劉程惠，劉易偉，胡文忠*，姜愛麗，郭雯倩

（大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 大連 116600）

檸檬酸處理鮮切獼猴桃在貯藏過程中抗氧化活性的變化

劉程惠，劉易偉，胡文忠*，姜愛麗，郭雯倩

（大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 大連 116600）

研究0.1、0.2、0.3 g/100 mL檸檬酸處理的鮮切獼猴桃在10 ℃貯藏10 d內(nèi)抗氧化活性的變化。結(jié)果表明：鮮切獼猴桃在貯藏期間抗氧化能力呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，前期變化緩慢，后期下降趨勢(shì)明顯；同時(shí)，通過樣品抗氧化能力指標(biāo)的測(cè)定可知，經(jīng)過檸檬酸處理的鮮切獼猴桃抗氧化能力變化比未經(jīng)過處理的鮮切獼猴桃抗氧化能力變化緩慢，說明檸檬酸處理在貯藏過程中能更好的維持鮮切獼猴桃的抗氧化活性。

鮮切獼猴桃；檸檬酸；抗氧化活性

獼猴桃果實(shí)多汁，果肉質(zhì)地細(xì)嫩，氣味清香，風(fēng)味獨(dú)特，獼猴桃以其含有豐富的抗氧化活性物質(zhì)，特別是在水果中名列前茅的VC含量，成為頗受關(guān)注的抗氧化水果之一[1-3]。鮮切獼猴桃經(jīng)過去皮、切分等加工后，原有的保護(hù)層被破壞，在貯藏期間果實(shí)內(nèi)抗氧化物質(zhì)的含量和活性會(huì)受到影響，因此常利用低溫貯藏[4-5]、保鮮劑處理[6-8]鮮切果蔬，以達(dá)到維持鮮切果蔬的品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)活性物質(zhì)的目的。目前，關(guān)于鮮切獼猴桃在貯藏期間抗氧化活性物質(zhì)及自身抗氧化能力變化的相關(guān)研究，仍未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)這一問題以陜西獼猴桃為原料，研究在貯藏期間，鮮切獼猴桃中幾種與抗氧化有關(guān)的活性物質(zhì)及其抗氧化能力的變化，為鮮切獼猴桃的加工、保鮮提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

獼猴桃，產(chǎn)地陜西，以成熟可食用但還未變軟的新鮮獼猴桃作為樣品。

95%乙醇、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、氯化硝基四氮唑藍(lán)（nitrotetrazolium blue chloride，NBT）、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）均為國(guó)產(chǎn)分析純；愈創(chuàng)木酚、乙二酸四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）均為國(guó)產(chǎn)優(yōu)級(jí)純；抗壞血酸（分析純） 美國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2100型紫外-可見分光光度計(jì) 尤尼柯（上海）儀器有限公司；T25基本型高剪切分散勻漿機(jī) 德國(guó)IKA工業(yè)設(shè)備公司；TDL-60B離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 原料處理

原料清洗去皮并切成厚7 mm片狀，用0（空白對(duì)照）、0.1、0.2、0.3 g/100 mL檸檬酸浸泡5 min，瀝干后用保鮮盒包裝，放入10 ℃冷藏備用。對(duì)相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)樣品重復(fù)3次，求平均值，并進(jìn)行差異顯著分析。

1.3.2 DPPH自由基清除率的測(cè)定

根據(jù)Saxena等[9]和Alothman等[10]的方法并作修改。稱取5 g獼猴桃，加入15 mL去離子水，在冰浴條件下勻漿完全后，于4 ℃、10 000×g離心30 min，收集上清液作為測(cè)試樣液。2 mL樣液和2 mL 0.1 mmol/L的DPPH于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各管的吸光度（A），用2 mL去離子水代替樣液作為空白。對(duì)DPPH自由基的清除率用下式表示：

1.3.3 總酚的測(cè)定方法

根據(jù)王艷穎等[11]的方法并作修改。稱取2 g獼猴桃，加入10 mL經(jīng)預(yù)冷的1%（V/V） HCl-甲醇溶液，在冰浴條件下勻漿后，轉(zhuǎn)入20.0 mL刻度試管中，用1%（V/V）HCl-甲醇溶液定容至刻度，混勻，于4 ℃ 避光提取20 min，期間搖動(dòng)數(shù)次，然后過濾，收集濾液待用。以1%（V/V）HCl-甲醇溶液作空白參比調(diào)零，取濾液于280 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，酚類含量以A280/g表示。

