張 鏡,葉春飛
(嘉應(yīng)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,廣東 梅州 514015)
陰香花中原花青素的提取工藝
張 鏡,葉春飛
(嘉應(yīng)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,廣東 梅州 514015)
優(yōu)化陰香花中原花青素的提取工藝。以經(jīng)冷凍干燥、粉碎與80目過篩的陰香花粉末為供試物料,丙酮-乙醇混合提取,提取液以鐵鹽催化顯色,測定反應(yīng)體系的吸光度。在提取溶劑體積分?jǐn)?shù)、pH值、料液比、溫度及時間單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化提取條件。結(jié)果表明:以體積分?jǐn)?shù)70%的混合液(70%丙酮-70%乙醇(3∶2))為提取溶劑、pH 2、料液比1∶7.5(g/mL)、提取 溫度50 ℃、提取時間2 h提取陰香花原花青素的效果為佳,以此參數(shù)條件下提取3次原花青素的提取率為95.37%、得率為9.02%。丙酮是陰香花原花青素提取的有效溶劑,采用優(yōu)化提取條件可有效的提取陰香花原花青素。
陰香花;原花青素;提取工藝
陰香(Cinnamomum burmannii)為多年生常綠喬木,國內(nèi)主要分布于廣東、福建等省區(qū),其根、莖、葉都可提取藥用成分與制造香精等產(chǎn)品的化工原料,樹干材質(zhì)優(yōu)良可用于家具、建筑及室內(nèi)裝飾等[1-2],是多用途的經(jīng)濟(jì)林木樹種。陰香樹形優(yōu)美,亦具有良好的保水、保濕功能,是華南地區(qū)行道與園林綠化的常見樹種,且近年大量用于水源涵養(yǎng)林種植。而且在素有“冬季天然溫室”之稱的廣東境內(nèi),陰香樹的果實(shí)產(chǎn)量高,果實(shí)中富含花色苷、原花青素、果膠、油脂類等多種具開發(fā)利用價值的天然產(chǎn)物[3-4]。另外,陰香樹花量極大,每年3月底至4月初開花時樹冠幾乎全部為花序覆蓋。筆者研究發(fā)現(xiàn)陰香花中亦含豐富的原花青素類天然活性物質(zhì),亦具有重要的開發(fā)利用潛力,但迄今國內(nèi)外未見有相關(guān)的研究報道。研究陰香花原花青素的提取工藝不僅可為陰香花中原花青素的資源化開發(fā)利用積累研究資料,亦有助于進(jìn)一步認(rèn)識陰香樹的綜合利用價值。
1.1 材料與試劑
采集即將開花的陰香花序,冷凍干燥、粉碎、80目過篩后低溫保存?zhèn)溆谩?/p>
乙醇、丙酮、甲醇、鹽酸、乙酸乙酯、正丁醇、硫酸鐵銨均為分析純。
1.2 儀器與設(shè)備
JLL28-B低速大容量多管離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;BT2K XL凍干機(jī) 美國VirTis公司;U-2800紫外-可見分光光度計 日本日立公司;PHS-2C 酸度計 上海滬西分析儀器廠;FA1604A 電子分析天平 上海精天電子儀器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 提取效果測定方法
取1 mL原花青素提取液于比色管中,依次加入6 mL的正丁醇-鹽酸(95∶5,V/V)溶液及0.2 mL 2%硫酸鐵銨溶液,沸水浴40 min后迅速冷卻,以蒸餾水代替樣液為參比,測定546 nm波長處的吸光度[5],以546 nm波長處的吸光度(A546nm)為衡量提取效果的依據(jù)。
1.3.2 提取溶劑篩選
1.3.2.1 提取溶劑與原花青素提取的效果關(guān)系
準(zhǔn)確稱取500 mg陰香花粉末,分別加入70%乙醇、70%甲醇、70%丙酮、乙酸乙酯、無水乙醇、無水甲醇、無水丙酮及水,料液比1∶10(g/mL)、30 ℃提取2 h,4 500 r/min離心20 min,收集上清液,蒸餾水定容100 mL,正丁醇-鹽酸法顯色,測定A546nm。
1.3.2.2 乙醇-丙酮比例對原花青素提取效果的影響
準(zhǔn)確稱取500 mg陰香花粉末,70%丙酮-70%乙醇按1∶1、2∶3、3∶2、4∶1及1∶4體積比混合作為原花青素提取用溶液,按料液比1∶10(g/mL)、30 ℃提取2 h,4 500 r/min離心20 min,收集上清液,蒸餾水定容100 mL,正丁醇-鹽酸法顯色,測定A546nm。
1.3.3 單因素試驗(yàn)
1.3.3.1 提取溶劑
