSD在0.06%～2.33%之間，表明制備液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3 不同產(chǎn)地、種類(lèi)食用牛肝菌紫外指紋圖譜分析

圖5 0.5 mol/L NaOH溶液提取的14 種牛肝菌的紫外指紋圖譜Fig.5 UV fingerprint spectra of 14 sp ecies of boletes extracted with 0.5 mol/L NaOH (numbered 1 through 14, the same below)

由圖5可以看出，牛肝菌樣品紫外圖譜在190～370 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)圖譜重疊率較高，在370～500 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)圖譜重疊率低；每個(gè)牛肝菌樣品都具有多個(gè)特征吸收峰，表現(xiàn)出指紋特性，有利于牛肝菌樣品的鑒別分析。

圖6 同一產(chǎn)地不同種類(lèi)牛肝菌紫外指紋圖譜Fig.6 UV fingerprint spectra of different species of boletes from the same area

圖7 同一種類(lèi)不同產(chǎn)地牛肝菌紫外指紋圖譜Fig.7 UV fingerprint spectra of the same species of boletes from different areas

由圖6、7可知，同一產(chǎn)地不同種類(lèi)和同一種類(lèi)不同產(chǎn)地牛肝菌樣品紫外圖譜的峰形、峰高等都具有差異，表現(xiàn)出明顯的指紋特性，這可能與氣候條件、土壤環(huán)境等多種生態(tài)因子及不同牛肝菌種類(lèi)之間差異有關(guān)。

2.4 牛肝菌紫外指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)

2.4.1 夾角余弦法

表2 樣品間的夾角余弦值Table 2 The included angle cosine between different samples

由表2可知，夾角余弦為0.999的有7 組，分別是1∶3（樣品1與樣品3之間的夾角余弦，下同）、1∶4、3∶4、4∶11、6∶7、6∶14和12∶14，表明這7組中兩個(gè)樣品間相似度較高，難以區(qū)分。夾角余弦值最小的是9∶14，為0.823，表明兩個(gè)樣品差別大；樣品9與其他樣品夾角余弦值均在0.900以下，該樣品易于區(qū)分；同一產(chǎn)地不同物種和同一物種不同產(chǎn)地之間夾角余弦值除1∶3為0.999外，其余都在0.949～0.900之間，樣品不易區(qū)分開(kāi)；因此，夾角余弦法對(duì)于準(zhǔn)確鑒別不同產(chǎn)區(qū)、不同種類(lèi)牛肝菌樣品具有一定局限性。

2.4.2 歐氏距離法

表3 樣品間的歐氏距離Table 3 The Euclidean distance between different samples

由表3可知，樣品間距離最大的是9∶13（樣品9與樣品13之間的歐氏距離，下同），為873.17，樣品9與其他樣品間的歐氏距離都十分明顯，表明，樣品9最易于區(qū)分，這與夾角余弦法結(jié)論一致；歐氏距離最小的是6∶14，為31.36；同一產(chǎn)地不同種類(lèi)牛肝菌之間的歐氏距離1∶2、1∶3、2∶3分別為310.72、48.64和320.36，表明同一產(chǎn)地不同種類(lèi)牛肝菌具有一定差異；同一種類(lèi)不同產(chǎn)地牛肝菌樣品間的歐氏距離2∶8、2∶13、8∶13分別為482.72、344.61和475.64，表明同一種類(lèi)在不同的環(huán)境條件下?tīng)I(yíng)養(yǎng)成分及含量具有較大差異，這與2.3節(jié)中紫外指紋圖譜反映的信息一致。樣品間的歐氏距離具有較大差異，能直觀地體現(xiàn)樣品間差異性，可用于不同產(chǎn)地、種類(lèi)牛肝菌樣品快速鑒別。

2.4.3 主成分分析法

表4 主成分的特征根及貢獻(xiàn)率Table 4 Characteristic values and contribution rates of three first principal components

圖8 牛肝菌樣品主成分分析的三維圖Fig.8 Three-dimensional diagram of bolete samples by PCA

圖9 牛肝菌樣品前兩個(gè)主成分分析的二維圖Fig.9 Two-dimensional diagram of bolete samples by PCA (PC1-PC2)

