潘利華，王建飛，葉興乾，羅建平,*

（1.合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽 合肥 230009；2.浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058）

藍(lán)莓花青素的提取工藝及其免疫調(diào)節(jié)活性

潘利華1,2，王建飛1，葉興乾2，羅建平1,*

（1.合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽 合肥 230009；2.浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058）

采用單因素試驗(yàn)和五元二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化藍(lán)莓花青素的提取工藝，并通過(guò)體外細(xì)胞培養(yǎng)評(píng)價(jià)藍(lán)莓花青素對(duì)脾細(xì)胞增殖活力以及協(xié)同ConA促進(jìn)小鼠脾細(xì)胞分泌干擾素-α和白細(xì)胞介素-2的活性。結(jié)果表明：乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取溫度和提取時(shí)間對(duì)藍(lán)莓花青素提取率有顯著影響；藍(lán)莓花青素最佳提取工藝條件為：酒石酸為酸化劑、乙醇體積分?jǐn)?shù)74.6%～76.2%、料液比1∶6.6～1∶6.8（g/mL）、浸提溫度52.5～53.4 ℃、浸提液pH 3.0～3.1、浸提時(shí)間144.8～148.5 min，此工藝條件下藍(lán)莓花青素的提取率均大于35 mg/g，具有促進(jìn)小鼠脾細(xì)胞增殖和協(xié)同ConA促進(jìn)小鼠脾細(xì)胞分泌干擾素-α和白細(xì)胞介素-2活性，且呈一定的劑量相關(guān)性。

藍(lán)莓；花青素；正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)；免疫調(diào)節(jié)活性

藍(lán)莓是杜鵑花科（Ericaceae）越橘屬（Vaccinium spp.）多年生常綠灌木果樹(shù)，原產(chǎn)于加拿大東部和美國(guó)東北部[1]。經(jīng)過(guò)100多年的栽培馴化，藍(lán)莓已成為一個(gè)世界性的果樹(shù)新產(chǎn)業(yè)，在中國(guó)、蒙古北部、前蘇聯(lián)、歐洲、北美等國(guó)家和地區(qū)均有分布[2]。藍(lán)莓果實(shí)中富含的花青素，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗氧化、促進(jìn)視紅素再合成、抗心血管疾病、抗衰老等多種生理活性功能，在食品、化妝品、藥品等領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景[3-7]。

提取是藍(lán)莓花青素功能產(chǎn)品研發(fā)與應(yīng)用的關(guān)鍵步驟之一[8]。溶劑萃取法是提取花青素的傳統(tǒng)方法，這是由于花青素主要以花青素糖苷形式存在于自然界中，具有較強(qiáng)的極性[9-10]。常用的溶劑主要有甲醇、乙醇等親水性有機(jī)溶劑，石油醚、乙酸乙酯等親脂性有機(jī)溶劑和水。為提高花青素的溶出率，通常在提取劑中加少量的鹽酸、磷酸等無(wú)機(jī)酸或醋酸、檸檬酸等有機(jī)酸[11-12]。但是Revilla等[13]研究表明，當(dāng)提取液中鹽酸濃度高于0.12 mol/L時(shí)，會(huì)造成紅葡萄花青素發(fā)生部分水解。所以，為了既能提高花青素的溶出率，又能最大程度地保持其穩(wěn)定，人們開(kāi)始采用有機(jī)酸酸化的有機(jī)溶劑提取花青素。本實(shí)驗(yàn)在評(píng)價(jià)有機(jī)酸和無(wú)機(jī)酸對(duì)藍(lán)莓花青素提取效果影響的基礎(chǔ)上，對(duì)有機(jī)酸酸化乙醇的藍(lán)莓花青素提取工藝參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，并評(píng)價(jià)了提取產(chǎn)品藍(lán)莓花青素的免疫調(diào)節(jié)活性，旨在為藍(lán)莓花青素深加工產(chǎn)品的研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍(lán)莓果（兔眼藍(lán)莓巴爾德溫栽培種果實(shí)） 安徽徽王食品有限公司；雄性BALB/c小鼠（8～10周，體質(zhì)量（20±2）g） 安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心；小鼠酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定干擾素-α（interferon-α，F(xiàn)N-α）、白細(xì)胞介素-2（interleukin-2，IL-2）試劑盒 南京建成科技有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基 默賽飛世爾科技有限公司；矢車(chē)菊素3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)Sigma公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

