買買提?吐爾遜，陳 娟，古麗巴哈爾?達(dá)吾提，麥麥提江?熱麥提

（喀什師范學(xué)院化學(xué)與環(huán)境科學(xué)系，新疆 喀什 844000）

高效液相色譜-二極管陣列檢測法同時測定不同品種巴旦杏中槲皮素、山奈酚的含量

買買提?吐爾遜，陳 娟，古麗巴哈爾?達(dá)吾提，麥麥提江?熱麥提

（喀什師范學(xué)院化學(xué)與環(huán)境科學(xué)系，新疆 喀什 844000）

目的：建立用高效液相色譜-二極管陣列檢測法測定新疆不同品種巴旦杏仁中槲皮素、山奈酚含量的方法。方法：色譜柱：HC-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.4%磷酸溶液（55∶45，V/V）；檢測波長：360 nm；柱溫：30 ℃；流速：1.00 mL/min。結(jié)果：槲皮素和山奈酚分別在1.0～30 ?g/mL（r=0.999 3）和0.5～40 ?g/mL（r=0.999 8）質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，平均回收率分別為102.0%（相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.08%，n=5）和102.8%（相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.21%，n=5）。結(jié)論：該方法簡便、快速、有效、準(zhǔn)確、具有良好的重復(fù)性和回收率，可作為巴旦杏仁的質(zhì)量控制和評價。

反相高效液相色譜法；二極管陣列檢測器；巴旦杏；槲皮素；山奈酚

巴旦杏又名扁桃（Amygdalus communis L.），是薔薇科（Rosaceae）李亞科（Prunoideae）桃屬（Amygdalus L.）喬木，為世界上著名的木本油料樹和干果樹種，巴旦杏為維吾爾語名稱，也叫巴旦木，果肉干澀不能食用，主要吃巴旦杏的仁，營養(yǎng)價值高，有特殊的甜香風(fēng)味，是維吾爾人等少數(shù)民族傳統(tǒng)的健身滋補品。巴旦杏仁也作為一種常用的維吾爾藥食兩用珍品，具有強(qiáng)壯、健腦、潤腸、宣肺、明目的藥用功能，對氣管炎、高血壓、皮膚過敏、肺病、腸胃病有顯著療效[1-3]。新疆是我國栽培巴旦杏的唯一特產(chǎn)區(qū)。主要分布在天山以南，沿塔里木盆地邊緣的綠洲上，以喀什、和田、克州比較集中。巴旦杏有近40個品種，其中新疆就有近20個品種。品種之間差別較大，有大有小，皮有厚有薄。對巴旦杏的栽培技術(shù)及其總黃酮的測定已有研究[4-5]報道，尚未見用高效液相色譜方法同時分離測定不同品種巴旦杏仁中槲皮素、山奈酚含量的相關(guān)報道。本實驗以9個品種的巴旦杏仁作為研究對象，建立用高效液相色譜-二極管陣列檢測法測定不同品種巴旦杏仁中槲皮素、山奈酚含量的方法，以期為新疆巴旦杏的藥用價值研究及綜合開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

2012年9—10月分4批采購于喀什的新采摘帶皮巴旦杏，經(jīng)喀什師范學(xué)院生物與地理科學(xué)系司馬義教授鑒定。

槲皮素對照品（編號：100081）、山奈酚對照品（編號：29029） 中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈為色譜純，水為高純水，其他試劑均為分析純。

LC-20AT高效液相色譜儀（配有SPD-M20A二極管陣列檢測器、DGU-20A5在線脫氣機(jī)、LC-solution工作站）日本島津公司；KQ3200DE型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；XA-1型多功能粉碎機(jī) 江蘇姜堰市分析儀器廠；ZK-82B真空干燥箱 上海市實驗儀器總廠；BS224S型電子天平 德國賽多利斯公司；HC-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱 美國安捷倫公司。1.2 方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱：HC-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.4%磷酸溶液（55∶45，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：360 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 ?L。

1.2.2 對照品溶液的配制

準(zhǔn)確稱取槲皮素及山奈酚對照品各10.0 mg置于50 mL容量瓶中，用甲醇使其溶解并定容至刻度，搖勻，得200 ?g/mL槲皮素和山奈酚對照品標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。使用時根據(jù)需要混合并稀釋至所需質(zhì)量濃度。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：分別準(zhǔn)確吸取不同體積槲皮素及山奈酚標(biāo)準(zhǔn)儲備液于6個10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，在冰箱里保存（5 ℃）。配制6組混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度見表1。