準(zhǔn)確稱取500 mg陰香花粉末,以70%丙酮-70%乙醇(3∶2,V/V)比例混合液為原花青素提取溶劑。物料按1∶10(g/mL)的料液比分別加入40%、50%、60%、70%、80%、90%及100%的提取溶劑,30 ℃、提取2 h,4 500 r/min離心20 min,收集上清液,蒸餾水定容100 mL,正丁醇-鹽酸法顯色,測定A546nm。
1.3.3.2 提取時間
準(zhǔn)確稱取500 mg陰香花粉末,按料液比1∶10(g/mL)加入60%的混合溶劑,30 ℃、分別提取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h及3 h,4 500 r/min離心20 min,收集上清液,蒸餾水定容100 mL,正丁醇-鹽酸法顯色,測定A546nm。
1.3.3.3 提取料液比
準(zhǔn)確稱取500 mg陰香花粉末,分別以料液比1∶5、1∶7.5、1∶10、1∶12.5、1∶15、1∶17.5(g/mL)加入60%混合溶劑,30 ℃、提取2 h,4 500 r/min、離心20 min,收集上清液,蒸餾水定容100 mL,正丁醇-鹽酸法顯色,測定A546nm。
1.3.3.4 提取液pH值
準(zhǔn)確稱取500 mg陰香花粉末,以料液比1∶10比例分別加入以HCl或NaOH調(diào)pH值為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0及14.0體積分?jǐn)?shù)60%的混合溶劑,30 ℃、提取2 h,4 500 r/min離心20 min,收集上清液,蒸餾水定容100 mL,正丁醇-鹽酸法顯色,測定A546nm。
1.3.3.5 提取溫度
準(zhǔn)確稱取500 mg陰香花粉末,以料液比1∶10的比例加入60%混合溶劑,分別于30、40、50、60 ℃提取2 h,4 500 r/min離心20 min,收集上清液,蒸餾水定容100 mL,正丁醇-鹽酸法顯色,測定A546nm。
1.3.4 提取參數(shù)正交優(yōu)化
根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,選擇提取溶劑體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取溫度、提取時間4個因素進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn),正交試驗(yàn)設(shè)計見表1。
表1 提取參數(shù)正交試驗(yàn)因素與水平Table1 Coded levels for independent variables used in orthogonal array design for optimization of extraction parameters
1.3.5 原花青素的得率
準(zhǔn)確稱取500 mg陰香花粉末,按照優(yōu)化條件下離心收集上清液,蒸餾水定容100 mL,正丁醇-鹽酸法顯色,測定A546nm值。重復(fù)提取5次,以下式計算每次提取原花青素的累計提取得率[5]:
式中:A546nm為546 nm波長處吸光度;V為稀釋倍數(shù);m為樣品質(zhì)量/mg。
1.4 數(shù)據(jù)處理
各處理重復(fù)3次,SPSS 11.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,3次數(shù)據(jù)平均值以Excel作圖,以Duncans’法進(jìn)行差異顯著性分析,P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。
2.1 溶劑篩選
2.1.1 不同溶劑對原花青素的提取效果
由圖1可以看出,供試溶劑中以70%丙酮溶液的提取效果最佳,吸光度為0.776,與其余處理的差異極顯著(P<0.01)。70%乙醇及70%甲醇次之,兩者間無顯著差異,提取液的吸光度分別為70%丙酮溶液的27.98%及26.24%。乙酸乙酯、無水乙醇、無水甲醇及無水丙酮的提取效果極差,提取液呈青綠色。水與物料浸泡后呈黏性膠狀,不能固液分離,其吸光度按0.000計算。陰香花中膠體物質(zhì)的吸水量大,吸水后為黏性膠體,與果實(shí)膠體特性一致[4],但迄今尚未見植物花中存在大量吸水力強(qiáng)的膠物質(zhì)的報道。植物材料中的原花青素現(xiàn)多用70%左右的乙醇溶液浸取[6-7],但70%乙醇溶液提取陰香花原花青素的實(shí)用價值不大。雖然70%丙酮溶液提取陰香原花青素具有很好的效果,但丙酮的毒性較大,從安全性考慮若適當(dāng)降低丙酮用量并能獲得較好的提取效果,則生產(chǎn)應(yīng)用價值更大。