CT15RT型高速冷凍離心機(jī) 上海天美科學(xué)儀器有限公司；Hei-VAP Advantage型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國(guó)Heidolph公司；V1100型可見(jiàn)光分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司；LGJ-18S型原位真空冷凍干燥機(jī) 北京松源華興科技發(fā)展有限公司；SW-CJ-1FD型超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；MCO-17AIC型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱 日本三洋公司；Model 680型酶標(biāo)儀 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 藍(lán)莓花青素的提取

首先用組織搗碎機(jī)將藍(lán)莓鮮果搗碎成藍(lán)莓糊，再置于提取瓶中，加入一定量的酸化乙醇浸提液，然后在一定溫度條件下浸提一定時(shí)間，得到浸提液；將浸提液在10 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min，取上清液后測(cè)定其花青素含量。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

精確稱取藍(lán)莓鮮果500 g，搗碎成藍(lán)莓糊，加入一定體積的浸提液。設(shè)定乙醇體積分?jǐn)?shù)65%、料液比（冷凍鮮果質(zhì)量與提取劑體積之比）1∶4、浸提溫度50 ℃、浸提液pH 4.0、浸提時(shí)間60 min，固定其他條件，分別探討酸化劑、浸提液中乙醇體積分?jǐn)?shù)、浸提料液比、浸提溫度、浸提液pH值、浸提時(shí)間對(duì)藍(lán)莓花青素提取率的影響。

1.3.3 二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)、浸提料液比、浸提溫度、浸提液pH值、浸提時(shí)間共5個(gè)因素為研究對(duì)象，按照五因素四水平（1/2）實(shí)施二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)，因素水平編碼表如表1所示[14]。

表1 二次正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)因素編碼水平表Table1 Coded levels for independent variables used in orthogonal rotation combination design

1.3.4 藍(lán)莓花青素的提取率測(cè)定

采用雙波長(zhǎng)pH值示差法[15]，以矢車(chē)菊素3-O-葡萄糖苷為參照。取待測(cè)液1 mL，加入NaAc-HAc緩沖溶液（pH 4.5，0.4 mol/L）或KCl-HCl緩沖溶液（pH 1.0，0.25 mol/L）9 mL，搖勻，轉(zhuǎn)入光路長(zhǎng)為1 cm的比色皿中，以蒸餾水代替樣品溶液做空白對(duì)照，分別在510 nm和700 nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度(optical density，OD)。

花青素提取率/（mg/g）=A×Mw×DF×100/（ε×1）

式中：A=（OD510nm，pH1.0－OD700nm，pH1.0）－（OD510nm，pH4.5－OD700nm，pH4.5；Mw=449.2 g/mol，矢車(chē)菊素-3-葡萄糖苷的摩爾質(zhì)量；DF為待測(cè)液稀釋倍數(shù)；ε=26 900 L/（mol·cm），矢車(chē)菊素-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數(shù)。

1.3.5 藍(lán)莓花青素的免疫調(diào)節(jié)活性評(píng)價(jià)

取1.3.1節(jié)藍(lán)莓花青素的提取中得到的上清液，通過(guò)AB-8大孔吸附樹(shù)脂吸附，再用體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇解吸，收集解吸液；解吸液冷凍干燥得到花青素干粉，根據(jù)試驗(yàn)需要配制花青素溶液。

