葉麗紅，王標詩*，程漪婷，黃日鳳，關清好，江 敏，金 蓓，杜建中

水酶法提取番木瓜籽油工藝及其氧化穩(wěn)定性分析

葉麗紅，王標詩*，程漪婷，黃日鳳，關清好，江 敏，金 蓓，杜建中

（嶺南師范學院化學科學與技術學院，廣東 湛江 524048）

以番木瓜籽為原料，通過單因素試驗和正交試驗研究不同酶種類、酶解時間、料液比、酶添加量、酶解溫度等因素對番木瓜籽油提取率的影響，確定番木瓜籽油提取的最佳工藝條件，并以番木瓜籽油過氧化值為評價指標，考察溫度、光照、抗氧化劑對番木瓜籽油氧化穩(wěn)定性的影響。結果表明，番木瓜籽油的最佳提取條件為：選用中性蛋白酶，酶添加量2.5%、酶解時間5 h、料液比1∶7、酶解溫度45 ℃。在此條件下，番木瓜籽油的提取率為85.73%。溫度、光照、氧氣均會引起貯藏過程中番木瓜籽油過氧化值的升高。添加抗氧化劑可明顯提高番木瓜籽油的氧化穩(wěn)定性，其中叔丁基對苯二酚的抗氧化效果最好。

水酶法；番木瓜籽油；提?。谎趸€(wěn)定性

番木瓜（Carica papaya L.），屬番木瓜科、番木瓜屬，又名木瓜、萬壽果、蓬生果等。番木瓜在世界熱帶、亞熱帶地區(qū)均有分布。我國主要分布在廣東、海南、廣西、云南、福建、臺灣等省。番木瓜成熟時果肉柔軟多汁，味香甜；成熟的番木瓜營養(yǎng)豐富、VC含量高，可助消化、治胃病[1]。番木瓜既可以直接食用，又可以將其加工成果醬和果汁等[2-5]，其含有豐富的木瓜蛋白酶，是生產(chǎn)木瓜蛋白酶的主要原料，在醫(yī)藥、食品、制革、紡織及美容上有著廣泛應用[6]。

番木瓜籽是番木瓜加工成產(chǎn)品之后的副產(chǎn)物，工廠往往將其作為垃圾扔掉，這樣不僅污染環(huán)境，而且浪費了大量的生物資源。據(jù)研究報道[6-14]，木瓜籽提取物具有多種生理功能，如木瓜籽的氯仿提取物中存在一種有可逆的天然安全的避孕藥物；木瓜籽中含有豐富的三萜類化合物，具有免疫活性；木瓜籽的木瓜籽乙醇提取物具有明顯的鎮(zhèn)痛、抗感染作用；木瓜籽提取物還具有抗氧化、抗菌、抗癌等活性。因此，研究番木瓜籽及其功能成分有著深遠的意義。對番木瓜籽的高值化綜合利用，不僅有利于解決環(huán)境問題，還將帶來良好的經(jīng)濟效益和社會效益。

除了上述成分外，番木瓜籽中還含有豐富的油脂成分[15]。番木瓜籽油屬于植物油，其中必需脂肪酸油酸的含量很高，其營養(yǎng)含量指標完全符合食用植物油的要求。番木瓜籽油含有大量的不飽和脂肪酸，在提取和貯存期間不飽和脂肪酸的雙鍵易被氧化，同時脂肪酸組成、雙鍵位置和數(shù)量、貯存條件等因素也會影響其氧化穩(wěn)定性。文獻[16-21]報道了有機溶劑法、超臨界萃取技術、超聲波輔助提取技術等對木瓜籽油的提取效果、木瓜籽油理化性質(zhì)及影響因素等。而木瓜籽油的水酶法提取工藝文獻中未見報道。

本實驗主要以番木瓜籽為原料，利用水酶法提取其中的油脂，優(yōu)化提取工藝條件，并研究光照、溫度、抗氧化劑等因素對番木瓜籽油氧化穩(wěn)定性的影響。此研究的開展可以充分利用番木瓜資源，為番木瓜的深加工和副產(chǎn)物高值化綜合利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

番木瓜（九成熟）購于廣東湛江市場。

堿性蛋白酶（pH 8.5～10.5，最適溫度50～60 ℃，酶活力200 000 U/g）、酸性蛋白酶（pH 2.5～3.5，30～50 ℃，酶活力50 000 U/g）、中性蛋白酶（pH 7.0～7.8，40 ℃，60 000 U/g）、果膠酶（pH 5.5～6，55～60 ℃，酶活力100 000 U/g）、纖維素酶（pH 4～5.5，50～60 ℃，酶活力50 000 U/g） 江蘇瑞陽生物科技有限公司；鹽酸、NaOH、無水乙醚、石油醚、三氯甲烷、冰乙酸、碘化鉀、硫代硫酸鈉、氫氧化鉀、乙醇、酚酞等均為分析純。