圖1 不同溶劑對原花青素的提取效果Fig.1 Effects of different solvents on the extraction efficiency of proanthocyanidins
2.1.2 丙酮-乙醇比例對提取原花青素效果的影響
圖2 70%丙酮與70%乙醇比例對原花青素提取效果的影響Fig.2 Effects of different ratios between 70% acetone and 70% ethanol on the extraction efficiency of proanthocyanidins
由圖2可以看出,以丙酮-乙醇3∶2及4∶1溶液的提取效果為佳,提取液吸光度分別為0.694和0.728,兩者差異不顯著。丙酮-乙醇3∶2及4∶1溶液提取液吸光度較70%乙醇溶液原花青素提取液的吸光度高165.38%及180.77%,較70%丙酮溶液原花青素提取液的吸光度低11.45%及6.41%。丙酮-乙醇比例為1∶1、2∶3和1∶4比例的效果較差,吸光度與前2比例的差異顯著(P<0.05)??紤]到丙酮-乙醇3∶2及4∶1溶液的提取效果較好,且兩者差異不顯著因,考慮丙酮用量以下試驗(yàn)采用均丙酮-乙醇為3∶2比例的混合液對提取原花青素進(jìn)行提取。
2.2 丙酮-乙醇混合溶劑體積分?jǐn)?shù)對提取效果的影響
由圖3可以看出,隨丙酮-乙醇混合液體積分?jǐn)?shù)的提高,提取液的吸光度逐漸增大。以60%及70%混合液提取,提取液的吸光度分別為0.715與0.737,兩者無顯著差異,混合溶劑體積分?jǐn)?shù)高于70%提取液的吸光度逐漸下降,原花青素的提取效果降低。結(jié)果表明較低體積分?jǐn)?shù)的丙酮-乙醇混合溶劑更利于原花青素的提取。提取溶劑體積分?jǐn)?shù)過高,極性較低,物料中極性較高物質(zhì)的溶解度小而阻礙了原花青素的溶出,也可能直接影響了原花青素從物料中溶出,導(dǎo)致原花青素提取效果不佳。江巖[8]認(rèn)為高濃度乙醇提取原花青素提取效果不佳的原因可能是一些醇溶性雜質(zhì)和親脂性強(qiáng)的成分溶出量增加,從而導(dǎo)致原花青素的提取率降低。故以下試驗(yàn)選擇60%的丙酮-乙醇混合溶劑。
圖3 溶劑體積分?jǐn)?shù)對原花青素的提取效果Fig.3 Effect of extraction solvent concentration on the extraction efficiency of proanthocyanidins
2.3 提取時間對提取效果的影響
圖4 提取時間對原花青素提取效果的影響Fig.4 Effect of extraction time on the extraction efficiency of proanthocyanidins
由圖4可以看出,提取時間30 min及60 min時原花青素溶出量較少,90~180 min時原花青素溶出量大,其中120 min提取液的吸光度0.756為最大,但提取液的吸光度與90 min及180 min均差異不顯著。一般植物材料中原花青素的提取隨時間的延長,提取率增大,但時間過長提取液中原花青素的分解而逐漸下降,如木槿花、荔枝皮原花青素的提取[9-10],而180 min提取陰香花原花青素提取液的吸光度較90 min的吸光度無顯著差異,表明其穩(wěn)定性較高。
2.4 pH值對提取效果的影響
由圖5可以看出,溶液pH 1提取的提取液的吸光度0.730、pH 2的吸光度0.763,相對較高,兩者間無顯著差異。pH 3~10提取液的吸光度略有下降,pH 11~14內(nèi)隨pH值的升高,提取液的吸光度大幅降低,提取液為黃褐色。結(jié)果表明:pH 1~2時陰香花原花青素的提取更佳,但在弱酸、弱堿條件下也能獲得較好的效果,僅強(qiáng)堿條件(pH 13~14)對提取極不利,表明陰香花原花青素的酸堿穩(wěn)定性較好。
圖5 pH值對提取效果的影響Fig.5 Effect of pH on the extraction efficiency of proanthocyanidins
2.5 料液比對提取效果的影響