頸錐脫臼法處死小鼠，制備脾細(xì)胞懸液并調(diào)整其細(xì)胞濃度為1×108cells/L。取96孔培養(yǎng)板，每孔先加脾細(xì)胞懸液100 ?L，空白對(duì)照組再加入100 ?L RPMI-1640培養(yǎng)基；陽(yáng)性對(duì)照組再加入50 ?L RPMI-1640培養(yǎng)基和50 ?L ConA（Concanavalin A）溶液（ConA用RPMI-1640培養(yǎng)基配制，終質(zhì)量濃度為2.5 mg/L，下同）；樣品組再分別加入50 ?L花青素溶液（花青素用RPMI-1640培養(yǎng)基配制，終質(zhì)量濃度分別為25、50、100 mg/L）和50 ?L ConA溶液（ConA終質(zhì)量濃度為2.5 mg/L）；每組3孔，每孔終體積200 ?L。將培養(yǎng)板置于37 ℃含5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d。取樣檢測(cè)前4 h向每孔中加入50 ?L的噻唑藍(lán)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后3 000 r/min離心10 min，收集上清，按IFN-α、IL-2測(cè)定試劑盒標(biāo)準(zhǔn)操作程序于酶標(biāo)儀上測(cè)定IFN-α和IL-2含量。離心管底部的藍(lán)色沉淀用100 ?L的二甲基亞砜充分振蕩溶解后于酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD，以O(shè)D值表示脾細(xì)胞增殖活性[16-17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 酸化劑對(duì)藍(lán)莓花青素提取率的影響

圖1 酸化劑對(duì)提取率的影響Fig.1 Effect of acidulants on the extraction efficiency of anthocyanins

由圖1表明，與對(duì)照組相比，有機(jī)酸和無(wú)機(jī)酸都提高了藍(lán)莓花青素的提取率，酸化劑處理組提取率為對(duì)照組的1.1～1.5倍，且以有機(jī)酸酒石酸或無(wú)機(jī)酸鹽酸為酸化劑時(shí)，藍(lán)莓花青素的提取率最高，分別為33.54 mg/g和32.82 mg/g。鹽酸和酒石酸為酸化劑時(shí)，藍(lán)莓花青素提取率無(wú)顯著差異（P＞0.05），但鹽酸的腐蝕性明顯強(qiáng)于酒石酸，且鹽酸易造成花青素的降解[13]。因此，本實(shí)驗(yàn)以酒石酸酸化的乙醇作為提取劑。

2.1.2 提取劑中乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)藍(lán)莓花青素提取率的影響

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)花青素提取率的影響Fig.2 Effect of exthanol concentration on the extraction efficiency of anthocyanins

由圖2可見(jiàn)，以酒石酸酸化的乙醇為提取劑，固定其他因素不變，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為25%～65%之間時(shí)，提取率隨著提取劑中乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大不斷增高；乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%時(shí)，藍(lán)莓花青素提取率達(dá)到最大值33.26 mg/g；但是，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的繼續(xù)增大，藍(lán)莓花青素提取率反而降低。藍(lán)莓花青素屬于黃酮類物質(zhì)，由花青素苷元與花青素糖苷組成，可溶于水、乙醇等極性溶劑，當(dāng)提取劑的極性和花青素極性相近時(shí)，花青素在提取劑中的溶解性最好，溶出率最大；但當(dāng)乙醇提取分?jǐn)?shù)繼續(xù)增大時(shí)，提取劑極性相對(duì)變小，偏離了藍(lán)莓花青素的極性，從而降低了花青素的溶出，因此，提取率反而有所下降[12,18]?？梢?jiàn)，提取劑中乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%時(shí)，其極性最相近花青素的極性，有利于藍(lán)莓花青素的溶出。

2.1.3 料 液比對(duì)藍(lán)莓花青素提取率的影響

圖3 料液比對(duì)花青素提取率的影響Fig.3 Effect of solid-to-liquid ratio on the extraction efficiency of anthocyanins