1.3.4 過氧化氫酶（catalase，CAT）活性的測(cè)定方法

根據(jù)Meng Xiangyong等[12]和Zhang Xiaona等[13]的方法并作修改。稱取5 g獼猴桃樣品，置于勻漿管中，加入10 mL提取緩沖液，在冰浴條件下勻漿完全，于4 ℃、10 000×g離心30 min，收集上清液，即為粗酶提取液，低溫保存?zhèn)溆?。酶促反?yīng)體系由2.9 mL 20 mmol/L H2O2溶液和0.1 mL酶液組成。以蒸餾水為參比空白，在反應(yīng)體系混合時(shí)開始記錄反應(yīng)體系在240 nm波長(zhǎng)處吸光度，作為初始值，然后每隔30s記錄一次，連續(xù)測(cè)定，至少獲取6個(gè)點(diǎn)的數(shù)據(jù)。以鮮質(zhì)量每克樣品的酶活性表示0.01ΔA240/（min·g）。

1.3.5 羥自由基清除率的測(cè)定方法

根據(jù)謝海玉等[14]的方法并作修改。精確稱取5 g獼猴桃，加入5 mL去離子水，在冰浴條件下勻漿完全后，于4 ℃、10 000×g離心20 min，收集上清液，即為測(cè)定提取液，低溫保存?zhèn)溆谩y(cè)定組為1 mL 0.075 mol/L鄰二氮菲、2 mL磷酸緩沖液（pH 7.4）、1 mL去離子水，搖勻后分別加入酶液、0.75 mol/L硫酸鹽鐵、0.01 g/100 mL H2O2溶液各1 mL，于536 nm波長(zhǎng)處分別測(cè)定其他各管的吸光度。用磷酸緩沖液代替酶液作為調(diào)零管，代替H2O2溶液作為對(duì)照管。

1.3.6 抗壞血酸過氧化物酶（ascobate peroxidase，APX）活性的測(cè)定方法

根據(jù)An Jianshen等[15]和Luo Haibo等[16]的方法并作修改。稱取5 g獼猴桃，加入10 mL經(jīng)4 ℃預(yù)冷的提取緩沖液，在冰浴條件下勻漿完全后，于4 ℃、10 000×g離心30 min，收集上清液，即為酶液，低溫保存?zhèn)溆?。向試管中依次加?.6 mL反應(yīng)緩沖液和0.1 mL酶提取液，最后加入0.3 mL 2 mmol/L H2O2溶液?jiǎn)?dòng)酶促反應(yīng)，立即混勻，并開始計(jì)時(shí)。從啟動(dòng)后開始記錄反應(yīng)體系在290 nm波長(zhǎng)處的吸光度，每隔30 s記錄一次，連續(xù)測(cè)定，至少獲取6個(gè)點(diǎn)的數(shù)據(jù)。以蒸餾水為參比對(duì)分光光度計(jì)進(jìn)行調(diào)零。以鮮質(zhì)量每克樣品的酶活性表示為0.01ΔA290nm/（min·g）。

1.3.7 VC含量的測(cè)定方法

按照張憲政等[17]的方法測(cè)定。

1.3.8 還原力的測(cè)定方法

參照Soong等[18]的方法并做改進(jìn)。稱取5 g獼猴桃，加入10 mL去離子水，在冰浴條件下勻漿完全后，于4 ℃、10 000×g離心20 min，收集上清液，即為酶液，低溫保存?zhèn)溆谩?.5 mL樣液中分別加入2.5 mL 0.2 mol/L、pH 6.6磷酸緩沖液、2.5 mL 1 g/100 mL鐵氰化鉀溶液，混勻后50 ℃水浴平衡20 min，加入2.5 mL 10 g/100 mL三氯乙酸溶液，振蕩搖勻，離心（4 ℃，4 000×g）10 min，取2.5 mL上清液加入2.5 mL去離子水和0.5 mL 0.1 g/100 mL氯化鐵溶液，靜置10 min后，于700 nm波長(zhǎng)處分測(cè)定吸光度。