圖6 不同料液比與原花青素提取效果的關(guān)系Fig.6 Effect of solid/liquid ratio on the extraction efficiency of proanthocyanidins
由圖6可以看出,料液比在1∶5~1∶10間隨溶劑用量的增大,提取液的吸光度大幅升高,差異極顯著。料液比1∶10~1∶17.5間提取液吸光度的差值減小,無顯著差異。雖然料液比小于1∶10提取液的吸光度仍有小幅增大,但溶劑消耗量大幅上升,提取液后續(xù)干燥的費(fèi)用明顯加大,因而1∶10的料液比更實(shí)用。雖然料液比與陰香花原花青素提取效果的關(guān)系與地榆根原花青素提取的料液比相當(dāng)[11],但陰香花中含有較多的膠體物質(zhì),物料性質(zhì)與其有明顯的區(qū)別,70%乙醇溶液以1∶10的料液比對陰香花原花青素的提取效果卻很差。
2.6 提取溫度對提取效果的影響
圖7 提取溫度與原花青素提取效果的關(guān)系Fig.7 Effect of extraction temperature on the extraction efficiency of proanthocyanidins
由圖7可以看出,提取液的吸光度隨溫度升高而增加,當(dāng)提取溫度為50 ℃時提取效率最高,提取液的吸光度較加熱30、40、60 ℃提取液的吸光度差異極顯著。60 ℃加熱2 h提取液的吸光度明顯下降,可能是陰香花原花青素的熱穩(wěn)定性較差,加熱時間較長使部分溶出的原花青素的結(jié)構(gòu)被破壞。溫度與陰香花原花青素提取效果的關(guān)系與多數(shù)文獻(xiàn)報道的研究結(jié)果接近[12]。
2.7 正交試驗(yàn)
根據(jù)單因素試驗(yàn)選擇料液比、時間、溫度及提取溶液體積分?jǐn)?shù)四因素三水平L9(34)進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化,結(jié)果見表2。由表2看出,各因素對原花青素提取效果的影響,由大到小依次為料液比>提取時間>提取溫度>提取溶液體積分?jǐn)?shù),各因素與水平的最佳組合為A2B3C2D1,即提取溫度50 ℃、提取時間2 h、丙酮-乙醇混合液積分?jǐn)?shù)70%、料液比1∶7.5。
表2 正交試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果Table2 Orthogonal array design and corresponding results
表3 方差分析結(jié)果Table3 Analysis of variance for the experiment results of orthogonal array design
2.8 提取次數(shù)對提取效果的影響實(shí)驗(yàn)
從圖8可以看出,經(jīng)2次及3次浸提原花青素提取率分別為89.07%與95.37%,即3次提取后物料中絕大部分原花青素已被提出,而第4及5次提取液的吸光度已很低,提取獲得的原花青素量極少,第5次提取液顯色后僅淡紅色。經(jīng)2次及3次提取原花青素的得率分別為8.34%及9.02%,全部5次提取原花青素的累計得率達(dá)9.53%,表明陰香花原花青素經(jīng)2~3次浸提即可。
圖8 提取次數(shù)與原花青素的提取率及得率的關(guān)系Fig.8 Effect of number of repeated extractions on the recovery and content of proanthocyanidins in dried flowers of Cinnamomum burmannii
3.1 陰香花原花青素提取的工藝參數(shù)
經(jīng)單因素和正交試驗(yàn)表明,陰香花原花青素提取的最佳條件為溫度50 ℃、時間2 h、提取液為70%丙酮和70%乙醇3∶2混合液(pH 2)、料液比1∶7.5,2次提取原花青素的提取率達(dá)90%。
3.2 丙酮作為陰香花原花青素提取的有效溶劑
目前植物活性成分提取主要用乙醇溶液為提取液。但陰香花物料以70%以下乙醇溶液浸泡呈黏性膠體,不能固液分離,而無水乙醇對原花青素的提取效果很差,故陰香花原花青素難以乙醇為溶劑提取。研究表明70%丙酮溶液及60%的丙酮-乙醇混合液(混合液由70%丙酮∶70%乙醇按3∶2比例組成)提取原花青素的效果好,表明丙酮提取對原花青素的作用大。
3.3 陰香花原花青素的開發(fā)潛力