由圖3可知，固定其他因素不變，當(dāng)料液比在1∶2～1∶6（g/mL）時(shí)，藍(lán)莓花青素提取率隨著液料比的增加而提高，這是由于提取液使用量的增加有利于藍(lán)莓中花青素的溶出。繼續(xù)增加料液比，藍(lán)莓花青素的提取率并沒(méi)有繼續(xù)增加，可能與藍(lán)莓果為小漿果，本身含水率高，1∶6（g/mL）的料液比已經(jīng)使藍(lán)莓花青素的溶出基本達(dá)到飽和有關(guān)[19]。

2.1.4 浸提溫度對(duì)藍(lán)莓花青素提取率的影響

圖4 浸提溫度對(duì)花青素提取率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on the extraction efficiency of anthocyanins

由圖4可知，固定其他因素不變，溫度較低時(shí)，藍(lán)莓花青素的提取率隨著浸提溫度的升高而增大。當(dāng)浸提溫度為50 ℃時(shí)，提取率最大；繼續(xù)升高浸提溫度，藍(lán)莓花青素提取率反而下降，這可能與花青素的熱穩(wěn)定性較差有關(guān)[19-20]。

2.1.5 浸提液pH值對(duì)藍(lán)莓花青素提取率的影響

自然條件下，藍(lán)莓花青素為花青素糖苷類物質(zhì)，在酸性條件下穩(wěn)定并且呈色效果好[19]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，固定其他因素不變，當(dāng)浸提液pH值為1～3時(shí)，藍(lán)莓花青素提取率稍有提高（數(shù)據(jù)未顯示），但是，為了調(diào)整浸提液pH值小于3，勢(shì)必加入較多的酒石酸，100 mL 60%乙醇溶液調(diào)節(jié)pH值至2.5時(shí)，需加入酒石酸5～6 mL。因此，本研究采用浸提液pH值大于3的酸性條件進(jìn)行提取。從圖6可以看出，當(dāng)浸提液pH值為3～7時(shí)，藍(lán)莓花青素提取率隨著pH值的增大而降低。

圖5 浸提液pH值對(duì)提取率的影響Fig.5 Effect of solvent pH on the extraction efficiency of anthocyanins

2.1.6 浸提時(shí)間對(duì)藍(lán)莓花青素提取率的影響

圖6 浸提時(shí)間對(duì)提取率的影響Fig.6 Effect of extraction time on the extraction efficiency of anthocyanins

從圖6可見(jiàn)，固定其他因素不變，當(dāng)浸提時(shí)間在20～40 min時(shí)，藍(lán)莓花青素提取率隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)迅速提高；浸提時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)至150 min時(shí)，花青素提取率緩慢增大；繼續(xù)延長(zhǎng)浸提時(shí)間，花青素提取率稍有降低。這是因?yàn)?，隨著浸提時(shí)間的延長(zhǎng)藍(lán)莓花青素不斷地溶出，當(dāng)花青素溶解度接近飽和時(shí)，提取率緩慢增加；而花青素的穩(wěn)定性較差，繼續(xù)延長(zhǎng)浸提時(shí)間，提取率反而稍有下降。

2.2 二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)

2.2.1 二次正交旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)結(jié)果

五元二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)（1/2實(shí)施）的試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案及結(jié)果Table2 Scheme and results of orthogonal rotation combination design

續(xù)表2

2.2.2 回歸方程的建立與檢驗(yàn)

表3 方差分析Table3 Analysis of variance for the experimental results

采用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對(duì)表2中的結(jié)果進(jìn)行二次多項(xiàng)式逐步回歸分析，得到藍(lán)莓花青素提取效率（Y）和乙醇體積分?jǐn)?shù)（X1）、料液比（X2）、浸提溫度（X3）、浸提液pH值（X4）、浸提時(shí)間（X5）因子之間的回歸方程：

回歸方程的的失擬性檢驗(yàn)F1＝2.085＜F0.05（6,9）＝3.37及F0.01（6,9）＝5.80，F(xiàn)2＝23.704＞F0.05（20,15）＝2.33及F0.01（20,15）＝3.36（表3），說(shuō)明模型的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確，模型擬合結(jié)果好，可用于描述藍(lán)莓花青素提取率隨上述5個(gè)因素的變化趨勢(shì)。在α＝0.05顯著水平上剔除不顯著項(xiàng)后，簡(jiǎn)化的回歸方程：