表1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中槲皮素、山奈酚的質(zhì)量濃度Table1 Concentrations of quercetin and kaempferol in mixed standard solutiioonnss ?g/mL

1.2.3 樣品溶液的制備

將9個不同品種巴旦杏去皮放置在真空干燥箱里，80 ℃干燥4 h，用粉碎機(jī)粉碎后準(zhǔn)確稱取2.0 g，用濾紙包好后置于索氏提取器里，用石油醚回流8 h，放置室溫，自然干燥至近干，然后放在真空干燥箱里抽干，置于25 mL容量瓶中加70%甲醇浸泡1 h后，超聲兩次，每次20 min，中間間隔10 min，超聲兩次，每次20 min，用甲醇定容至25 mL，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過濾，濾液置于容量瓶存放控溫冰箱里（5 ℃）備用。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測波長的確定

利用二極管陣列檢測器能夠在一次運行中同時采集不同波長色譜圖的特點，結(jié)合參考文獻(xiàn)[6-8]，槲皮素和山奈酚在360 nm波長下色譜峰的峰形對稱，能夠達(dá)到定量分析要求。因此，確定360 nm作為檢測波長。

2.2 流動相的選擇

分別采用不同比例的甲醇-水、乙腈-水、甲醇-磷酸、乙腈-磷酸溶液為流動相[9-11]，對樣品的分離情況進(jìn)行考察，當(dāng)甲醇-0.4%磷酸（55∶45，V/V）時，槲皮素和山奈酚得到了明顯分離。在實驗過程中也嘗試了梯度洗脫，但是梯度洗脫后對分離度和檢出限沒有太大改善，而且容易發(fā)生基線漂移，所以，確定甲醇-0.4%磷酸（55∶45，V/V）為流動相。標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖，如圖1所示。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig.1 HPLC-PAD chromatograms of a mixture of quercetin and kaempferol standards

2.3 提取方法的選擇

考察乙醇熱回流索氏提取法、乙醇24 h浸泡法和甲醇超聲波提取法[12-17]。結(jié)果表明，先用石油醚索氏提取8 h，除油，殘渣干燥后再用70%甲醇浸泡1 h后，分兩次超聲提取，每次20 min的方法，對槲皮素和山奈酚的提取率最高，而且超聲波提取法操作簡便、提取率高[18-22]。故選擇浸泡1 h、超聲兩次、每次提取20 min。

2.4 線性關(guān)系和精密度實驗

表2 線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限Table2 Linear equations, correlation coefficients, linear ranges and limits of detection

采用單樣進(jìn)樣做定性實驗，用混合進(jìn)樣做定量實驗。在定量實驗中，分別精密吸取6組混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液20 ?L，從低質(zhì)量濃度到高質(zhì)量濃度按色譜條件測定其峰面積，每組重復(fù)3次，以對照品在混合標(biāo)液中的質(zhì)量濃度（ρ，?g/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（A）為縱坐標(biāo)，得到的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限（RSN=3）見表2。樣品及加標(biāo)樣品色譜圖見圖2。

圖2 樣品溶液（A）及加標(biāo)樣品（B）溶液色譜圖Fig.2 HPLC-PAD chromatograms of real sample (A) and spiked sample (B)

對6組混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液中選用槲皮素和山奈酚質(zhì)量濃度為10、5.0 ?g/mL的一組溶液進(jìn)行了5次重復(fù)測定，結(jié)果表明槲皮素和山奈酚的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為0.81%、1.76%。

2.5 穩(wěn)定性實驗

取供試品溶液，在8 h內(nèi)每隔2 h進(jìn)樣1次，進(jìn)樣量20 ?L，測定槲皮素、山奈酚的峰面積的RSD分別為1.22%、2.10%。結(jié)果表明：供試品溶液在8 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.6 加標(biāo)回收率實驗