1.2 儀器與設備

HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州澳華儀器有限公司；PHS-3C型pH計 上海精密科學儀器有限公司；DHG-9240A型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司；FA2104N型電子精密分析天平 上海濟成分析儀器有限公司；SXT-06索式提取器 上海洪紀儀器設備有限公司；80-2電動離心機 金壇市新航儀器廠；HZSHA水浴振蕩器 哈爾濱市東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司；C型玻璃儀器氣流烘干器 長城科工貿(mào)有限公司；QN-999粉碎機 江蘇金壇市環(huán)宇科技儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 番木瓜籽含油率的測定

原料預處理：用水將番木瓜籽表面的漿狀物質(zhì)洗掉，然后用手和布搓掉包裹番木瓜籽的膠狀物質(zhì)，稍微晾干放入烘箱60 ℃恒溫烘5～10 h ；用粉碎機粉碎番木瓜籽，使番木瓜籽內(nèi)部的含油物質(zhì)破碎，得到粉末狀的番木瓜籽粉。

以無水乙醚和石油醚為抽提劑，用索氏抽提法提取番木瓜籽油，按式（1）計算番木瓜籽油含油率。

1.3.2 番木瓜籽油水酶法提取工藝

準確稱取經(jīng)清理、干燥、粉碎后的番木瓜籽粉3 g于 200 mL錐形瓶中，加水15 mL，混勻后90 ℃水浴10 min滅酶，冷卻至室溫后調(diào)pH值（用磷酸鹽緩沖溶液調(diào)節(jié)），加酶，置于恒溫振蕩器中，在設定的酶解溫度及酶解時間條件下進行酶解，反應完成后90 ℃水浴10 min滅酶，3 500 r/min離心30 min，收集殘渣測定殘渣含油量及按式（2）計算番木瓜籽油提取率[22]。

1.3.3 單因素試驗

稱取一定量烘干的粉末狀番木瓜籽若干份，分別進行酶種類及添加量、酶解時間、酶解溫度、料液比等單因素試驗，以油脂提取率為指標，考察不同因素對番木瓜籽油脂提取的影響。

1.3.3.1 酶種類對番木瓜籽油提取率的影響

分別在每種酶的最適pH值、最適溫度條件下，酶添加量2.00%，料液比選1∶5（g/mL），置于恒溫水浴振蕩器中在110 r/min的轉速下酶解6 h，3 500 r/min離心30 min，考察堿性蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、纖維素酶及果膠酶對番木瓜籽油提取率的影響。

1.3.3.2 酶解時間對番木瓜籽油提取率的影響

取2 g番木瓜籽粉末若干份于50 mL錐形瓶中，加水18 mL，混勻后90 ℃水浴10 min滅酶，降至室溫后調(diào)pH值，加酶，酶添加量1.00%，置于冷凍恒溫振蕩器中，測定在該酶最適酶解解溫度的條件下，酶解時間（1、2、3、4、5、6、7 h）對番木瓜籽油提取率的影響。

1.3.3.3 料液比對番木瓜籽油提取率的影響

取2 g番木瓜籽粉末若干份，分別加入不同量燒開的蒸餾水進行滅酶，混勻后90 ℃水浴10 min滅酶，降至室溫后調(diào)pH值，加酶，在酶添加量1.00%、最適酶解溫度的條件下，測定不同料液比（1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10，g/mL）對番木瓜籽油提取率的影響。

1.3.3.4 酶添加量對番木瓜籽油提取率的影響

取2 g番木瓜籽粉末若干份于50 mL錐形瓶中，加水18 mL，混勻后90 ℃水浴10 min滅酶，降至室溫后調(diào)pH值，加酶，置于冷凍恒溫振蕩器中，測定在該酶最適酶解溫度、酶解5 h的條件下，酶添加量（0.5%、1.0%、1.5% 、2.0%、2.5%）對番木瓜籽油提取率的影響。

1.3.3.5 酶解溫度對番木瓜籽油提取率的影響

取2 g番木瓜籽粉末若干份于50 mL錐形瓶中，加水18 mL，混勻后90 ℃水浴10 min滅酶，降至室溫后調(diào)pH值，測定在酶添加量1.00 %、酶解時間5 h條件下，酶解溫度（35、40、45、50、55、60、65 ℃）對番木瓜籽油提取率的影響。