用SPSS 17.0軟件對(duì)14 種不同產(chǎn)地、種類(lèi)食用牛肝菌樣品進(jìn)行主成分分析，前3 個(gè)主成分的特征值和貢獻(xiàn)率見(jiàn)表4。由表4可看出，主成分1的累積貢獻(xiàn)率為77.741%，是牛肝菌樣品最重要的成分；前兩個(gè)主成分的累積貢獻(xiàn)率為87.07%（大于85%），前3 個(gè)主成分的累積貢獻(xiàn)率為93.626%（大于85%），分別能夠表達(dá)牛肝菌樣品紫外指紋圖譜全部信息的87.07%和93.626%。以PC1、PC2、PC3構(gòu)成不同產(chǎn)地、種類(lèi)牛肝菌主成分的三維投影圖，見(jiàn)圖8。由圖8可看出，樣品6與樣品14重疊在一起，此外，有部分樣品表現(xiàn)成分相似或相近，難以區(qū)分所有牛肝菌樣品。比較發(fā)現(xiàn)，由PC1、PC2構(gòu)成的二維圖中（圖9），樣品9與其他樣品化學(xué)成分差異明顯，樣品6與樣品14主成分差異較??；樣品間無(wú)重疊現(xiàn)象。主成分分析法能夠反映出不同產(chǎn)地、種類(lèi)牛肝菌樣品成分差異，可用于牛肝菌樣品鑒別和品質(zhì)評(píng)價(jià)。

3 結(jié) 論

通過(guò)單因素試驗(yàn)確定牛肝菌特征成分的提取條件：最佳提取溶劑（0.5 mol/L NaOH溶液），最適稱(chēng)樣量（0.100 0 g）和最佳提取時(shí)間（40 min）以建立牛肝菌的紫外指紋圖譜；分析得出牛肝菌樣品的重復(fù)性、精密度和穩(wěn)定性的RSD分別在0.09%～1.81%、0.11%～1.92%、0.06%～2.33%之間，表明該方法具有可靠性。不同產(chǎn)地、種類(lèi)食用牛肝菌樣品紫外光譜曲線具有明顯的指紋特性，采用夾角余弦、歐氏距離和主成分分析法進(jìn)行相似度分析，結(jié)果表明3 種分析方法在一定程度上能反映不同產(chǎn)地、種類(lèi)牛肝菌的特征，但夾角余弦法用于鑒別牛肝菌有一定局限性；歐氏距離法和主成分分析法能較好地反映牛肝菌樣品間的差異性，可用于不同產(chǎn)地、種類(lèi)牛肝菌的快速鑒別和質(zhì)量控制。紫外指紋圖譜分析鑒別技術(shù)顯示不同產(chǎn)地、種類(lèi)食用牛肝菌的成分有明顯差異，這可能與氣候條件、土壤環(huán)境等多種生態(tài)因子及種間差異有關(guān)，今后對(duì)食用牛肝菌鑒別分類(lèi)的研究可以綜合考慮生態(tài)因子、種間差異的影響。

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Rapid Identification of Bolete Mushrooms by UV Spectroscopy Combined with Euclidean Distance and Principal Component Analysis

YANG Tian-wei1, LI Tao2, ZHANG Ji3, LI Jie-qing1, LIU Hong-gao1, WANG Yuan-zhong3,*
(1. College of Agronomy and Biotechnology, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China; 2. College of Resources and Environment, Yuxi Normal University, Yuxi 653100, China; 3. Institute of Medicinal Plants, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Kunming 650223, China)

In this study, an ultraviolet (UV) spectroscopic method was established for rapid identification of different species of bolete mushrooms from different areas. For preparation of boletes extracts, the optimal extraction extraction solvent, sample amount and extraction time were determined as 0.5 mol/L NaOH, 0.100 0 g and 40 min, respectively. The similarity of UV spectral fingerprint of bolete samples was analyzed by included angle cosine (IAC), Euclidean distance (ED) and principal component analysis (PCA). The results showed that, within 10 h, the RSDs of stability, repeatability and accuracy for bolete extracts were 0.06%-2.33%, 0.09%-1.81% and 0.11%-1.92%, respectively. The difference of IAC values among samples was small, ranging from 0.823 to 0.999. But the difference of ED values among samples was large, ranging from 31.36 to 873.17. PCA showed that the cumulative contribution rate of the first three factors was 93.626%, which could reflect most information about the samples. These findings suggested that the ED and PCA methods can be used for rapid identification and quality control of different specices of boletes from different areas.

ultraviolet spectroscopy; bolete; included angle cosine; Euclidean distance; principal component analysis; identification

TS201.2

A

1002-6630（2014）16-0105-05

10.7506/spkx1002-6630-201416020

2013-08-26

國(guó)家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項(xiàng)目（31260496；31160409）；云南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2011FB053；2011FZ195）

楊天偉（1989—），男，碩士研究生，主要從事真菌資源研究。E-mail：861825996@qq.com

*通信作者：王元忠（1981—），男，助理研究員，碩士，主要從事真菌資源及藥用植物研究。E-mail：boletus@126.com