準(zhǔn)確稱取已知槲皮素、山奈酚含量的紙皮巴旦杏仁樣品5份，前3份每份1.0 g左右，后兩份每份2.0 g左右，分別添加不同量的槲皮素、山奈酚標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.2.3節(jié)方法制備加標(biāo)樣品溶液，按規(guī)定的色譜條件進(jìn)行測定，測定結(jié)果見表3。槲皮素和山奈酚平均回收率分別為102.0%、102.8%。

表3 方法回收率和精密度（n==55）Table3 Recovery and precision of the method (n == 55))

2.7 樣品含量測定結(jié)果

精密吸取準(zhǔn)備好的9個品種巴旦杏仁樣品溶液，手動進(jìn)樣，并按1.2.1節(jié)色譜條件進(jìn)行平行3次測定，外標(biāo)法計算樣品中槲皮素、山奈酚的含量。測定結(jié)果見表4。不同品種巴旦杏仁中槲皮素和山奈酚的含量有一定差別，其中雙仁巴旦杏仁和開西巴旦杏人中槲皮素的含量較高，而小石頭巴旦杏仁和雙軟巴旦杏仁中山奈酚的含量較高。

表4 不同品種巴旦杏仁中槲皮素、山奈酚的測定結(jié)果（n==33）Table4 Contents of quercetin and kaempferol in almond kernels from different varieties (

3 討 論

新疆作為我國著名的瓜果之鄉(xiāng)，其獨特的自然環(huán)境培育出了獨特的干果和水果。巴旦杏是新疆人熟悉的干果，也是饋贈佳品。巴旦杏品種繁多，市場上出售的約有10多個品種[23-25]。本實驗建立了用高效液相色譜-二極管陣列檢測法測定新疆不同品種巴旦杏仁中槲皮素、山奈酚含量的方法，并選用9個品種的巴旦杏作為實驗材料，對其所含的槲皮素和山奈酚含量進(jìn)行了測定。結(jié)果表明，在不同品種巴旦杏仁中槲皮素和山奈酚的含量有一定差別，其中雙仁巴旦杏仁和開西巴旦杏人中槲皮素的含量較高，而在小石頭巴旦杏仁和雙軟巴旦杏仁中山奈酚的含量較高。這種個體差異一方面是因為品種之間存在著差異，另一方面由不同的生長環(huán)境引起的差異。本實驗考察不同的提取條件、色譜條件，同時對方法的精密度、穩(wěn)定性及加標(biāo)回收率等進(jìn)行了考察，結(jié)果表明該方法簡便、準(zhǔn)確、可靠，適于測定巴旦杏仁中槲皮素和山奈酚的含量。

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Determination of Quercetin and Kaempferol in Different Varieties of Almond Kernels (Amygdalus communis L.) by HPLC-PAD

Mamat?TURSON, CHEN Juan, Gulbahar?DAWUT, Mamatjan?RAMAT
(Department of Chemistry and Environmental Science, Kashigar Teacher’s College, Kashigar 844000, China)

The contents of quercetin and kaempferol in almond kernels (Amygdalus communis L.) from different varieties were determined by a reversed phase high-performance liquid chromatography fitted with a photodiode array detector (RP-HPLC-PAD) and an Agilent HC-C18column (5 μm, 250 mm × 4.6 mm i.d.). The mobile phase used was a mixture of CH3OH-0.4%H3PO4(55:45, V/V) with a flow rate of 1.0 mL/min, and the detection wavelength was set to 360 nm. There was a good linear relationship for quercetin in the range of 1–30 ?g/mL (r = 0.999 3) and kaempferol in the range of 0.5-40 ?g/mL (r = 0.999 8). The average recovery rates for quercetin and kaempferol were 102.0% (RSD = 2.08%, n = 5) and 102.8% (RSD = 2.21%, n = 5), respectively. This analytical method was simple, rapid, sensitive and accurate, and could be used to determine quercetin and kaempferol in almond kernels with good repeatability and recovery rate.

RP-HPLC; PAD; almond (Amygdalus communis L.); quercetin; kaempferol

R284.1

A

1002-6630（2014）02-0182-04

10.7506/spkx1002-6630-201402034

2013-04-24

中國科學(xué)院“西部之光”計劃項目（RCPY201007）

買買提?吐爾遜（1971—），男，副教授，碩士，研究方向為中藥分析及色譜分離。E-mail：maimat@163.com