1.3.9 超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性的測(cè)定方法

根據(jù)Yang Zhenfeng等[19]和Luo Haibo等[16]的方法并作修改。精確稱取5 g獼猴桃，加入5 mL提取緩沖液，在冰浴條件下勻漿，離心（4 ℃、10 000×g）30 min，收集上清液，即為酶提取液，低溫保存?zhèn)溆?。在試管中分別加入1.7 mL 50 mmol/L pH 7.8磷酸緩沖液、130 mmol/L甲硫氨酸、750 μmol/L NBT、100 μmol/L EDTA-Na2各0.3 mL。搖勻后分別加入0.3 mL 20 μmol/L核黃素，樣品測(cè)定加入0.1 mL酶液。用磷酸緩沖液代替酶液的作為調(diào)零管。混勻后，取1支對(duì)照管置于暗處，其他各管置于陽(yáng)光下反應(yīng)30 min后立即置于暗處終止反應(yīng)。以不照光管做空白參比調(diào)零，于560 nm波長(zhǎng)處分別測(cè)定其他各管的吸光度。以鮮質(zhì)量每克樣品的酶活性表示為0.5ΔA560/（min·g）。

2 結(jié)果與分析

2.1 鮮切獼猴桃在貯藏過程中DPPH自由基清除率的變化

DPPH自由基在有機(jī)溶劑中是一種穩(wěn)定的自由基，具有強(qiáng)氧化性，可損害機(jī)體的組織和細(xì)胞。DPPH自由基與鮮切果蔬的抗氧化活性關(guān)系緊密，其在鮮切果蔬貯藏過程中的變化，能在一定程度上反應(yīng)出鮮切果蔬總抗氧化能力的變化[20]。如圖1所示，在整個(gè)貯藏期間，3種質(zhì)量濃度檸檬酸處理的鮮切獼猴桃清除DPPH自由基的能力在前4 d均下降較小，后6 d變化不大，對(duì)DPPH自由基的清除率效果相差不大，0.1 g/100 mL處理的鮮切獼猴桃DPPH自由基清除率基本保持較高水平，較優(yōu)于其他處理組，說明0.1 g/100 mL檸檬酸處理的鮮切獼猴桃能較好的保持DPPH自由基的清除能力。

圖1 不同質(zhì)量濃度檸檬酸處理對(duì)鮮切獼猴桃DPPH自由基清除速率的影響Fig.1 Effect of treatments with different concentrations of citric acid on the DPPH radical scavenging capacity of fresh-cut kiwifruit

2.2 鮮切獼猴桃在貯藏過程中總酚含量變化

圖2 不同質(zhì)量濃度檸檬酸處理對(duì)鮮切獼猴桃總酚含量的影響Fig.2 Effect of treatments with different concentrations of citric acid on the total phenolic content in fresh-cut kiwifruit

如圖2所示，4種樣品的總酚含量在前4 d基本沒有變化，4 d空白樣品和0.2 g/100 mL檸檬酸處理的樣品總酚含量開始增加，6 d時(shí)，0.1、0.2 g/100 mL檸檬酸處理的樣品總酚含量開始增加，而到了8 d，0.3 g/100 mL檸檬酸處理的樣品總酚含量才開始增加。酚類不僅導(dǎo)致果蔬的褐變，還與果蔬的成熟衰老有關(guān)，果蔬受到切割等傷害后，在酚類的代謝途徑中，刺激了更多酚類物質(zhì)的合成，從而導(dǎo)致了總酚的增加。第6天后，空白組與0.1、0.3 g/100 mL檸檬酸處理樣品間的差異均達(dá)到顯著差異（P＜0.05）。可見，檸檬酸處理有利于鮮切獼猴桃減緩總酚含量的增加，能有效減緩鮮切獼猴桃的衰老，其中0.3 g/100 mL檸檬酸的抑制總酚增加的效果最佳。

2.3 鮮切獼猴桃在貯藏過程中CAT活性的變化

CAT屬于血紅蛋白酶，它能催化植物體內(nèi)積累的過氧化氫分解為水和分子氧，從而減少H2O2對(duì)果蔬組織可能造成的氧化傷害。如圖3所示，鮮切獼猴桃中CAT的活性在2～4 d驟降，4～10 d期間基本沒變化，4組樣品總體變化趨勢(shì)基本相同，說明檸檬酸處理對(duì)延緩鮮切獼猴桃的CAT活性的下降無(wú)明顯作用。