1.3.4 正交試驗

采用正交試驗設計，應用L9（34）正交表，以單因素試驗為基礎，選擇酶解時間、料液比、酶添加量和酶解溫度為因素，進行四因素三水平正交試驗，正交試驗因素及水平見表1。以油脂提取率為指標，得出提取番木瓜籽油的最佳條件。

表1 正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels used for orthogonal array design

1.3.5 番木瓜籽油酸值、皂化值、過氧化值的測定

酸值的測定：采用GB/T 5530—2005《動植物油脂酸值測定》；皂化值的測定：采用GB/T 5534—2008《動植物油脂皂化值的測定》；過氧化值的測定：采用GB/T 5538—1995《動植物油脂過氧化值測定》。

1.3.6 不同因素對番木瓜籽油氧化穩(wěn)定性的影響[23]

分別取15 g番木瓜籽油置于50 mL廣口瓶中，在2 ℃、室溫、60 ℃不同條件下以及在自然光和室溫避光條件下存放，24 h攪拌1 次，測定番木瓜籽油的過氧化值，研究溫度和光照對番木瓜籽油穩(wěn)定性的影響。

采用Schaal烘箱加速法，選擇叔丁基對苯二酚（tertiary butylhydroquinone，TBHQ）、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（2,6-di-tert-butyl-4-methylphenol，BHT）2 種抗氧化劑，分別配制成抗氧化劑質(zhì)量分數(shù)為0.01%的油樣，混合均勻，密封置于（60±1）℃的恒溫箱中，以不添加抗氧化劑的番木瓜籽油為對照，24 h攪拌1 次，測定番木瓜籽油的過氧化值（peroxide value，POV），研究其對番木瓜籽油的抗氧化效果。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗均平行3 次，結果以均值±標準偏差的形式表示。

2 結果與分析

2.1 番木瓜籽含油率的測定結果

通過索氏提取法，以乙醚作提取溶劑時，番木瓜籽含油率為（32.30±0.35）%，以石油醚作提取溶劑時，番木瓜籽含油率為（32.05±0.42）%。鄧楚津等[24]研究表明，番木瓜籽中粗蛋白含量24.91%，粗脂含量32.21%。這與本實驗的測定結果比較接近。

2.2 番木瓜籽油水酶法提取工藝條件優(yōu)化

2.2.1 酶種類對番木瓜籽油提取率的影響

由圖1可知，酶的添加能顯著提高番木瓜籽油的提取率，在相同的條件下，作用最顯著的是中性蛋白酶，提取率達73.9%，說明中性蛋白酶能使番木瓜籽內(nèi)的蛋白質(zhì)很好地分解，釋放出游離油脂。所以確定水酶法提取番木瓜籽油的最適酶種類為中性蛋白酶。

圖1 酶種類對番木瓜籽油提取率的影響Fig.1 Effect of enzyme type on the extraction yield of papaya seed oil

2.2.2 酶解時間對番木瓜籽油提取率的影響

圖2 酶解時間對番木瓜籽油提取率的影響Fig.2 Effect of hydrolysis time on the extraction yield of papaya seed oil

由圖2可以看出，在前5 h內(nèi)，隨著中性蛋白酶作用時間的延長，提取率明顯增加，當酶解反應5 h時，提取率最高為85.5%；繼續(xù)延長酶解時間，提取率變化不大?？紤]到隨著酶解時間的延長，獲得番木瓜籽油的品質(zhì)會逐漸下降，且生產(chǎn)周期越長，能量消耗越大，繼而影響生產(chǎn)成本。綜合考慮可知最佳酶解時間為5 h。

2.2.3 料液比對番木瓜籽油提取率的影響

圖3 料液比對番木瓜籽油提取率的影響Fig.3 Effect of substrate to water ratio on the extraction yield of papaya seed oil

從圖3可以看出，開始時隨著提取液體用量的增大，提取率幾乎呈直線上升，當料液比在1∶6后提取率呈下降趨勢。當料液比為1∶6時，番木瓜籽油提取率高達80.3%，因為此時底物質(zhì)量濃度和酶質(zhì)量濃度達到合適的比例，反應速率加快，油脂提取率也隨之增加，這說明水酶法提取油脂時適量的水對提油是有利的。但是當?shù)孜镔|(zhì)量濃度繼續(xù)降低，酶與底物的接觸減少，這樣酶的作用效果就會降低，從而導致提取率下降。因此，最佳料液比為1∶6。