2.2.3 主效應(yīng)分析

各因素的P值大小反映了各因素對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)的影響強(qiáng)度，P值越小，表明該因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響越大。由表3可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、浸提溫度、浸提時(shí)間對(duì)藍(lán)莓花青素提取率都有極顯著影響，而浸提液pH值有顯著影響。

2.2.4 單因素效應(yīng)分析

將得到的回歸方程（1）中的5個(gè)因素任意4個(gè)固定在零水平，得以下方程式：

圖7 各單因素水平值與花青素提取率的關(guān)系Fig.7 Relationship between each variable and the extraction efficiency of anthocyanidin

將5個(gè)因子的取值固定在－2、－1.5、－0.5、0、0.5、1.0、1.5、2水平，根據(jù)方程式（3）～（7），計(jì)算出各因子在8個(gè)不同水平上花青素提取效率（Y），結(jié)果見(jiàn)圖7。由圖7可知，當(dāng)各因子處于－2～2區(qū)間時(shí)，藍(lán)莓花青素提取率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比及浸提時(shí)間的增大先升高后趨于平穩(wěn)，而隨著浸提溫度和浸提液pH值的增大先增加后下降。這與前面單因素試驗(yàn)結(jié)果基本相符。

2.2.5 提取工藝參數(shù)的優(yōu)化

藍(lán)莓花青素提取率大于35 mg/g的572個(gè)方案中各變量取值的頻率分布分析見(jiàn)表4。由表4可知，藍(lán)莓花青素最佳提取工藝參數(shù)范圍為：乙醇體積分?jǐn)?shù)74.6%～76.2%，料液比1∶6.6～1∶6.8（g/mL），浸提溫度52.5～53.4 ℃，浸提液pH 3.0～3.1，浸提時(shí)間144.8～148.5 min。

表4 各變量取值頻率分布Table4 Probability distribution of each variable

2.2.6 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

從表4優(yōu)化的參數(shù)取值范圍內(nèi)隨機(jī)選擇3個(gè)組合進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)平均理論值為41.73 mg/g，平均實(shí)際值為42.08 mg/g，實(shí)際值與理論值基本吻合，且均在35 mg/g以上。由此可知，采用本實(shí)驗(yàn)的提取工藝參數(shù)，可獲得35 mg/g以上的藍(lán)莓花青素提取率。

2.3 藍(lán)莓花青素的免疫調(diào)節(jié)活性

藍(lán)莓花青素的免疫調(diào)節(jié)活性以其對(duì)小鼠脾細(xì)胞 增殖活性的大小以及其聯(lián)合ConA促進(jìn)脾細(xì)胞分泌IFN-α和IL-2的水平表征。由圖8可知，陽(yáng)性對(duì)照組和藍(lán)莓花青素樣品組的OD值均大于空白對(duì)照組；藍(lán)莓花青素質(zhì)量濃度為25 mg/mL時(shí)，與陽(yáng)性對(duì)照組相比較，差異不顯著（P＞0.05）；當(dāng)質(zhì)量濃度為50 mg/mL和100 mg/mL時(shí)，其OD值都極顯著高于空白對(duì)照組（P＜0.01），說(shuō)明藍(lán)莓花青素對(duì)脾淋巴細(xì)胞的增殖有促進(jìn)作用，且隨著花青素質(zhì)量濃度的增大和培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)。

圖8 藍(lán)莓花青素對(duì)小鼠 脾細(xì)胞增殖活性的影響Fig.8 Effects of blueberry anthocyanins on splenocyte proliferation in mice