圖3 不同質(zhì)量 濃度檸檬酸處理對(duì)鮮切獼猴桃CAT活性的影響Fig.3 Effect of treatments with different concentrations of citric acid on the CAT activity in fresh-cut kiwifruit

2.4 鮮切獼猴桃在貯藏過程中羥自由基清除率的變化

圖4 不同質(zhì)量濃度檸檬酸處理對(duì)鮮切獼猴桃羥自由基清除率的影響Fig.4 Effect of treatments with different concentrations of citric acid on the hydroxyl radical scavenging capacity of fresh-cut kiwifruit

如圖4所示，在貯藏期間4組鮮切獼猴桃的羥自由基清除率相近，整體呈下降趨勢(shì)，但變化趨勢(shì)并不明顯?？梢?，檸檬酸作為保鮮劑對(duì)羥自由基清除率幾乎沒有影響。羥自由基主要由H2O2產(chǎn)生，CAT等酶是主要清除該類羥自由基的酶類，可能由于空白和各處理組CAT活性的變化不明顯（圖3），導(dǎo)致了各組樣品的羥自由基的清除率沒有太大的區(qū)別。

2.5 鮮切獼猴桃在貯藏過程中APX活性的變化

圖5 不同質(zhì)量濃度檸檬酸處理對(duì)鮮切獼猴桃APX活性變化的影響Fig.5 Effect of treatments with different concentrations of citric acid on the APX activity in fresh-cut kiwifruit

APX是催化抗壞血酸與過氧化氫發(fā)生氧化-還原反應(yīng)系統(tǒng)的關(guān)鍵酶，利用抗壞血酸作為電子供體也過氧化物反應(yīng)，用以清除過氧化氫。在鮮切獼猴桃的貯藏期間，獼猴桃受到切割等傷害，激發(fā)了自身的保護(hù)機(jī)制，增強(qiáng)了清除過氧化氫的作用，造成APX活性的增加，并且在清除過氧化氫的過程中，利用了抗壞血酸，從而可能會(huì)導(dǎo)致抗壞血酸含量的減少[21]。由圖5可知，4種處理鮮切獼猴桃樣品APX的活性隨時(shí)間的延長(zhǎng)總體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。空白樣品在第6天開始迅速上升，0.2 g/100 mL檸檬酸處理的樣品APX活性上升最為緩慢，效果最佳。說明檸檬酸的處理有益于延長(zhǎng)鮮切獼猴桃抗氧化能力，減緩APX活性的暴發(fā)。

2.6 鮮切獼猴桃在貯藏過程中VC含量的變化

圖6 不同質(zhì)量濃度檸檬酸處理對(duì)鮮切獼猴桃VC含量變化的影響Fig.6 Effect of treatments with different concentrations of citric acid on the VC content in fresh-cut kiwifruit

測(cè)定并計(jì)算得標(biāo)準(zhǔn)曲線公式：y＝0.000 7 x＋0.000 4，R2＝0.999 8。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線可得樣品VC含量的變化，如圖6所示，在貯藏期間VC含量變化總體呈下降趨勢(shì)，VC是果蔬中重要的具有抗氧化活性的物質(zhì)[22]，隨著果蔬的衰老，抗壞血酸過氧化物酶含量增加，抗壞血酸的含量會(huì)逐漸降低，但經(jīng)過檸檬酸處理的樣品的VC含量變化較為緩慢，其原因也可能是因?yàn)闄幟仕崮茌^好地抑制APX的活性（圖5），減緩了VC含量的降低，與APX的活性變化一致。由圖6可見，鮮切獼猴桃經(jīng)0.2 g/100 mL檸檬酸處理，能更有效的減緩VC含量的下降。

2.7 鮮切獼猴桃在貯藏過程中還原力的變化

圖7 不同質(zhì)量濃度檸檬酸處理對(duì)鮮切獼猴桃還原力變化的影響Fig.7 Effect of treatments with different concentrations of citric acid on the reducing power of fresh-cut kiwifruit

如圖7所示，鮮切獼猴桃在貯藏前期還原力整體呈先上升趨勢(shì)，在第6天達(dá)到最大值，然后開始下降，第6天時(shí)，空白組明顯高于處理組，且空白組與0.1 g/100 mL檸檬酸處理達(dá)顯著差異（P＜0.05），可見0.1 g/100 mL檸檬酸處理的樣品還原力能更好的維持鮮切獼猴桃的還原力下降趨勢(shì)。由VC含量的降低（圖6）可知，還原力的變化不僅與VC有關(guān)，還可能與其他的抗氧化物質(zhì)的活性有關(guān)。經(jīng)過檸檬酸處理的鮮切獼猴桃對(duì)還原能力維持更有效，且經(jīng)過0.1 g/100 mL檸檬酸處理的鮮切獼猴桃還原能力變化最小。