原花青素是高效自由基清除與抗氧化活性[3,13]的天然產(chǎn)物,具有增強(qiáng)免疫、抗菌、抗衰老、降低血漿膽固醇等多文獻(xiàn)的醫(yī)療保健作用[14-22],已在功能性食品與保健品行業(yè)大量使用。陰香花原花青素的含量達(dá)9.37%,經(jīng)2次及3次提取原花青素的得率分別為8.34%及9.02%,而木槿花、藍(lán)莓葉的原花青素分別為2.63%及4.17%[9,23]。植物花中均含有多種活性成分,可以推測陰香花除原花青素外,還有多種活性物質(zhì)。另外,陰香為華南沿海省、區(qū)鄉(xiāng)土常綠樹種且花產(chǎn)量大、不用精細(xì)栽植管理,又系廢棄的自然資源,以陰香花開發(fā)具有醫(yī)療保健功能的天然活性物質(zhì)具一定的潛力。
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Extraction of Proanthocyanidins from Flowers of Cinnamomum burmannii
ZHANG Jing, YE Chun-fei
(College of Life Science, Jiaying University, Meizhou 514015, China)
This study was undertaken to optimize the extraction of proanthocyanidins from flowers of Cinnamomum burmannii. The starting raw material, freeze-dried flowers of Cinnamomum burmannii ground and sieved through a 80-mesh sieve, was extracted using acetone-ethanol and the extract was submitted to color development catalyzed by iron salt before measuring the absorbance. Five extraction conditions including extractant concentration, pH, solid-to-solvent ratio, temperature and time were optimized by one-factor-at-a-time and orthogonal array design methods. The optimal extraction efficiency was obtained by three repeated cycles of extraction at 50 ℃ for 2 h using an extractant consisting of 70% acetoneethanol in water, as prepared by mixing 70% acetone and 70% ethanol with a volume ratio of 3:2, with a solid-to-solvent ratio of 1:7.5 (g/mL). Under these conditions, the proanthocyanidin recovery was 95.37%, and the proanthocyanidin content in dried flowers of Cinnamomum burmannii was 9.02%. Thus acetone is an effective solvent for extracting proanthocyanidins from flowers of Cinnamomum burmannii under optimized conditions.
flower of Cinnamomum burmannii; proanthocyanidins; extraction process
Q946.836
A
1002-6630(2014)02-0115-05
10.7506/spkx1002-6630-201402021
2013-07-15
廣東省科技計劃項目(2009B011300015)
張鏡(1957—),男,教授,碩士,研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物與應(yīng)用微生物。E-mail:zhangcqf@jyu.edu.cn