TNF-α和IL-2是兩個(gè)重要的介導(dǎo)免疫反應(yīng)的細(xì)胞因子[21]。圖9和圖10的結(jié)果表明，培養(yǎng)1d，陽(yáng)性對(duì)照組和藍(lán)莓花青素樣品組的OD值與空白對(duì)照組無(wú)顯著差異（P＞0.05）；培養(yǎng)2 d后，OD值顯著高于空白對(duì)照組（P＜0.05）?？梢?jiàn)，本工藝提取獲得的藍(lán)莓花青素不僅促進(jìn)脾細(xì)胞增殖，同時(shí)能協(xié)同ConA刺激小鼠脾T淋巴細(xì)胞分泌TNF-α和IL-2炎癥因子。根據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范實(shí)施手冊(cè)》[22]評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，初步判定本工藝提取獲得的藍(lán)莓花青素，具有增強(qiáng)免疫力功能。

圖9 藍(lán)莓花青素對(duì)脾細(xì)胞分泌IFFNN--α含量的影響Fig.9 Effect of blueberry anthocyan on IFN-α production

圖10 藍(lán)莓花青素對(duì)脾細(xì)胞分泌IL-2含量的影響Fig.10 Effect of blueberry anthocyanins on IL-2 production

3 結(jié) 論

藍(lán)莓花青素最佳 提取工藝條件為酒石酸為酸化劑、乙醇體積分?jǐn)?shù)74.6%～76.2%、料液比1∶6.6～1∶6.8（g/mL）、浸提溫度52.5～53.4 ℃、浸提液pH 3.0～3.1、浸提時(shí)間144.8～148.5 min，此提取工藝參數(shù)范圍內(nèi)藍(lán)莓花青素的提取率均能高于35 mg/g。最佳工藝條件下提取的藍(lán)莓花青素仍具有促進(jìn)小鼠脾細(xì)胞增殖及協(xié)同ConA促進(jìn)小鼠脾細(xì)胞分泌TNF-α和IL-2活性。因此本研究為藍(lán)莓花青素的提取加工與產(chǎn)品研發(fā)提供了科學(xué)指導(dǎo)。

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Optimization of Extraction Process and Evaluation of Immunomodulatory Activity of Anthocyanins from Blueberry

PAN Li-hua1,2, WANG Jian-fei1, YE Xing-qian2, LUO Jian-ping1,*
(1. School of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China; 2. School of Biosystems Engineering and Food Science, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China)

A quadratic orthogonal rotary composite design was used to optimize the extraction of anthocyanins from blueberry with respect to five process parameters including ethanol concentration, material-to-liquid ratio, solvent pH, temperature and time, and the proliferative effect of the extracted anthocyanins on spleen cells as well as the synergistic effect when combined with ConA on promoting the secretion of interferon-a (IFN-α) and interleukin-2 (IL-2) in mouse spleen cells was evaluated by in vitro cultivation. The results showed that the extraction efficiency for blueberry was significantly affected by ethanol concentration, material-to-liquid ratio, temperature and time. The optimal extraction conditions were found to be 74.6%–76.2% ethanol as extraction solvent with a material-to-liquid ratio of 1:6.6–1:6.8 (g/mL) for 144.8–148.5 min of extraction at pH 3.0–3.1 and 52.5–53.4 ℃. Under these conditions, the yield of anthocyanidins extracted from blueberry was more than 35 mg/g. The blueberry anthocyanins could significantly promote the proliferation of spleen cells and cooperate with ConA to accelerate the production of TNF-α and IL-2 in normal mouse spleen cells in a dose-dependent way.

blueberry; anthocyanin; orthogonal rotation combination design; immunomodulatory activity

TS202.3

A

1002-6630（2014）02-0081-06

10.7506/spkx1002-6630-201402015

2013-04-28

安徽省2012年度科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（1201032075）

潘利華（1973—），女，副教授，博士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏。E-mail：panlihua@hfut.edu.cn

*通信作者：羅建平（1966—），男，教授，博士，研究方向?yàn)橹胁菟幣c功能食品化學(xué)。E-mail：jianpingluo@hfut.edu.cn