2.8 鮮切獼猴桃在貯藏過程中SOD活性的變化

圖8 不同質(zhì)量濃度檸檬酸處理對(duì)鮮切獼猴桃SOD活性變化的影響Fig.8 Effect of treatments with different concentrations of citric acid on the SOD activity in kiwifruit

SOD能夠與CAT等酶共同作用有效清除超氧陰離子等自由基，從而清除果蔬中的活性氧對(duì)細(xì)胞膜系統(tǒng)的傷害，減少了自由基對(duì)有機(jī)體的傷害。SOD是一種抗性酶，在果蔬受到切割傷害后，會(huì)隨著機(jī)體受到刺激而上升。如圖8所示，在貯藏期間，空白樣品和0.2 g/100 mL檸檬酸處理的樣品開始都有上升的趨勢(shì)，第6天后，所有樣品的SOD的活性都開始下降，空白組的SOD活性相對(duì)處理組反而能夠較好的保持，其中0.2、0.3 g/100 mL檸檬酸處理組與空白組達(dá)到顯著差異（P＜0.05），說明檸檬酸處理可能并不能有效的保持鮮切獼猴桃的SOD活性。

3 討論與結(jié)論

果蔬經(jīng)過了去皮、切割等處理，使果蔬中活性氧的暴發(fā)，加速了膜脂的過氧化，從而導(dǎo)致了果蔬的氧化傷害，同時(shí)果蔬的抗氧化能力的下降，自由基清除率的下降，加速了果蔬衰老。經(jīng)過檸檬酸的處理，可以有效的減輕和抑制鮮切果蔬的抗氧化活性的變化，能夠較好的保持鮮切果蔬的品質(zhì)。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可看出，鮮切獼猴桃在貯藏期間的抗氧化能力受到多種酶的共同作用，檸檬酸處理能對(duì)很多抗性酶起到保護(hù)作用，能有效延緩果蔬的衰老；同時(shí)，經(jīng)過檸檬酸處理的鮮切獼猴桃抗氧化能力變化比未經(jīng)過處理的鮮切獼猴桃抗氧化能力變化緩慢，自由基的清除能力更強(qiáng)，特別是對(duì)APX、VC和總酚等活性物質(zhì)維持效果顯著，不同質(zhì)量濃度的檸檬酸處理效果相比，低質(zhì)量濃度0.1、0.2 g/100 mL檸檬酸處理效果更好。所以檸檬酸處理后有利于維持鮮切獼猴桃抗氧化物質(zhì)的活性和品質(zhì)，更能有效地延長(zhǎng)鮮切獼猴桃的貨架期。

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Changes in Antioxidant Properties and Antioxidant Compounds of Fresh-Cut Kiwifruit Treated with Citric Acid during Storage

LIU Cheng-hui, LIU Yi-wei, HU Wen-zhong*, JIANG Ai-li, GUO Wen-qian
(College of Life Science, Dalian Nationalities University, Dalian 116600, China)

The objective of this study was to investigate the changes in antioxidant activity and bioactive compounds in fresh-cut kiwifruit slices treated with 0.1, 0.2 or 0.3 g/100 mL citric acid in water during 10 days of storage at 10 ℃. Results showed that during the storage period, antioxidant capacity of fresh-cut kiwi fruit displayed a declining trend, slowly initially and then rapidly. At the same time, citric acid-treated kiwifruit slices exhibited a slow change in antioxidant properties than untreated samples. This study suggests that the antioxidant activity of fresh-cut kiwifruit can be well maintained during storage by citric acid pretreatment.

fresh-cut kiwi fruit; citric acid; antioxidant activity

TS255.36

A

1002-6630（2014）02-0292-05

10.7506/spkx1002-6630-201402057

2013-05-06

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAD38B05）；國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（30972038）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（DC12010302）

劉程惠（1979—），女，工程師，博士研究生，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。E-mail：liuchenghui@dlnu.edu.cn

*通信作者：胡文忠（1959—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。E-mail：hwz@dlnu.edu.cn