2.2.4 酶添加量對番木瓜籽油提取率的影響

圖4 酶添加量對番木瓜籽油提取率的影響Fig.4 Effect of enzyme dosage on the extraction yield of papaya seed oil

由圖4可知，酶添加量從0.5%增加到1.5%時，其提取率顯著增加，隨后繼續(xù)添加中性蛋白酶，提取率緩慢下降并趨于平衡?？梢娒柑砑恿窟^少不能夠完全作用于番木瓜籽，當酶添加量達到1.5%時，已能較好地酶解番木瓜籽釋放油脂，繼續(xù)添加酶其提取率緩慢降低。這是因為過多的酶會吸附在番木瓜籽表面，使得油脂被包裹在其中無法釋出。因此，綜合考慮提取率及試驗成本等多方面的因素，酶最佳用量穩(wěn)定在1.5%。

2.2.5 酶解溫度對番木瓜籽油提取率的影響

圖5 酶解溫度對番木瓜籽油提取率的影響Fig.5 Effect of hydrolysis temperature on the extraction yield of papaya seed oil

從圖5以看出，當酶解溫度為35～50 ℃時，番木瓜籽油的提取率隨酶解溫度的上升而逐漸增加；50～65 ℃時，提取率隨酶解溫度的上升而逐漸下降；50 ℃為酶水解反應的最適宜溫度，該溫度條件下，番木瓜籽油的提取率為83.7%。這主要是因為各種酶都有最適宜的作用溫度，在最適溫度條件下，反應物的能量增加，單位時間內(nèi)各組分之間有效接觸的次數(shù)增多，反應速度加快；若反應體系的溫度高于酶作用的最適宜溫度，酶分子吸收過多的能量，引起維持酶分子結構的次級鍵解體，導致酶蛋白變性，因此使酶活性減弱，降低了提取率。因此，最佳酶解溫度為50 ℃。

2.2.6 正交試驗結果

在單因素試驗基礎上，以酶解時間（A）、料液比（B）、酶添加量（C）、酶解溫度（D）為考察因素，番木瓜籽油提取率為考察指標進行L9（34）正交試驗。正交試驗結果見表2。

表2 正交試驗設計及結果Table 2 Results of orthogonal array design

由表2可以看出, 在水酶法提取番木瓜籽油過程中，影響番木瓜籽油提取率的因素主次順序為C＞B＞A＞D，最佳組合為A2B2C3D1。全面考慮經(jīng)濟、提取率及操作的方便性等因素選取最優(yōu)條件為A2B2C3D1，即酶解時間5 h、料液比1∶7、酶添加量2.5%、酶解溫度45 ℃，在此條件下番木瓜籽油提取率為（85.73±0.86）%。在該條件下做驗證實驗，番木瓜籽油提取率為（85.73±0.52）%。說明此結果可靠性強。

表3 正交試驗結果方差分析Table 3 Analysis of variance for the results of orthogonal array design

由表3方差分析可知，在水酶法提取番木瓜籽油工藝正交試驗所選擇的因素和水平范圍內(nèi)，A、B、C、D因素的影響均未達到顯著性水平（P＜0.05），即酶解時間、料液比、加酶量和酶解溫度對番木瓜籽油的提取影響均不顯著，而F值結果表明方差分析結果與直觀分析結果一致。

2.3 番木瓜籽油酸價、過氧化值和皂化值的測定結果

利用最佳方案提取出番木瓜籽油，用國標法測出其酸值為0.012 mg KOH/g，皂化值為158.53 mg/g，過氧化值為1.23 meq/kg。由此可見，提取的番木瓜籽油的酸值、皂化值、過氧化值都符合國家食用油標準，無明顯的氧化酸敗，這充分說明原料的品質(zhì)良好。劉書成等[16]以正己烷為溶劑提取番木瓜籽油，其酸值和過氧化值指標都達到食用油的標準，這與本實驗的結果基本一致。

2.4 番木瓜籽油的氧化穩(wěn)定性

2.4.1 溫度對番木瓜籽油穩(wěn)定性的影響

圖6 溫度對番木瓜籽油穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effect of temperature on the stability of papaya seed oil

由圖6可知，在各溫度條件下放置10 d，番木瓜籽油的過氧化值均呈上升趨勢，且溫度越高，過氧化值增加幅度越大，這說明番木瓜籽油在貯藏過程中自動氧化始終沒有停止，而且其自動氧化程度與溫度和時間成正相關，在相同的時間條件下，溫度越高過氧化值越高。在測試前各個樣品的過氧化值僅為1.23 meq/kg，處理10 d后，在60 ℃條件下的番木瓜籽油過氧化值變化幅度最大，而在2 ℃條件下的番木瓜籽油過氧化值變化幅度不大。因此低溫有利于番木瓜籽油的貯藏，延緩油脂的自動氧化。

2.4.2 光照對番木瓜籽油穩(wěn)定性的影響

圖7 光照對番木瓜籽油穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effect of light on the stability of papaya seed oil

油脂氧化有自動氧化和光氧化兩種。自動氧化是指空氣中的氧與油脂的氧化過程，其中最經(jīng)典的是游離基反應，而在光照條件下，光氧化和自動氧化都可以進行，且在自動氧化初期，光氧化是關鍵的誘因。因為光能促進過氧化物的分解，還能引發(fā)游離基，促進氧化反應的進行。由圖7可知，番木瓜籽油的過氧化值隨著處理時間的延長而升高，避光存放的番木瓜籽油的氧化速度明顯低于自然光照射，說明光可使氧分子活化加快番木瓜籽油的氧化。因此，番木瓜籽油適宜采取避光保存。

2.4.3 抗氧化劑對番木瓜籽油的穩(wěn)定性的影響

不飽和脂肪酸極易發(fā)生自動氧化和分解，直接影響著油脂的氧化穩(wěn)定性。由圖8可知，添加 TBHQ、BHT抗氧化劑可很好的提高其抗氧化性，在高溫條件下處理10 d，其過氧化值仍然保持在較低的水平。由此說明抗氧化劑對番木瓜籽油均能起到有效的抗氧化效果，而且TBHQ的抗氧化效果比BHT好很多。該結果與陳元平等[25]報道基本一致，說明TBHQ對油脂的抗氧化效果顯著。

圖8 抗氧化劑對番木瓜籽油的穩(wěn)定性的影響Fig.8 Effect of antioxidants on the stability of papaya seed oil

3 結 論

采用不同酶提取番木瓜籽油，發(fā)現(xiàn)中性蛋白酶最有利于蛋白降解和油脂的提取，并考察了酶解時間、料液比、酶添加量、酶解溫度等對油脂提取率和蛋白水解度的影響，用正交試驗優(yōu)化法確定了水酶法提油的最佳條件為酶解溫度45 ℃、料液比1∶7、酶添加量2.5%，在此條件下酶水解5 h，番木瓜籽油提取率達到85.73%。

溫度、光照、氧氣均會引起貯藏過程中番木瓜籽油過氧化值的升高。其中光照比溫度對番木瓜籽油過氧化值的影響更加明顯。因此，貯藏番木瓜籽油時，應將其放置于密閉容器中，存放在陰涼、避光處。添加抗氧化劑可明顯提高番木瓜籽油的氧化穩(wěn)定性，其中TBHQ的抗氧化效果最好。

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Aqueous Enzymatic Extraction and Oxidative Stability of Papaya Seed Oil

YE Li-hong, WANG Biao-shi*, CHENG Yi-ting, HUANG Ri-feng, GUAN Qing-hao, JIANG Min, JIN Bei, DU Jian-zhong
(School of Chemistry Science and Technology, Lingnan Normal University, Zhanjiang 524048, China)

This study was aimed to establish the optimum conditions for the aqueous enzymatic extraction of papaya seed oil by investigating the effects of enzymes, hydrolysis time, substrate to water ratio, enzyme dosage and temperature on oil yield by using single-factor and orthogonal array designs. Meanwhile, the effects of temperature, light and antioxidants on the oxidative stability of papaya seed oil as reflected by its peroxide value were also analyzed. The results showed that the optimum parameters for extracting papaya seed oil were found to be 5 h of hydrolysis using neutral protease at a dosage of 2.5% with a substrate to water ratio of 1:7 (g/mL) at 45 ℃. Under the optimized conditions, the extraction yield of papaya seeds oil was 85.73%. Temperature, light and oxygen caused an increase in peroxide value during storage of papaya seed oil and TBHQ had good antioxidant effect on the oil.

aqueous enzymatic method; papaya seed oil; extraction; oxidative stability

TS221

A

1002-6630（2014）16-0058-06

10.7506/spkx1002-6630-201416011

2013-11-21

廣東省高校優(yōu)秀青年創(chuàng)新人才培養(yǎng)計劃項目（2012LYM_0091）；2013年廣東省大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目

葉麗紅（1990—），女，本科生，研究方向為食品科學與工程。E-mail：hang_kong2002@163.com

*通信作者：王標詩（1980—），男，講師，博士，研究方向為食品化學、食品加工及安全。E-mail：hang_kong2002@163.com